关键词： 骨髓间充质干细胞   牙周炎骨缺损   局部注射   再生修复   组织病理  

摘要： 研究背景牙周炎是牙周组织的感染性疾病，是成人牙缺失的主要原因。本课题组以往通过手术的方式将自体以及异体间充质干细胞与HA/TCP支架材料复合在小型猪上再生修复了牙周炎导致的牙周组织缺损。然而，手术的方式适用于严重的牙周炎，并且手术对病人也是一种创伤，限制了其应用。　　目的：采用大鼠建立牙周炎骨缺损模型，研究局部注射异体骨髓间充质干细胞治疗牙周炎骨缺损的再生修复效果。　　方法：以大鼠为研究对象，使其形成牙周炎动物模型，采用局部注射异体骨髓间充质干细胞，观察牙槽骨再生修复效果及周围微环境中炎症因子的变化。　　1.建立大鼠牙周炎骨缺损模型:大鼠上颌第一恒磨牙近远中局部采用绑缚钢丝以及涂布牙龈卟啉单胞菌(stain381)的方法建立大鼠牙周炎骨缺损模型。　　2.干细胞治疗牙周炎骨缺损:将15只大鼠随机分成3组，分别为(1)空白对照组:建立实验性牙周炎模型后不做任何处理;(2)注射盐水组:注射生理盐水。(3)注射细胞组:将3×106骨髓间充质干细胞与0.3ml生理盐水混合制成细胞混悬液，在牙龈近中、远中以及近远中中间位置分别注射0.1ml的混悬液。在治疗后的12周，处死动物，进行临床检查;影像学检查牙周骨丧失Periodontal bone loss(PBL)及骨丧失率Bone regenaration rate(BRR);组织病理检查观察牙槽骨再生修复效果;CBA法检测炎性因子TNF-α和IFN-γ的表达。　　结果：　　1.注射治疗12周后，大体观察及BRR测量结果显示，实验对照组牙槽骨吸收约至牙根分歧部分，细胞注射组牙槽骨有向冠方显著增长，平均骨组织高度比对照组增加0.4mm。注射NaCl组未见牙槽骨的再生。　　2.组织病理学显示:细胞注射组有牙槽骨、牙周膜、牙骨质的再生，而在空白对照组有典型的牙周炎的表现，包括深牙周袋，缺乏新骨形成，盐水注射组有深牙周袋以及未见新骨组织生长。　　***结果显示与盐水注射组相比，炎症因子TNF-α、IFN-γ在细胞注射组的表达显著下降。　　结论：　　牙周局部注射异体骨髓间充质干细胞可以再生修复牙周炎导致的骨缺损，并且能够减轻局部炎症反应。该研究为干细胞介导的牙周组织再生提供了一种简单，低创伤的治疗方式。

关键词： 不同途径   骨髓   充质干细胞   移植   肝硬化模型大鼠  

摘要： 一般来说,肝硬化在我国还是比较常见的,同时它的死亡率也是很高的所以在对肝硬化进行治疗这一领域有很大的发展空间.为了找到一个更好的治疗办法,学者们开始了大量的研究,最终发现骨髓干细胞移植的办法本文通过大鼠来进行实验还是有一定的证明作用的,同时骨髓移植的花费不高,操作的时候也不复杂,对人体的创伤也小,更重要的是其没有排外性骨髓间充质干细胞(MSCs)具有极强的自我复制能力和多项分化潜能,且低免疫源性,有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞.为了模拟临床中的干细胞移植治疗肝硬化的特征,我们建立了大鼠肝硬化模型,并培养大鼠骨髓MSCs,通过肝动脉、门静脉、外周静脉以及肝内注射等途径将骨髓MSCs移植到模型大鼠体内,移植后观察比较各组移植骨髓MSCs对肝硬化模型大鼠的疗效差别,并追踪移植干细胞在肝内的分布定植,探讨最佳干细胞移植途径,为临床应用干细胞治疗肝硬化提供一定的理论基础和有价值的实验参考数据.

关键词： 骨髓间充质干细胞   急性肝衰竭   移植   细胞因子  

摘要： 目的：(1)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行体外培养、鉴定。(2)对D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭(ALF)大鼠给予尾静脉、门静脉二种途径注射同种异体移植大鼠BMSCs,探讨BMSCs移植治疗ALF的可能性、对比两种移植途径的疗效。(3)通过测定各组血清及肝组织中细胞因子的表达,探讨BMSCs移植治疗ALF的机制、了解BMSCs在肝内归巢的影响因素、探讨BMSCs移植对ALF血清和肝组织中细胞因子表达及肝细胞凋亡的影响及机制,为临床开展BMSCs移植治疗ALF、为临床提供可靠的ALF预后评估系统、实时准确地评价ALF的免疫状态、病情及预后并指导临床治疗提供依据。方法：(1)采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,进行体外培养。采用DAPI标记BMSCs、细胞免疫荧光、流式细胞术进行BMSCs表型鉴定。(2)采用10%D-氨基半乳糖1-4g/kg/次、12小时一次和0.005%脂多糖20μg/kg,经腹腔注射制备大鼠ALF模型,观察造模后大鼠肝功能、肝组织病理损害程度。(3)通过尾静脉和门静脉注射的方式移植BMSCS。66只大鼠随机平均分为对照组、尾静脉移植、门静脉组。各途径组同种异体移植BMSCs,移植BMSCs数量为1.4×107个/kg,对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液样本和肝组织标本。检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),比较BMSCs移植前后各组肝功能的改善情况。(4)用HE染色观察肝脏的病理学变化。用TUNEL法检测肝细胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法测定各组血清及肝组织内CD163、IL-10的水平。用原位杂交、Western blot方法检测肝组织基质细胞衍化生长因子-1α (SDF-1α)蛋白的表达水平；用免疫荧光组织化学法、RT-PCR方法检测肝组织血管内皮生长因子VEGF蛋白的表达；采用免疫组化、Western blot方法检测肝组织Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平。结果：(1)原代培养的大鼠BMSCs传代后,高表达CD29和CD90,不表达CDllb和CD45。用DAPI进行BMSCs标记,荧光显微镜下观察可见所有BMSCs均已标上蓝色荧光。(2)采用了D-氨基半乳糖模型(D-Gal)/脂多糖(LPS)诱导的大鼠ALF模型。模型建立后,组织HE染色出现典型急性肝损伤表现,肝衰竭对照组大鼠血清ALT. AST水平和肝细胞凋亡较BMSCs移植组明显升高,且有时间依赖性,这些结果支持了建模成功。(3)ALF对照组大鼠血清ALT、AST水平随病程逐渐升高,在移植后120h、168h,尾静脉、门静脉组移植组血清ALT、AST水平与对照组的差别均有统计学意义(P<0.01),尾静脉与门静脉移植组之间血清ALT, AST水平的差别无统计学意义(P>0.05)。(4)BMSCs移植后168h,尾静脉与门静脉移植组大鼠肝组织均可见大量DAPI阳性标记的细胞,ALF模型对照组未见DAPIP日性标记的细胞。(5) BMSCs移植后120h、168h,尾静脉移植组、门静脉移植组的炎性细胞浸润明显减少,肝小叶结构逐渐恢复,汇管区可见胆管增生。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况的差别无统计学意义(P>0.05)。(6)在移植后120h、168h,与对照组相比BMSCs移植组肝细胞凋亡明显减轻(P<0.05)。BMSCs移植后120h尾静脉组、门静脉组细胞凋亡指数分别为22.00±16.84%、20.60±7.60%；移植后168h细胞凋亡指数分别为18.33±8.78%、12.67±8.78%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。尾静脉和门静脉植组之间肝细胞凋亡改善情况无统计学差异(P>0.05)。(7)原位杂交、免疫荧光、Western blot结果显示：BMSCs移植组中SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平随肝功能的好转逐渐逐渐升高,在移植后120h、168h与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。尾静脉和门静脉植组之间肝组织SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平无统计学差异(P>0.05)。相关分析发现肝组织中SDF-1α、VEGF两者表达水平呈正相关(P<0.05)。肝组织中SDF-1α、 VEGF蛋白的表达与肝细胞凋亡之间存在负相关,相关系数分别0.293、-0.274(P<0.05)。(8) ELISA及RT-PCR结果显示：ALF对照组大鼠血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随时间的延长、肝功能的恶化而升高。BMSCs移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随肝功能的好转逐渐降低,在移植后120h、

关键词： MSCs   RPE细胞   共培养   分化   视网膜色素变性   细胞移植  

摘要： 研究背景和目的： 视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞的变性、坏死和丢失可造成视网膜和脉络膜的损害，导致视网膜变性类疾病的发生和视力下降。目前尚无有效治疗RPE变性的方法。细胞移植是治疗RPE细胞变性的具有前景的方法，但是如何获得数量充足的、低免疫排斥和低成瘤风险的RPE细胞是目前细胞治疗RPE变性的所面临的主要问题。而在可用于视网膜变性疾病治疗的干细胞中，胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）因其全能分化特性（可分化为包括RPE在内的体内所有细胞类型）和无限增殖能力，被认为是可用于视网膜变性类疾病治疗的重要种子细胞。然而，ESCs来源的治疗细胞的免疫排斥和成瘤风险、以及不可控增殖、伦医学等问题限制了ESCs的临床转化。和ESCs相比，目前已在临床广泛应用的自体成体干细胞可避免免疫排斥和成瘤风险，且自体取材可规避伦理障碍。在本课题中，我们重点研究是否能将成体干细胞中的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）诱导分化为RPE样的细胞，并且具备天然RPE细胞的生理功能，并最终转化成为治疗视网膜变性类疾病的理想种子细胞。 方法： 1、hMSCs和猪RPE细胞的分离 （1）原代分离和纯化获得hMSCs和猪RPE细胞，观察细胞形态； （2）hMSCs和猪RPE细胞标记检测、hMSCs成骨诱导分化钙结节茜素红染色、成软骨诱导分化甲苯胺蓝染色和成脂肪诱导分化油红-0染色鉴定hMSCs；免疫荧光鉴定猪RPE细胞。 2、hMSCs和猪RPE的共培养及其向RPE细胞的分化 （1）Transwell共培养法诱导hMSCs向RPE细胞分化；条件培养基法诱导hMSCs向RPE细胞分化； （2）hMSCs来源RPE细胞的鉴定 细胞形态学观察、细胞内色素含量的定量分析、透射电镜检测、Real-time PCR、免疫荧光染色检测、吞噬实验和细胞断层扫描、Western Blot、验证MERTK蛋白在诱导细胞特异性吞噬功能中的作用和诱导细胞的神经营养因子分泌能力检测。 3、hMSCs来源RPE细胞对急、慢性视网膜变性的修复作用 （1）碘酸钠注射制备急性视网膜变性大鼠模型及鉴定：HE染色和F-ERG检测； （2）急性视网膜变性大鼠模型视网膜下腔移植分别于移植后4周、8周检测以下指标：细胞形态学观察、免疫荧光染色检测hESCs来源的RPE细胞、吞噬实验和细胞断层扫描、移植后免疫荧光染色检测、F-ERG和Western Blot。 （3）选取21天龄的RCS白化大鼠进行视网膜下腔移植，分别于移植后4周、8周检测以下指标：外核层厚度的测量、移植后细胞的免疫荧光染色检测、F-ERG和Western Blot检测细胞在体的吞噬能力。 结果： 1、hMSCs的鉴定 （1）hMSCs形态多为梭形成纤维细胞样外观，呈旋涡状排列；猪RPE细胞外形呈多边形，细胞内充满了棕黑色的色素颗粒； （2）hMSCs的表面标志CD73、CD90、CD105表达强阳性，而CD14、CD45、CD34阴性；茜素红染色后，细胞间出现致密的、圆形不透光团块状的红色结节；阿新蓝染色可见细胞外基质被染成蓝色，成条索状错综排列；油红-0染色细胞中含有被染成红色的脂肪颗粒；猪RPE细胞CRALBP、RPE65、ZO-1表达均为阳性。 2、hMSCs向RPE细胞的分化 （1）hMSCs共培养诱导后的RPE样细胞可观察到hMSCs中出现丰富的色素颗粒，含量接近于成体猪的RPE细胞，而采用条件培养基诱导法获得细胞色素含量较少； （2）共培养hMSCs-RPE细胞的色素含量与RPE细胞相比无统计学差异，条件培养基诱导hMSCs-RPE细胞内色素颗粒含量与共培养hMSCs-RPE细胞的色素含量相比具有统计学差异； （3）透射电镜观察见hMSCs-RPE细胞内可见成熟的色素颗粒，细胞顶端可见典型的微绒毛结构； （4）hMSCs-RPE细胞表达RPE细胞特异的基因MITF、OTX2、tyrosinase、RPE65、Bestrophine、PEDF、PMEL17、CRALBP、PAX6和诱导前相比都显著上调，且和原代分离的人RPE细胞的表达水平相类似； （5）hMSCs-RPE细胞可表达RPE细胞特异的蛋白CRALBP、RPE65和ZO-1； （6）FITC标记的POS和hMSCs-RPE细胞共孵育后，猪RPE细胞和诱导细胞内均可观察到绿色荧光，而未诱导的hMSCs内未见到绿色荧光；hMSCs-RPE细胞MERTK蛋白表达显著上调，α

关键词： 间质干细胞   结肠炎,溃疡性   Treg   Th17  

摘要： 目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在溃疡性结肠炎(UC)大鼠发病中的作用,并分析可能与调节Treg及Th17细胞有关。方法用三硝基苯磺酸(TNBS)诱导建立UC大鼠模型,体外培养扩增雄性SD大鼠MSCs,建立空白对照组,未作任何处理;模型组,仅用TNBS灌肠(3ml/kg);MSCsⅠ组,MSCsⅡ组和MSCsⅢ组分别用TNBS(3ml/kg),3d后,MSCsⅠ组给予尾静脉注射低剂量MSCs(1×105),MSCsⅡ组给予尾静脉注射中剂量MSCs(1×106),MSCsⅢ组给予尾静脉注射高剂量MSCs(1×107)。计算各组大鼠的疾病活动指数(DAI)、大体形态评分(GMS)和结肠组织学病理评分(HDS),并通过免疫组化、流式细胞术观察MSCs对UC大鼠Treg/Th17的影响。结果 DAI、GMS和HDS在模型组中高于空白对照组,Treg细胞在UC大鼠模型中表达下调,Th17细胞在模型组中表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,MSCs治疗组DAI、GMS和HDS降低,且MSCsⅡ组低于MSCsⅠ组与MSCsⅢ组,结肠组织与外周血Treg细胞表达上调,MSCsⅡ组高于MSCsⅠ组与MSCsⅢ组,差异有统计学意义(F=9.25,641.00,P<0.05);Th17细胞表达下降,MSCsⅡ组低于MSCsⅠ组与MSCsⅢ组,差异有统计学意义(F=15.95,318.80,P<0.05)。结论 MSCs通过对UC大鼠Treg、Th17的影响,对UC大鼠起到治疗作用。

关键词： 慢性移植肾肾病   骨髓间充质干细胞   肾功能   损伤机制   肾间质纤维化  

摘要： 目的：　　通过对慢性移植肾肾病(CAN)患者输注骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),观察输注的安全性与可行性,以及输注后移植肾功能和移植肾间质纤维化等指标的变化,探讨BM-MSCs对慢性移植肾肾病患者移植肾功能的影响以及修复移植肾损伤的机制。　　方法：　　选择2011年3月至2013年1月间确诊慢性移植肾损伤,且符合入组标准的患者11例,制备第三方骨髓间充质干细胞,分三次输注,输注时间为0天,7天和1月。首次在DSA引导下经移植肾动脉输注,细胞量为5.0×106个,第2、3次为经外周静脉输注,细胞量为1.0×106个/kg/次。观察治疗后患者Cr、Bun、CysC、Ccr、24小时尿蛋白、血/尿β2微球蛋白的变化情况,在治疗前和治疗后6月行移植肾穿刺活检,应用JD图像分析系统检测肾间质纤维化指标(LN、FN、TGF-β1、CTGF)的变化。　　结果：　　11名患者中,除了1例在第一次输注BM-MSCs后3天出现肺部感染症状、1例在第二次输注过程中出现过敏反应外,未发生出血、移植肾动脉栓塞、假性动脉瘤等BM-MSCs输注相关的并发症,且肺部感染发生率与未接受BM-MSCs治疗者发生率无显著差异。移植肾功能指标:Cr、Bun、CysC在治疗前为205.55±45.84umol/L,14.96±8.22mmol/L,2.44±0.58mg/L,治疗后1周、1月分别为:188.09±49.68umol/L、12.00±4.70mmol/L、2.33±0.53mg/L和182.64±50.89umol/L、12.13±5.01mmol/L、2.29±0.56mg/L,与治疗前相比有下降,其差异具有统计学意义,P<0.05;治疗3月后,其差异无统计学意义。Ccr在治疗前为38.05±14.32ml/min,治疗后7天、1月分别为42.59±18.05ml/min、43.02±15.28ml/min,较治疗前升高,其差异具有统计学意义,P<0.05;而治疗3月后,其差异无统计学意义。治疗7天时24小时尿蛋白定量为630.67±668.26mg,与治疗前883.33±853.57mg相比,其差异具有统计学意义,而治疗1月后差异无统计学意义。肾间质纤维化治疗FN、LN在治疗6月后的平均光密度值为(0.210±0.076,0.223±0.074)与治疗前(0.227±0.049,0.236±0.038)相比有下降,但差异无统计学意义,P>0.05;TGF-β1和CTGF在治疗6月后的平均光密度值为(0.196±0.064,0.204±0.070)与治疗前(0.247±0.052,0.242±0.044)相比有下降,且差异具有统计学意义,P<0.05。　　结论：　　慢性移植肾肾病患者在接受BM-MSCs治疗后,血肌酐、尿素氮、胱抑素C在1月内均有下降;内生肌酐清除率在治疗1月内较治疗前升高;24小时尿蛋白定量在7天内有所减少,移植肾纤维化指标TGF-β1与CTGF在治疗6月后较治疗前减少。

关键词： 骨髓间充质干细胞   大鼠   细胞体外培养   血管性痴呆   动物模型   SD大鼠   Morris水迷宫   干细胞   血管性痴呆   甘露醇   突触素   CA3  

摘要： 第一章大鼠BMSCs体外分离、培养、鉴定和标记 [目的]探索SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)体外分离、培养、鉴定及标记的方法。为下一步的移植研究提供充足的BMSCs。 [方法]应用全骨髓贴壁改良法分离培养SD大鼠BMSCs,显微镜观察细胞形态,绘制细胞生长曲线。使用流式细胞仪检测细胞表面标记物及茜素红成骨诱导染色对第三代细胞进行鉴定。并对第3代细胞进行BrdU标记。 [结果]体外培养的原代BMSCs生长旺盛,以梭形为主,细胞集落呈螺旋状。第3代BMSCs几乎均一表达CD29,CD90,而CD34,CD45几乎不表达。BMSCs经诱导能分化为成骨细胞,茜素红染色出现红色钙化结节。BrdU免疫组化结果显示,BMSCs标记率高达85.29%。 [结论]改良的全骨髓贴壁法体外分离、培养及传代的SD大鼠BMSCs纯度高,活力强,性状稳定。BrdU标记法安全、高效。 第二章血管性痴呆大鼠模型的制备 [目的]探讨VD大鼠模型理想的制备方法,为下一步BMSCs移植研究提供VD大鼠模型。 [方法]采用间隔3天永久性结扎双侧颈总动脉法制备VD大鼠模型。假手术组不结扎双侧颈总动脉,其余手术操作步骤相同。术后4周,采用Morris水迷宫试验测定模型大鼠的行为学表现。 [结果]假手术组术后因饲养不当死亡1只,余9只。模型组大鼠存活59只,死亡18只,1只出现眼球变白、萎缩,3只未达VD标准。本实验成功制备55只VD大鼠。模型组大鼠造模后水迷宫的逃避潜伏期较假手术组明显延长,平台象限滞留时间比假手术组明显缩短(p<0.05)。模型组大鼠的存活率为76.62%,成模率为93.22%。 [结论]改良双血管法具有死亡率低,成模率高,简单易行等优点,是制备VD大鼠模型的理想方法。 第三章甘露醇对骨髓间充质干细胞静脉移植治疗血管性痴呆大鼠模型的疗效观察 [目的]探讨甘露醇预处理对骨髓间充质干细胞移植治疗VD大鼠模型疗效及海马CA3区突触素表达水平的影响。 [方法]造模4周后将VD大鼠随机分为空白对照组、培养基组、甘露醇组、BMSCs组、甘露醇预处理BMSCs组,分别给予相应的实验干预措施。观察干预4周后实验大鼠的行为学表现及应用免疫组化法检测海马CA3区突触素的表达水平。 [结果]甘露醇预处理BMSCs组行为学较BMSCs组、培养基组、甘露醇组、空白对照组有明显改善(P<0.05),其逃避潜伏期缩短(P<0.05),平台象限滞留时间延长(40.75±6.29s,P<0.05),其海马CA3区突触素表达水平(39624±7797)亦比BMSCs组、培养基组、甘露醇组、空白对照组明显提高(27060±4667,19955±4243、18293±6445,18946±4953,P<0.05)。 [结论]甘露醇预处理后静脉移植BMSCs显著改善VD大鼠行为学表现,并使其海马CA3区突触素表达显著增加。甘露醇预处理明显提高静脉移植BMSCs治疗VD大鼠的效果。

关键词： 自身免疫性   重症肌无力   骨髓间充质干细胞治疗   神经细胞分化   烯醇化酶   免疫细胞化学  

摘要： 目的:　　 1、建立Lewis大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养及鉴定的方法，探讨β-巯基乙醇定向诱导其向神经样细胞分化的可行性，并观察神经元特异性烯醇化酶NSE、胶质纤维酸性蛋白酶GFAP的表达。　　 2、腹腔输注mAb35以探讨建立实验性自身免疫性重症肌无力(EAMGExperimental autoimmune myasthenia gravis)的方法。　　 3、探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)的治疗作用及TSG-6（tumor necrosis factor alpha-stimulated gene-6）、MMP-9在其作用中发挥的可能机制，为其应用于临床治疗提供一定的理论依据及实验基础。　　 方法:　　 1、BMSCs用全骨髓培养法分离培养获得，观察所培养的细胞形态，通过流式检测细胞表面的CD90、CD29、CD45等标志抗原的表达率，然后用化学诱导剂β-ME定向诱导干细胞向神经元样细胞分化，对诱导后的细胞行免疫细胞化学和WB检测，观察细胞表面NSE及GFAP的表达情况，与未诱导细胞进行对比。　　 2、本实验建立EAMG动物模型的方法选用的是腹腔输注mAb35，其是一种AChR特异性单克隆抗体，动物成功建模后应用HE染色法观察两组大鼠腓肠肌冰冻切片中炎性细胞的浸润情况，并且应用免疫荧光技术观察大鼠肌肉切片中的AChR数量的改变情况，并分别收集两组大鼠的血清，采用间接ELISA方法检测两组大鼠血清中AChR-Ab含量。　　 3、选取清洁级环境下饲养的Lewis雌性大鼠30只，将其分为BMSCs移植组(n=10)、EAMG模型对照组(n=10)和正常对照组(n=10)。移植组和模型对照组腹腔注射mAb35建立EAMG模型。分离培养Lewis大鼠的BMSCs进行鉴定后，调整密度至1.5×106/600μL PBS，移植组尾静脉注射细胞悬液600μL，模型对照组和正常对照组同期给予600μL PBS。对3组动物进行Lennon临床评分，实验结束时ELISA法检测血清中AChR-Ab含量，免疫荧光技术观察腓肠肌AChR数量的变化，应用real time RT-PCR研究腓肠肌AChRα、MMP-9 mRNA的表达。体外用10ng/ml TNF-α培养BMSCs24h后用ELISA检测细胞上清TSG-6，并用realtime PCR检测细胞内TSG-6 mRNA表达的改变。　　 结果:　　 1、倒置相差显微镜下的BMSCs形态以长梭形为主，流式细胞仪结果示细胞表面标记物CD90、CD29、CD45的表达率分别为99.04％、98.53％、0.01％;化学诱导剂β巯基乙醇诱导后的细胞其细胞形态发生了相应的变化，原本呈长梭形的细胞胞体收缩成球形或者不规则形状，显微镜下所见细胞的折光性较前有明显增强，较多的长突起出现在细胞胞体上，显微镜下这些突起类似于神经元样细胞的树突和轴突;免疫细胞化学染色示NSE阳性表达率为57.6％±8.2％，而GFAP表达为阴性;WB结果示诱导后细胞NSE表达量增加。　　 2、实验通过腹腔被动输注mAb35上清成功建立了EAMG大鼠动物模型，该方法的成模率为100％，光镜下发现PTMG组肌肉冰冻切片中炎性细胞浸润增多，荧光显微镜下可见PTMG组肌肉切片中AChR表达量明显下调，ELISA法检测结果示PTMG组血清中的AChR-Ab含量明显高于健康对照组。　　 3、移植组Lennon评分、AChR-Ab含量、AChR mRNA表达均低于模型对照组(P＜0.05);免疫荧光检测示模型对照组未见红色荧光，移植组大鼠可见断断续续较为微弱的荧光;TNF-α处理的BMSCs分泌的TSG-6含量明显增高(P＜0.01)，TSG-6 mRNA表达量也增高(P＜0.05);模型对照组MMP-9表达提高（vs正常对照组P＜0.05）;而移植组vs正常对照组差异无统计学意义。　　 结论:　　 1、全骨髓培养法可以获得稳定且高纯度的BMSCs;β-巯基乙醇能够在体外定向诱导培养的BMSCs向神经元样细胞分化。　　 2、mAb35可成功建立EAMG Lewis大鼠模型。　　 3、尾静脉输注BMSCs可以改善EAMG模型的临床表现，BMSCs可能通过分泌TSG-6并通过抑制删P-9发挥作用。

关键词： 骨髓干细胞   脊髓损伤   疗效  

摘要： 目的 观察自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植治疗脊髓损伤的疗效及安全性.方法 选取本院在2011年8月～ 2012年7月间收治的50例脊髓损伤患者,将50例患者分为观察组与对照组,每组25例.对照组采用综合康复治疗,观察组在采用综合康复治疗的同时,再采用自体骨髓间充质干细胞移植治疗.并在治疗后的3个月对两组的患者的运动能力、感觉能力、日常生活能力以及膀胱功能能力进行对比.结果观察组患者的运能能力、感觉能力、日常生活能力以及膀胱功能能力相较于对照组明显改善,P＜0.05;观察组出现7例低热、2例头痛、1例腹胀、1例肢体麻木的不良反应,对照组出现了12例低热、12例头痛、12例腹胀、7例肢体麻木的不良反应,两组对比差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 在针对脊髓损伤时采用自体骨髓间充质干细胞移植治疗,疗效安全有效,值得在临床推广.

关键词： 骨髓间充质干细胞   右心室肥厚   肺血管肌化   野百合碱   肺动脉高压   钙信号   GAPDH   增殖   迁移   组胺   过氧化氢   GAPDH   肺动脉高压  

摘要： 肺动脉高压(PAH)是一种严重且致命的疾病。其特点是肺动脉压升高和肺的病理改变,如内皮损伤,肺血管平滑肌细胞增殖和迁移所导致的肺血管腔减小,以及最终伴发的右心室肥厚和终末期心脏衰竭。但是肺动脉高压至今缺乏高效特异性的治疗方法,尽管常规疗法有显著进步,预后却仍然不理想。近年来干细胞被成功应用于多种疾病的治疗。由于它所具有的,相比一般药物治疗更高的安全有效性,干细胞治疗已成为疾病治疗策略的研究热点,并被运用于对肺动脉高压的治疗研究中。 最近在脂肪分化、关节损伤等疾病模型中发现干细胞治疗的疗效存在性别差异。而对于干细胞治疗肺动脉高压效果的性别差异和其潜在的机制却未有研究。本研究在探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗肺动脉高压性别差异的实验中,发现雌性BMSCs无论以性别匹配或不匹配方式治疗野百合碱(MCT)诱导的小鼠肺动脉高压均比雄性BMSCs有更好的治疗效果,表现为右心室肥厚和肺阻力血管肌化程度有更大幅度的降低。体外实验中在炎症、氧化应激状态下,BMSCs的[Ca2+]i动力学、增殖和迁移能力均有显著的性别差异。 出乎意料的是,我们发现雌性BMSCs的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白水平比雄性BMSCs高得多。GAPDH最近已被证明是一种多功能蛋白质,具有不同的功能。我们通过分子生物学技术敲除雌性BMSCs的GAPDH或在雄性BMSCs过表达GAPDH,均能逆转上述细胞生物学行为和治疗效果的差异。综上,我们的实验结果表明GAPDH在雌性BMSCs通过调节细胞内[Ca2+]i信号及相关的细胞行为,从而在治疗肺动脉高压过程中发挥比雄性BMSCs更加优越的治疗作用。 第一部分骨髓间充质干细胞性别对小鼠肺动脉高压疗效的影响 目的： 干细胞引入体内后,为特异性示踪其定位与变化,现多采用将雄性干细胞引入雌性动物体内,藉由Y染色体来特异示踪,因此不可避免地忽视了干细胞性别差异对治疗效果的影响。本实验利用分离自同胎生雌性和雄性小鼠的不同性别骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察干细胞性别差异对肺动脉高压治疗效果的影响。 方法： 本实验采用8周龄体重在22g左右的C57小鼠,尾静脉注射60mg/kg的野百合碱MCT诱导肺动脉高压模型,在MCT注射三天后分组静脉给予2×106个不同性别BMSCs治疗,28天后以右心肥厚指数RV/(LV+S)(右心室／(左心室+间隔))和肺组织病理切片所显示的肺血管肌化程度(1muscularization)为指标,评估治疗效果。 结果： (1)光学显微镜下可见单个BMSC呈梭形多角形,细胞融合后呈铺路石样；流式鉴定细胞表面标志：CD29-PE+(99.96%±0.03%); CD34-PE-(0.34%±0.13%); CD45-APC-Cy7(1.97%±0.38%)。 (2)在对MCT诱导的肺动脉高压治疗中,雌性小鼠右心肥厚指数造模后明显增加(0.278±0.009vs0.357±0.019,p<0.05),雌性BMSCs降低右心肥厚指数的作用表现出明显优于雄性BMSCs的作用(0.275±0.026vs0.311±0.022,p<0.05)；且在雄性小鼠,雌性BMSCs也同样表现出明显优于雄性BMSCs的作用(0.2835±0.028vVs0.326±0.045,p<0.05)。 (3)在对MCT诱导的肺动脉高压治疗中,雌性小鼠肺动脉肌化(muscularization)造模后明显增加(38.3%±2.9%vs82.3%±7.8%,p<0.05),但是雌性BMSCs降低肺动脉肌化的作用明显优于雄性BMSCs的作用(41.7%±5.8%vs55.3%±5.0%,p<0.05)；且在雄性小鼠,雌性BMSCs也同样表现出明显优于雄性BMSCs的作用(40.0%±4.8%vs54.0%±6.9%,p<0.05)。 结论： 在MCT诱导的小鼠肺动脉高压模型中,雌、雄BMSCs均可以有效减缓模型小鼠右心室肥厚和肺动脉肌化程度,从而起到有效治疗肺动脉高压的作用,而雌性BMSCs则表现出更优于雄性BMSCs的治疗效果。 第二部分离体实验研究骨髓间充质干细胞性别差异的生物机制 目的： 骨髓间充质干细胞(BMSCs)在被引入发生肺动脉高压的人和动物体内后必然置身于不同的病理内环境,比较常见的包括氧化应激、炎症反应等等。BMSCs要发挥其修复内皮和治疗肺动脉高压的作用,必须能够适应这些微环境。观察并比较在氧化应激、炎症反应时雌、雄BMSCs生物学行为包括钙信号、增殖和迁移能力、connexin43表达等方面的差异,以期阐明BMSCs在肺动脉高压治疗中表现出来的性别差异的机制。 方法：