关键词： 二膦酸盐相关颌骨骨坏死   小型猪   动物模型   骨髓间充质干细胞   细胞移植  

摘要： 二膦酸盐(Bisphosphonates，Bps)是一类焦磷酸的类似物，临床上广泛应用于骨相关疾病，包括骨质疏松、佩吉特病以及恶性肿瘤的骨转移。但随着二膦酸盐的广泛使用，越来越多的文献提示，二膦酸盐治疗可以引起颌骨骨坏死(Bisphophonates-RelatedOsteonecrosisoftheJaws,BRONJ)。尽管学者们对BRONJ进行了大量的临床及基础研究，但其发病机制仍不明确，也缺乏行之有效的临床治疗方法。本研究首先在大型动物-小型猪上建立二膦酸盐相关颌骨骨坏死动物模型，观察其生理病理变化，探讨可能的发病机理，然后利用异基因骨髓间充质干细胞(AllogeneicBoneMarrowMesenchymalStemCell,BMMSCs)移植治疗BRONJ，尝试为临床提供有效的治疗方法。 第一部分小型猪二膦酸盐相关颌骨骨坏死动物模型的建立 研究目的： 建立小型猪二膦酸盐相关颌骨骨坏死的动物模型，为进一步研究BRONJ的发病机理及探讨有效的临床治疗方法奠定基础。研究方法： 8只小型猪接受静脉滴注唑来膦酸盐(择泰)，每两周一次，每次4mg，共滴注10次。在用药后拔除下颌第一前磨牙。通过定期的临床局部观察，CT检查及组织病理学方法诊断下颌BRONJ的发生。研究结果： 拔牙后4周，临床检查发现用药动物拔牙窝未愈合，拔牙后8周，实验动物口内可见死骨暴露，并且持续到接受治疗后。CT及组织病理学均证实了骨坏死的发生。结论： 静脉滴注唑来膦酸盐+拔牙可以诱导小型猪发生BRONJ，建立的动物模型是有效可靠的，可用于BRONJ的发病机理及治疗的进一步研究。 第二部分BRONJ小型猪的骨髓间充质干细胞功能及免疫功能受到影响 研究目的： 研究二膦酸盐对小型猪骨髓间充质干细胞功能及免疫功能的影响，以期探讨BRONJ的发病机理。 研究方法： 分离并培养使用唑来膦酸盐的小型猪骨髓间充质干细胞，研究其增殖、凋亡、免疫调节及多向分化能力。采取使用唑来膦酸盐小型猪的静脉血，流式细胞仪检测其CD4CD25T细胞及γδT细胞水平，Q-PCR检测Foxp3及IL-17的表达。 研究结果： 仅部分使用二膦酸盐的小型猪可以成功分离和培养出骨髓间充质干细胞，其增殖能力明显降低，免疫调节能力受到抑制，且成脂、成骨能力均低于对照动物。 二膦酸盐处理的小型猪外周血的CD4CD25T细胞及Foxp3mRNA水平均明显下降，而γδT细胞和IL-17水平均升高。 结论： 二膦酸盐对小型猪骨髓间充质干细胞的生理及免疫调节功能均造成影响，且抑制小型猪外周血中的调节性T细胞，升高IL-17。对BMMSCs及免疫功能的影响可能在BRONJ的发病中起到作用。 第三部分异基因骨髓间充质干细胞对小型猪BRONJ的治疗研究 研究目的： 探讨异基因骨髓间充质干细胞移植对小型猪BRONJ的治疗作用，探讨对BRONJ新的有效治疗方法。 研究方法： 小型猪口腔死骨暴露后8周，将动物分为两组，一组给予静脉输入异体骨髓间充质干细胞，一组输入生理盐水作为对照。通过定期临床观察，CT及组织病理学检查评价BMMSCs对BRONJ的疗效，同时观察BMMSCs治疗对受抑制的小型猪免疫功能的作用。 研究结果： 在经BMMSCs治疗后，原开放的牙槽窝得到封闭，软组织完全愈合。CT检查显示骨破坏得到愈合。组织病理学检查发现在原骨坏死区有新骨形成。 BRONJ小型猪外周血的CD4CD25T细胞及Foxp3mRNA水平在BMMSCs治疗后均有升高，而γδT细胞和IL-17水有所下降。而且ALP及TRAP水平在BMMSCs治疗12月后升高，而IL-6和IFN-γ水平下降。 结论： 异基因骨髓间充质干细胞移植可以临床治愈小型猪的二膦酸盐相关颌骨骨坏死，可能为临床治疗BRONJ提供新的有效的治疗方法。

关键词： 利拉鲁肽   胰升糖素样肽1   骨髓间充质干细胞   胰岛样细胞   1型糖尿病   免疫调节   移植  

摘要： 目的： 1、采用密度梯度离心联合差壁培养法，建立一种较理想的大鼠骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs）体外培养扩增体系。 2、在体外研究探讨利拉鲁肽（Liraglutide，LIRA）对BM-MSCs定向诱导分化的作用，并比较其与胰升糖素样肽1（Glucagon-like Peptide-1，GLP-1）的诱导效果差异。 3、观察利拉鲁肽联合骨髓间充质干细胞（LIRA+BM-MSCs）移植对链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病（Type1Diabetes Mellitus，T1DM）大鼠胃肠道激素水平和胰岛β及α细胞功能的影响。 方法： 1、依据骨髓细胞比重的差异性，利用大鼠淋巴细胞分离液初步分离骨髓单个核细胞，再根据其差壁生长特性，通过定期换液的方式对其中单个核细胞进一步纯化，最后以流式细胞仪测定分离后P3代细胞间充质干细胞表面标志CD29、CD90、CD73和CD105，造血干细胞表面标志CD34以及白细胞表面标志CD45，并在特定培养基下观察其向成骨以及成脂细胞分化的能力。 2、在高糖、低糖加尼克酰胺的两阶段诱导基础上，以GLP-1为对照，荧光定量PCR检测巢蛋白（Nestin）、胰十二指肠同源盒1（PDX-1）、葡萄糖激酶（GK）、葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）、胰岛素（Ins）和胰高血糖素（GLu）等基因的水平，细胞免疫荧光测定胞浆Ins和GLu蛋白的表达，观察10nmol/L利拉鲁肽继续诱导7天对BM-MSCs向胰岛样细胞分化的作用。 3、以60mg/kg剂量腹腔注射STZ制备T1DM大鼠模型，造模成功后随机分为1型糖尿病模型对照组（T1DM组，n=10）、骨髓间充质干细胞治疗组（T1DM+BM-MSCs组，n=10）、利拉鲁肽治疗组（T1DM+LIRA组，n=10）、利拉鲁肽联合骨髓间充质干细胞治疗组（T1DM+LIRA+BM-MSCs组，n=10）四组。定期监测各组大鼠随机血糖水平以及一般情况变化；8周末，测定各组大鼠糖化血红蛋白（HbA1c）、24h尿量以及24h尿蛋白水平；采用ELISA法检测血清胰岛素、C肽、胰高血糖素、胃泌素、胆囊收缩素和胰升糖素样肽1等胃肠道激素的浓度；免疫组织化学染色检查胰腺组织胰岛素和胰高血糖素的表达。 结果： 1、显微镜下见分离的BM-MSCs形态均一、呈长梭形；流式细胞仪检测提示：分离的BM-MSCs高表达间充质干细胞表面标志CD29、CD90、CD73和CD105，而不表达造血干细胞表面标志CD34和白细胞表面标志CD45；BM-MSCs成骨及成脂诱导分化能力检测阳性。 2、添加利拉鲁肽或GLP-1诱导后BM-MSCs进一步呈聚集性生长，DTZ染色阳性；荧光定量PCR检测提示：与高糖加尼克酰胺诱导组比较，利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组Nestin的mRNA含量明显减少（P<0.01），PDX-1、GK、GLUT-2、Ins以及GLu的含量均升高（P<0.05），利拉鲁肽诱导组与GLP-1诱导组比较，各基因含量均无明显差异（P＞0.05）；细胞免疫荧光检测提示：未诱导组和高糖加尼克酰胺诱导组BM-MSCs胞浆Ins或Glu蛋白表达阴性，利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组BM-MSCs胞浆Ins和Glu蛋白均表达阳性。 3、一般指标：与T1DM组比较，T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三组大鼠随机血糖、HbA1c、24h尿量以及24h尿蛋白量均明显降低（P＜0.01），其中各指标水平均以T1DM+LIRA+BM-MSCs组最低（P＜0.05）。 胃肠道激素：与T1DM组比较，T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三组血清胰岛素、C肽、胃泌素以及胆囊收缩素的水平均明显升高(P＜0.05)；T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs两组胰升糖素样肽1的水平明显升高（P＜0.05），胰高血糖素的水平明显降低(P＜0.05)，T1DM+BM-MSCs组胰升糖素样肽1和胰高血糖素的水平与T1DM组比较无差异（P＞0.05）。与T1DM+BM-MSCs组比较，T1DM+LIRA组胰升糖素样肽1的水平升高（P＜0.05），胰高血糖素的水平降低（P＜0.05），胰岛素、C肽、胃泌素以及胆囊收缩素的水平无明显差异（P＞0.05）；T1DM+LIRA+BM-MSCs组胰高血糖素的水平降低（P＜0.05），胰岛素、C肽、胃泌素、胆囊收缩素以及胰升糖素样肽1的水平均明显升高（P＜0.05）。与T1DM+LIRA组比较，T1DM+LIRA+BM-MSCs组胰岛素、C肽

关键词： 骨髓间充质干细胞   大脑中动脉栓塞   尾静脉移植   SD大鼠  

摘要： 目的：探讨经尾静脉移植骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)对治疗脑缺血再灌注损伤大鼠的有效性及安全性,并探讨其可能的机制。 方法：1.取SD大鼠长骨骨髓作为供体来源,经密度梯度离心法和组织贴壁筛选法进行体外培养并纯化BMSCs,经细胞形态、表面标记物等特性鉴定证实获得的细胞为BMSC。移植前以10mg/L的BrdU进行标记；2.线栓法制作SD雄性大鼠MCAO模型,TTC染色鉴定MCAO模型；3.根据Zea Longa神经功能缺损评分将符合标准的62只脑缺血MCAO大鼠随机分为3组：①A组：在模型建立后7d,通过尾静脉将3×10*6个BMSCs移植入大鼠体内②B组：在模型建立后7d,通过尾静脉将1×10*6个BMSCs移植入大鼠体内③C组不作处理。4.①改良神经损伤严重程度评分(modified neurological severity scores, mNSS):于大鼠移植前、移植后第3、7、14、21、28d进行mNSS评分评估神经功能恢复情况。②Morris水迷宫训练及测试：于移植后第14、28d测试大鼠学习和记忆能力。5.移植后第7、14、30天处死大鼠,取大鼠脑组织行免疫组织化学染色观察CDllb、MPO阳性细胞；BrdU单染标记移植的BMSCs;单染标记的脑源性神经营养因子(BDNF); Brdu和MAP-2双染标记BMSCs分化的神经元样细胞；Brdu和GFAP双染标记BMSCs分化的神经胶质样细胞；BrdU和vWF双染标记增殖的血管内皮细胞；Brdu和VEGF双染标记BMSCs分泌的促血管增生因子。 结果：1.经密度梯度离心法和组织贴壁筛选法进行体外培养并纯化BMSCs,培养第3代的MSCs经流式细胞仪检测,表达CD90、CD71阳性率为99.74%、98.93%,表达CD45、CD34、CD14阳性率为0.36%、0.32%、0.45%,说明这一细胞群大部分处于未分化干细胞状态,并具有对塑料底物的贴附特性,符合BMSCs的特点,说明是分离培养纯度较高的BMSCs; 2.用改良线栓法制作MCAO模型后,大鼠神经功能缺损明显；结合TTC染色检测缺血侧的脑实质呈苍白色,证实造模成功。 ***模型后经尾静脉移植BMSCs, A组和C组比较,行为学恢复更为明显,(P<0.01)； A组和B组比较, A组行为学恢复更为明显(P<0.01)； B、C两组相比mNSS评分无显著性差异(P>0.05)；A组大鼠逃避潜伏期(24.53±19.093s)较C组(35.64±33.901s)缩短(P<0.05),A组跨越平台次数(4.60±1.506),较C组大鼠(2.44±0.882)明显增多(P<0.05)。 4.A、B组大鼠在损伤侧大脑半球的损伤中心区、脉络丛、脑室管膜周围及血管周围处,可见Brdu单染阳性细胞及Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、 Brdu+VEGF免疫组织化学双染阳性细胞。 结论：***可以在体外分离、传代、扩增；2.采用改良线栓法制作MACO模型简单易行,结果可靠,可以用于局灶型脑缺血再灌注损伤的研究；***移植入MCAO大鼠体内后,可在大鼠体内存活、分化,可以促进大鼠脑梗死后神经功能恢复,这可能与移植细胞促进梗死周边血管新生以及分泌神经营养因子等因素有关；***的疗效与数量有关,3×10*6有较好的疗效；5.移植治疗BMSCs是安全的,整个实验过程中未发现明显免疫排斥反应及肿瘤形成。

关键词： 骨髓间充质干细胞   牙周炎骨缺损   局部注射   再生修复   组织病理  

摘要： 研究背景牙周炎是牙周组织的感染性疾病，是成人牙缺失的主要原因。本课题组以往通过手术的方式将自体以及异体间充质干细胞与HA/TCP支架材料复合在小型猪上再生修复了牙周炎导致的牙周组织缺损。然而，手术的方式适用于严重的牙周炎，并且手术对病人也是一种创伤，限制了其应用。　　目的：采用大鼠建立牙周炎骨缺损模型，研究局部注射异体骨髓间充质干细胞治疗牙周炎骨缺损的再生修复效果。　　方法：以大鼠为研究对象，使其形成牙周炎动物模型，采用局部注射异体骨髓间充质干细胞，观察牙槽骨再生修复效果及周围微环境中炎症因子的变化。　　1.建立大鼠牙周炎骨缺损模型:大鼠上颌第一恒磨牙近远中局部采用绑缚钢丝以及涂布牙龈卟啉单胞菌(stain381)的方法建立大鼠牙周炎骨缺损模型。　　2.干细胞治疗牙周炎骨缺损:将15只大鼠随机分成3组，分别为(1)空白对照组:建立实验性牙周炎模型后不做任何处理;(2)注射盐水组:注射生理盐水。(3)注射细胞组:将3×106骨髓间充质干细胞与0.3ml生理盐水混合制成细胞混悬液，在牙龈近中、远中以及近远中中间位置分别注射0.1ml的混悬液。在治疗后的12周，处死动物，进行临床检查;影像学检查牙周骨丧失Periodontal bone loss(PBL)及骨丧失率Bone regenaration rate(BRR);组织病理检查观察牙槽骨再生修复效果;CBA法检测炎性因子TNF-α和IFN-γ的表达。　　结果：　　1.注射治疗12周后，大体观察及BRR测量结果显示，实验对照组牙槽骨吸收约至牙根分歧部分，细胞注射组牙槽骨有向冠方显著增长，平均骨组织高度比对照组增加0.4mm。注射NaCl组未见牙槽骨的再生。　　2.组织病理学显示:细胞注射组有牙槽骨、牙周膜、牙骨质的再生，而在空白对照组有典型的牙周炎的表现，包括深牙周袋，缺乏新骨形成，盐水注射组有深牙周袋以及未见新骨组织生长。　　***结果显示与盐水注射组相比，炎症因子TNF-α、IFN-γ在细胞注射组的表达显著下降。　　结论：　　牙周局部注射异体骨髓间充质干细胞可以再生修复牙周炎导致的骨缺损，并且能够减轻局部炎症反应。该研究为干细胞介导的牙周组织再生提供了一种简单，低创伤的治疗方式。

关键词： 不同途径   骨髓   充质干细胞   移植   肝硬化模型大鼠  

摘要： 一般来说,肝硬化在我国还是比较常见的,同时它的死亡率也是很高的所以在对肝硬化进行治疗这一领域有很大的发展空间.为了找到一个更好的治疗办法,学者们开始了大量的研究,最终发现骨髓干细胞移植的办法本文通过大鼠来进行实验还是有一定的证明作用的,同时骨髓移植的花费不高,操作的时候也不复杂,对人体的创伤也小,更重要的是其没有排外性骨髓间充质干细胞(MSCs)具有极强的自我复制能力和多项分化潜能,且低免疫源性,有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞.为了模拟临床中的干细胞移植治疗肝硬化的特征,我们建立了大鼠肝硬化模型,并培养大鼠骨髓MSCs,通过肝动脉、门静脉、外周静脉以及肝内注射等途径将骨髓MSCs移植到模型大鼠体内,移植后观察比较各组移植骨髓MSCs对肝硬化模型大鼠的疗效差别,并追踪移植干细胞在肝内的分布定植,探讨最佳干细胞移植途径,为临床应用干细胞治疗肝硬化提供一定的理论基础和有价值的实验参考数据.

关键词： 骨髓间充质干细胞   急性肝衰竭   移植   细胞因子  

摘要： 目的：(1)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行体外培养、鉴定。(2)对D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭(ALF)大鼠给予尾静脉、门静脉二种途径注射同种异体移植大鼠BMSCs,探讨BMSCs移植治疗ALF的可能性、对比两种移植途径的疗效。(3)通过测定各组血清及肝组织中细胞因子的表达,探讨BMSCs移植治疗ALF的机制、了解BMSCs在肝内归巢的影响因素、探讨BMSCs移植对ALF血清和肝组织中细胞因子表达及肝细胞凋亡的影响及机制,为临床开展BMSCs移植治疗ALF、为临床提供可靠的ALF预后评估系统、实时准确地评价ALF的免疫状态、病情及预后并指导临床治疗提供依据。方法：(1)采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,进行体外培养。采用DAPI标记BMSCs、细胞免疫荧光、流式细胞术进行BMSCs表型鉴定。(2)采用10%D-氨基半乳糖1-4g/kg/次、12小时一次和0.005%脂多糖20μg/kg,经腹腔注射制备大鼠ALF模型,观察造模后大鼠肝功能、肝组织病理损害程度。(3)通过尾静脉和门静脉注射的方式移植BMSCS。66只大鼠随机平均分为对照组、尾静脉移植、门静脉组。各途径组同种异体移植BMSCs,移植BMSCs数量为1.4×107个/kg,对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液样本和肝组织标本。检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),比较BMSCs移植前后各组肝功能的改善情况。(4)用HE染色观察肝脏的病理学变化。用TUNEL法检测肝细胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法测定各组血清及肝组织内CD163、IL-10的水平。用原位杂交、Western blot方法检测肝组织基质细胞衍化生长因子-1α (SDF-1α)蛋白的表达水平；用免疫荧光组织化学法、RT-PCR方法检测肝组织血管内皮生长因子VEGF蛋白的表达；采用免疫组化、Western blot方法检测肝组织Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平。结果：(1)原代培养的大鼠BMSCs传代后,高表达CD29和CD90,不表达CDllb和CD45。用DAPI进行BMSCs标记,荧光显微镜下观察可见所有BMSCs均已标上蓝色荧光。(2)采用了D-氨基半乳糖模型(D-Gal)/脂多糖(LPS)诱导的大鼠ALF模型。模型建立后,组织HE染色出现典型急性肝损伤表现,肝衰竭对照组大鼠血清ALT. AST水平和肝细胞凋亡较BMSCs移植组明显升高,且有时间依赖性,这些结果支持了建模成功。(3)ALF对照组大鼠血清ALT、AST水平随病程逐渐升高,在移植后120h、168h,尾静脉、门静脉组移植组血清ALT、AST水平与对照组的差别均有统计学意义(P<0.01),尾静脉与门静脉移植组之间血清ALT, AST水平的差别无统计学意义(P>0.05)。(4)BMSCs移植后168h,尾静脉与门静脉移植组大鼠肝组织均可见大量DAPI阳性标记的细胞,ALF模型对照组未见DAPIP日性标记的细胞。(5) BMSCs移植后120h、168h,尾静脉移植组、门静脉移植组的炎性细胞浸润明显减少,肝小叶结构逐渐恢复,汇管区可见胆管增生。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况的差别无统计学意义(P>0.05)。(6)在移植后120h、168h,与对照组相比BMSCs移植组肝细胞凋亡明显减轻(P<0.05)。BMSCs移植后120h尾静脉组、门静脉组细胞凋亡指数分别为22.00±16.84%、20.60±7.60%；移植后168h细胞凋亡指数分别为18.33±8.78%、12.67±8.78%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。尾静脉和门静脉植组之间肝细胞凋亡改善情况无统计学差异(P>0.05)。(7)原位杂交、免疫荧光、Western blot结果显示：BMSCs移植组中SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平随肝功能的好转逐渐逐渐升高,在移植后120h、168h与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。尾静脉和门静脉植组之间肝组织SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平无统计学差异(P>0.05)。相关分析发现肝组织中SDF-1α、VEGF两者表达水平呈正相关(P<0.05)。肝组织中SDF-1α、 VEGF蛋白的表达与肝细胞凋亡之间存在负相关,相关系数分别0.293、-0.274(P<0.05)。(8) ELISA及RT-PCR结果显示：ALF对照组大鼠血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随时间的延长、肝功能的恶化而升高。BMSCs移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随肝功能的好转逐渐降低,在移植后120h、

关键词： MSCs   RPE细胞   共培养   分化   视网膜色素变性   细胞移植  

摘要： 研究背景和目的： 视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞的变性、坏死和丢失可造成视网膜和脉络膜的损害，导致视网膜变性类疾病的发生和视力下降。目前尚无有效治疗RPE变性的方法。细胞移植是治疗RPE细胞变性的具有前景的方法，但是如何获得数量充足的、低免疫排斥和低成瘤风险的RPE细胞是目前细胞治疗RPE变性的所面临的主要问题。而在可用于视网膜变性疾病治疗的干细胞中，胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）因其全能分化特性（可分化为包括RPE在内的体内所有细胞类型）和无限增殖能力，被认为是可用于视网膜变性类疾病治疗的重要种子细胞。然而，ESCs来源的治疗细胞的免疫排斥和成瘤风险、以及不可控增殖、伦医学等问题限制了ESCs的临床转化。和ESCs相比，目前已在临床广泛应用的自体成体干细胞可避免免疫排斥和成瘤风险，且自体取材可规避伦理障碍。在本课题中，我们重点研究是否能将成体干细胞中的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）诱导分化为RPE样的细胞，并且具备天然RPE细胞的生理功能，并最终转化成为治疗视网膜变性类疾病的理想种子细胞。 方法： 1、hMSCs和猪RPE细胞的分离 （1）原代分离和纯化获得hMSCs和猪RPE细胞，观察细胞形态； （2）hMSCs和猪RPE细胞标记检测、hMSCs成骨诱导分化钙结节茜素红染色、成软骨诱导分化甲苯胺蓝染色和成脂肪诱导分化油红-0染色鉴定hMSCs；免疫荧光鉴定猪RPE细胞。 2、hMSCs和猪RPE的共培养及其向RPE细胞的分化 （1）Transwell共培养法诱导hMSCs向RPE细胞分化；条件培养基法诱导hMSCs向RPE细胞分化； （2）hMSCs来源RPE细胞的鉴定 细胞形态学观察、细胞内色素含量的定量分析、透射电镜检测、Real-time PCR、免疫荧光染色检测、吞噬实验和细胞断层扫描、Western Blot、验证MERTK蛋白在诱导细胞特异性吞噬功能中的作用和诱导细胞的神经营养因子分泌能力检测。 3、hMSCs来源RPE细胞对急、慢性视网膜变性的修复作用 （1）碘酸钠注射制备急性视网膜变性大鼠模型及鉴定：HE染色和F-ERG检测； （2）急性视网膜变性大鼠模型视网膜下腔移植分别于移植后4周、8周检测以下指标：细胞形态学观察、免疫荧光染色检测hESCs来源的RPE细胞、吞噬实验和细胞断层扫描、移植后免疫荧光染色检测、F-ERG和Western Blot。 （3）选取21天龄的RCS白化大鼠进行视网膜下腔移植，分别于移植后4周、8周检测以下指标：外核层厚度的测量、移植后细胞的免疫荧光染色检测、F-ERG和Western Blot检测细胞在体的吞噬能力。 结果： 1、hMSCs的鉴定 （1）hMSCs形态多为梭形成纤维细胞样外观，呈旋涡状排列；猪RPE细胞外形呈多边形，细胞内充满了棕黑色的色素颗粒； （2）hMSCs的表面标志CD73、CD90、CD105表达强阳性，而CD14、CD45、CD34阴性；茜素红染色后，细胞间出现致密的、圆形不透光团块状的红色结节；阿新蓝染色可见细胞外基质被染成蓝色，成条索状错综排列；油红-0染色细胞中含有被染成红色的脂肪颗粒；猪RPE细胞CRALBP、RPE65、ZO-1表达均为阳性。 2、hMSCs向RPE细胞的分化 （1）hMSCs共培养诱导后的RPE样细胞可观察到hMSCs中出现丰富的色素颗粒，含量接近于成体猪的RPE细胞，而采用条件培养基诱导法获得细胞色素含量较少； （2）共培养hMSCs-RPE细胞的色素含量与RPE细胞相比无统计学差异，条件培养基诱导hMSCs-RPE细胞内色素颗粒含量与共培养hMSCs-RPE细胞的色素含量相比具有统计学差异； （3）透射电镜观察见hMSCs-RPE细胞内可见成熟的色素颗粒，细胞顶端可见典型的微绒毛结构； （4）hMSCs-RPE细胞表达RPE细胞特异的基因MITF、OTX2、tyrosinase、RPE65、Bestrophine、PEDF、PMEL17、CRALBP、PAX6和诱导前相比都显著上调，且和原代分离的人RPE细胞的表达水平相类似； （5）hMSCs-RPE细胞可表达RPE细胞特异的蛋白CRALBP、RPE65和ZO-1； （6）FITC标记的POS和hMSCs-RPE细胞共孵育后，猪RPE细胞和诱导细胞内均可观察到绿色荧光，而未诱导的hMSCs内未见到绿色荧光；hMSCs-RPE细胞MERTK蛋白表达显著上调，α

关键词： 间质干细胞   结肠炎,溃疡性   Treg   Th17  

摘要： 目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在溃疡性结肠炎(UC)大鼠发病中的作用,并分析可能与调节Treg及Th17细胞有关。方法用三硝基苯磺酸(TNBS)诱导建立UC大鼠模型,体外培养扩增雄性SD大鼠MSCs,建立空白对照组,未作任何处理;模型组,仅用TNBS灌肠(3ml/kg);MSCsⅠ组,MSCsⅡ组和MSCsⅢ组分别用TNBS(3ml/kg),3d后,MSCsⅠ组给予尾静脉注射低剂量MSCs(1×105),MSCsⅡ组给予尾静脉注射中剂量MSCs(1×106),MSCsⅢ组给予尾静脉注射高剂量MSCs(1×107)。计算各组大鼠的疾病活动指数(DAI)、大体形态评分(GMS)和结肠组织学病理评分(HDS),并通过免疫组化、流式细胞术观察MSCs对UC大鼠Treg/Th17的影响。结果 DAI、GMS和HDS在模型组中高于空白对照组,Treg细胞在UC大鼠模型中表达下调,Th17细胞在模型组中表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,MSCs治疗组DAI、GMS和HDS降低,且MSCsⅡ组低于MSCsⅠ组与MSCsⅢ组,结肠组织与外周血Treg细胞表达上调,MSCsⅡ组高于MSCsⅠ组与MSCsⅢ组,差异有统计学意义(F=9.25,641.00,P<0.05);Th17细胞表达下降,MSCsⅡ组低于MSCsⅠ组与MSCsⅢ组,差异有统计学意义(F=15.95,318.80,P<0.05)。结论 MSCs通过对UC大鼠Treg、Th17的影响,对UC大鼠起到治疗作用。

关键词： 慢性移植肾肾病   骨髓间充质干细胞   肾功能   损伤机制   肾间质纤维化  

摘要： 目的：　　通过对慢性移植肾肾病(CAN)患者输注骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),观察输注的安全性与可行性,以及输注后移植肾功能和移植肾间质纤维化等指标的变化,探讨BM-MSCs对慢性移植肾肾病患者移植肾功能的影响以及修复移植肾损伤的机制。　　方法：　　选择2011年3月至2013年1月间确诊慢性移植肾损伤,且符合入组标准的患者11例,制备第三方骨髓间充质干细胞,分三次输注,输注时间为0天,7天和1月。首次在DSA引导下经移植肾动脉输注,细胞量为5.0×106个,第2、3次为经外周静脉输注,细胞量为1.0×106个/kg/次。观察治疗后患者Cr、Bun、CysC、Ccr、24小时尿蛋白、血/尿β2微球蛋白的变化情况,在治疗前和治疗后6月行移植肾穿刺活检,应用JD图像分析系统检测肾间质纤维化指标(LN、FN、TGF-β1、CTGF)的变化。　　结果：　　11名患者中,除了1例在第一次输注BM-MSCs后3天出现肺部感染症状、1例在第二次输注过程中出现过敏反应外,未发生出血、移植肾动脉栓塞、假性动脉瘤等BM-MSCs输注相关的并发症,且肺部感染发生率与未接受BM-MSCs治疗者发生率无显著差异。移植肾功能指标:Cr、Bun、CysC在治疗前为205.55±45.84umol/L,14.96±8.22mmol/L,2.44±0.58mg/L,治疗后1周、1月分别为:188.09±49.68umol/L、12.00±4.70mmol/L、2.33±0.53mg/L和182.64±50.89umol/L、12.13±5.01mmol/L、2.29±0.56mg/L,与治疗前相比有下降,其差异具有统计学意义,P<0.05;治疗3月后,其差异无统计学意义。Ccr在治疗前为38.05±14.32ml/min,治疗后7天、1月分别为42.59±18.05ml/min、43.02±15.28ml/min,较治疗前升高,其差异具有统计学意义,P<0.05;而治疗3月后,其差异无统计学意义。治疗7天时24小时尿蛋白定量为630.67±668.26mg,与治疗前883.33±853.57mg相比,其差异具有统计学意义,而治疗1月后差异无统计学意义。肾间质纤维化治疗FN、LN在治疗6月后的平均光密度值为(0.210±0.076,0.223±0.074)与治疗前(0.227±0.049,0.236±0.038)相比有下降,但差异无统计学意义,P>0.05;TGF-β1和CTGF在治疗6月后的平均光密度值为(0.196±0.064,0.204±0.070)与治疗前(0.247±0.052,0.242±0.044)相比有下降,且差异具有统计学意义,P<0.05。　　结论：　　慢性移植肾肾病患者在接受BM-MSCs治疗后,血肌酐、尿素氮、胱抑素C在1月内均有下降;内生肌酐清除率在治疗1月内较治疗前升高;24小时尿蛋白定量在7天内有所减少,移植肾纤维化指标TGF-β1与CTGF在治疗6月后较治疗前减少。

关键词： 骨髓间充质干细胞   大鼠   细胞体外培养   血管性痴呆   动物模型   SD大鼠   Morris水迷宫   干细胞   血管性痴呆   甘露醇   突触素   CA3  

摘要： 第一章大鼠BMSCs体外分离、培养、鉴定和标记 [目的]探索SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)体外分离、培养、鉴定及标记的方法。为下一步的移植研究提供充足的BMSCs。 [方法]应用全骨髓贴壁改良法分离培养SD大鼠BMSCs,显微镜观察细胞形态,绘制细胞生长曲线。使用流式细胞仪检测细胞表面标记物及茜素红成骨诱导染色对第三代细胞进行鉴定。并对第3代细胞进行BrdU标记。 [结果]体外培养的原代BMSCs生长旺盛,以梭形为主,细胞集落呈螺旋状。第3代BMSCs几乎均一表达CD29,CD90,而CD34,CD45几乎不表达。BMSCs经诱导能分化为成骨细胞,茜素红染色出现红色钙化结节。BrdU免疫组化结果显示,BMSCs标记率高达85.29%。 [结论]改良的全骨髓贴壁法体外分离、培养及传代的SD大鼠BMSCs纯度高,活力强,性状稳定。BrdU标记法安全、高效。 第二章血管性痴呆大鼠模型的制备 [目的]探讨VD大鼠模型理想的制备方法,为下一步BMSCs移植研究提供VD大鼠模型。 [方法]采用间隔3天永久性结扎双侧颈总动脉法制备VD大鼠模型。假手术组不结扎双侧颈总动脉,其余手术操作步骤相同。术后4周,采用Morris水迷宫试验测定模型大鼠的行为学表现。 [结果]假手术组术后因饲养不当死亡1只,余9只。模型组大鼠存活59只,死亡18只,1只出现眼球变白、萎缩,3只未达VD标准。本实验成功制备55只VD大鼠。模型组大鼠造模后水迷宫的逃避潜伏期较假手术组明显延长,平台象限滞留时间比假手术组明显缩短(p<0.05)。模型组大鼠的存活率为76.62%,成模率为93.22%。 [结论]改良双血管法具有死亡率低,成模率高,简单易行等优点,是制备VD大鼠模型的理想方法。 第三章甘露醇对骨髓间充质干细胞静脉移植治疗血管性痴呆大鼠模型的疗效观察 [目的]探讨甘露醇预处理对骨髓间充质干细胞移植治疗VD大鼠模型疗效及海马CA3区突触素表达水平的影响。 [方法]造模4周后将VD大鼠随机分为空白对照组、培养基组、甘露醇组、BMSCs组、甘露醇预处理BMSCs组,分别给予相应的实验干预措施。观察干预4周后实验大鼠的行为学表现及应用免疫组化法检测海马CA3区突触素的表达水平。 [结果]甘露醇预处理BMSCs组行为学较BMSCs组、培养基组、甘露醇组、空白对照组有明显改善(P<0.05),其逃避潜伏期缩短(P<0.05),平台象限滞留时间延长(40.75±6.29s,P<0.05),其海马CA3区突触素表达水平(39624±7797)亦比BMSCs组、培养基组、甘露醇组、空白对照组明显提高(27060±4667,19955±4243、18293±6445,18946±4953,P<0.05)。 [结论]甘露醇预处理后静脉移植BMSCs显著改善VD大鼠行为学表现,并使其海马CA3区突触素表达显著增加。甘露醇预处理明显提高静脉移植BMSCs治疗VD大鼠的效果。