关键词： 压力性尿失禁   干细胞治疗   尿道功能   神经功能  

摘要： 研究背景：干细胞可用于治疗女性压力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)，而且目前正在进行有关的临床试验。然而，干细胞治疗的作用机制并未阐明。　　目的：本研究的目的是检测骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cell，BM-MSC）及其分泌物对模拟产伤动物模型功能及结构的恢复作用。　　方法：1、成年雌性大鼠BM-MSC获取及定向分化能力检测。浓缩分泌物(Concentrated conditioned media，CCM)的获取及微阵列蛋白检测;2、模拟产伤动物模型的制备，包括阴道扩张(Vaginal distention，VD)和双侧阴部神经挤压(Pudendal nerve crush，PNC);3、大鼠试验包含两个部分，第一部分含有三个组，分别是假损伤+生理盐水尾静脉注射（n=15），双重损伤+生理盐水尾静脉注射(n=13)，和双重损伤+BM-MSC尾静脉注射(n=16)。第二部分含有三个组,分别是假损伤+浓缩普通培养基(concentrated control media，CM)腹腔注射（n=18），双重损伤+CM腹腔注射(n=19)，和双重损伤+CCM腹腔注射(n=17)。手术三周后进行功能学及组织学检测，功能学检测包括漏尿点压力(Leak point pressure，LPP)，尿道外括约肌(External urethral sphincter，EUS)肌电图(Electromyography，EMG)，和阴部神经感觉支神经电位(Pudendal nerve sensory branch potential，PNSBP)检测。组织学检测包括弹性纤维蛋白染色，神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)和阴部神经免疫荧光染色。　　结果：1、从成年雌鼠股骨中获取的骨髓在低氧培养箱中培养，到第三代(Passage3，P3)时利用流式细胞仪分选细胞间黏附分子-1(Intracelluar adhesion molecule，ICAM-1)阳性的MSC，然后使用绿色荧光蛋白(Green fluroscence protein，GFP)慢病毒载体感染MSC。体外培养的MSC用光镜观察主要呈梭形和多角形，连续传代P8和P16后用流式细胞仪进行细胞表面标志检测发现CD29，CD90，CD54和CD45等干细胞标志物表达均呈阳性，P16细胞进行脂肪形成和成骨形成定向分化检测，脂肪形成培养到20-35天后用茜素红S染色观察分化程度，成骨形成20-35天后用油红O和苏木紫染色观察分化程度。P16骨髓间充质干细胞在无血清DMEM普通培养基中培养24h，使用低氧、5％CO2、37℃培养箱。将获得的上清液提取出来，置于离心过滤器中并在离心机中4000rpm离心75分钟获得浓缩50倍的终产物，然后用0.22um过滤器过滤获取的CCM并储存在1.5ml离心管中。CM使用无血清DMEM离心浓缩获得，方法类似。CCM在注射前进行细胞计数和诱导分化试验，结果显示CCM中没有细胞存在并且使用CCM培养的MSC生长速度要显著高于对照组。使用RayBio?大鼠蛋白抗体阵列检测CCM中的蛋白组成发现了63种不同表达强度的细胞因子和趋化因子。　　2、VD+PNC双重损伤延迟了阴部神经和尿道的功能恢复，其中LPP，EUS EMG结果显示到第三周时双重损伤组显著低于对照组，而VD和PNC单独损伤组与对照组相比均无显著差异，阴部神经横断(Pudendal nerve transection，PNT)组在损伤第六周时LPP和EUS EMG仍显著低于对照组。基于以上结果我们使用VD+PND双重损伤模型作为本实验研究模型。　　3、双重损伤+生理盐水或CM注射组在第三周时LPP显著低于对照组，说明尿道功能损伤和抗漏尿压力降低。而接受MSC或CCM注射的双重损伤大鼠三周后的LPP与对照组相比无显著差异，说明MSC和CCM均能促进尿道功能恢复。EUS EMG振幅增加值（峰值-基础值）在双重损伤接受生理盐水或MSC注射治疗后均显著低于对照组，EUS EMG振频和振幅增加值在其他各组中相比均无明显差别，说明MSC和CCM并未促进EUS EMG的恢复。PNSBP振频和振幅增加值（峰值-基础值）在双重损伤+生理盐水或CM注射组均显著低于对照组，而MSC或CCM注射组与对照组相比并无明显差别，说明MSC和CCM均能促进模拟产伤后的神经功能恢复。组织学研究发现，与对照组相比，双重损伤三周后尿道外括约肌横纹减少并且有肌肉萎缩现象。弹性纤维在对照组中表现为连续的长纤维，主要出现在尿道外括约肌外层，与括约肌平行。双重损伤三周后这些平行于括约肌的外层长纤维破坏并纠缠在一起，而括约肌内侧

关键词： 股骨头坏死   同种异体脱钙骨   骨髓间充质干细胞   益肾通络法   动物实验  

摘要： 背景:随着激素在临床的广泛使用，激素性股骨头坏死的发病率逐渐上升。尽管有各种各样的理论，然而其发病机制尚不明确，且由于早期诊断率低且缺乏有效的治疗方法，许多患者最终不得不行手术治疗，严重影响患者的生活质量。中医药治疗激素性股骨头坏死疗效满意，且积累了大量的临床经验，但单纯中医治疗也存在不足。探讨如何将中医药的治疗优势与组织工程技术有机结合，寻求一种综合疗法，对提高临床治疗激素性股骨头坏死的疗效，减轻患者经济负担，提高生活质量具有重要意义。　　目的:制备激素性兔股骨头坏死模型（SANFH），通过组织工程骨(BMSCs/DBM)的髓芯减压植骨术联合中药治疗股骨头坏死，观察其对坏死股骨头的骨陷窝数及毛细血管数影响，以期为临床治疗激素性股骨头坏死寻找较好的解决途径。　　方法:本实验分为四个部分。　　第一部分，甲强龙联合脂多糖诱导兔股骨头坏死模型的建立。30只健康雄性新西兰兔，随机分为实验组(20只)和对照组(10只)，实验组耳缘静脉注射脂多糖(LPS)10μ g/kg，24h后肌注甲强龙20mg/kg，1次/d，共3d。对照组注射同等剂量的生理盐水。6周后观察兔股骨头X射线、μCT及病理学等指标的改变。　　第二部分，兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离、培养及鉴定。健康2周龄纯种新西兰大白兔1只，空气栓塞处死后，解剖分离出双下肢，剪断股骨、胫骨两端骨骺，反复冲洗骨髓腔和干骺端，采用全骨髓培养法分离出BMSCs，取第3代细胞观察其形态并绘制生长曲线。　　第三部分，同种异体脱钙骨(DBM)的制备及与兔BMSCs复合培养。健康雄性新西兰兔，空气栓塞处死后，取四肢长骨骨端及髂骨，剖成0.3cm×0.4cm×0.4cm大小骨块，脱水、脱钙、脱脂后，37℃烤箱干燥，玻璃瓶密封后环氧乙烷消毒。将制备好的DBM加入24孔板培养，同时加入密度为5×106/ml的第3代BMSCs，于37℃、5％CO2培养箱中培养，光镜下观察，复合培养1周后备用。　　第四部分，组织工程骨(BMSCs/DBM)的髓心减压植骨术联合中药治疗股骨头坏死的实验研究。成年新西兰兔30只，建立兔激素性股骨头坏死模型，随机分为五组:A髓芯减压+干细胞复合同种异体脱钙骨移植组十中药复方灌胃组;B髓芯减压+干细胞复合同种异体脱钙骨移植组;C髓芯减压+中药复方灌胃组;D单纯中药复方灌胃组;E单纯髓芯减压组。分别于术后2、4、8周时处死动物，行X线、MRI检查，组织病理切片染色后，在光镜下观察新骨痂及新生骨组织的联结情况。所有数据采用SPSS16.0统计软件包，定量指标以均数、标准差描述。多组对比分析，定量资料符合正态分布用方差分析，不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验。组间两两比较，P≤0.05为差异有显著性意义，P≤0.01为差异有非常显著性意义，P＞0.05差异无统计学意义。　　结果:实验结果显示:　　第一部分，X线示股骨头密度减低，骨小梁模糊不清，可见一囊状透亮区，股骨头保持完整;μCT示结论:模型组股骨头骨小梁稀疏，股骨头可见部分塌陷;病理:骨小梁纤细，部分骨小梁断裂，髓腔内造血细胞减少，脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状。大剂量激素能够成功安全便捷地诱导兔股骨头坏死动物模型。　　第二部分，BMSCs形态观察原代培养7天见散在少量贴壁细胞，呈梭形、多角形或不规则状，周围有大量杂质圆形细胞;传代一次培养后，贴壁细胞数量明显增多，细胞呈梭形、多角形，杂质细胞明显减少;第二次传代后细胞增殖快，呈多角形或不规则状，培养5天即可铺满皿底;至第三代BMSCs细胞外观呈长梭形，紧密排列，符合BMSCs细胞生长形态特征。　　第三部分，BMSCs有效地复合到了同种异体脱钙骨(DBM)上，同种异体脱钙骨具有较好的细胞相容性，BMSCs能在其表面和孔隙内附着、生长、增殖。第6天时，BMSCs与同种异体脱钙骨联合培养细胞增殖达稳定期，构建了理想的组织工程骨，此时为该组织工程骨移植的最佳时机。　　第四部分，(1)X线摄片:术后2周时各组股骨头骨密度均降低，差异无显著性意义。术后4、8周时各组骨密度有不同程度增高，其中A组和B组骨移植区的高密度影高于C、D、E组。　　(2)MRI:术后2周各组均可见明显坏死区低信号改变。术后4、8周各组坏死低信号区未见有明显扩大，但整个股骨头形态尚正常，A、B低信号区范围明显缩小，骨密度增高;C组低信号范围缩小;D、E组两组低信号区基本无变化。　　(3)组织学观察:术后2周各组均可见骨小梁纤细，部分骨小梁断裂，脂肪细胞体积增大;A、B组骨髓间充质干细胞增生，有原始毛细血管形成。术后4周A组可见骨髓间充质干细胞向骨母细胞分化，同时形成纤维状骨痂;B、C组骨痂相对A组较少，仍可见少量空骨陷窝;D、E组骨痂稀少，毛细血管稀少，骨化趋向不明显。术后8周A组修复区域增大，骨细胞更趋于成

关键词： 骨髓间充质干细胞   缺氧缺血性脑损伤   神经营养因子   神经功能评估  

摘要： 目的：本课题研究人骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells、BM-MSCs)用于新生重度缺氧缺血性脑损伤大鼠的治疗过程中神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)神经营养素-3(neurotrophin-3NT-3)、胶质细胞源性神营养因子(glia cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)的表达变化及其与疗效的关系；初步分析了干细胞治疗双胞胎脑瘫患儿疗效特点,探讨与遗传基因的相关性。方法：60只6日龄SD大鼠被随机分为手术对照组(NS组)、空白对照组(BC组)和干细胞移植组(MSC组),每组20只,制备重度缺氧缺性脑损伤大鼠模型。将人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)经体外培养、扩增后,经枕大池移植到MSC组模型大鼠的蛛网膜下腔中,NS组用相同体积的生理盐水代替BM-MSCs,BC组于模型建立后不进行任何处理,经上述处理后3天、7天、14天和21天对大鼠进行改良神经功能缺损评分(Modified neurological Severity Scores, mNSS),同时收集大鼠脑脊液检测NGF、BDNF、NT-3、GDNF等神经营养因子的表达；收集8对双胞胎脑瘫患儿,签署知情同意书后行干细胞移植治疗,于移植前及移植后1月、6月进行运动功能评价,应用粗大运动功能量表(Gross Motor Function Measure.88, GMFM88)以及精细运动功能量表(Fine Motor Funetion Measure. FMFM)进行量化评估。结果:MSC组及NS组大鼠在移植后第7、14和21天,其mNSS评分与移植前和移植后第3天相比,均有显著性减低(P<0.05),其中MSC组降分程度大于NS组。而BC组仅在移植后21天出现明显差异并具有统计学差异(P<0.05)。脑脊液检测发现MSC组神经营养因子NGF、NT-3、BDNF及GDNF的表达较移植前有显著增加(P<0.05),而NS组和BC组表达反而有减少(P<0.05)；同卵双生脑瘫患儿接受干细胞移植后,两个体间的粗大运动功能和精细运动功能总评分改善程度有显著关联(r=0.786,P=0.036)。结论：经枕大池移植BM-MSCs后脑脊液中NGF、NT-3、BDNF、GDNF等神经营养因子增加,推断BM-MSCs移植后高表达神经生长因子,在脑损伤大鼠神经功能的修复机制中起到重要作用；同基因的两个双生脑瘫患儿之间运动功能的改善具有显著相关性,而双胎各对子之间运动功能改善程度不具相关性。推断遗传因素参与了脐带间充质干细胞移植对小儿脑瘫患者运动功能改善的作用机制。

关键词： 肝纤维化   骨髓间充质干细胞   临床治疗  

摘要： 大多数慢性肝病发展到终末期会发生肝纤维化，如果可以研究出阻止甚至逆转这一病变过程的治疗方法，那么大多数的慢性肝病可能治愈。虽然肝移植是各种终末期肝病治疗公认的有效方法，但是肝供体的匮乏和移植费用的高昂严重限制了大多数患者进行肝移植治疗。干细胞可以快速进行自我更新，具备高度增殖以及多向分化等潜能。近年来干细胞一直是研究的热点，并逐步由实验室研究向临床研究过渡，对各种类型的干细胞的研究也不断深入。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）在组织工程领域及临床治疗方面具有巨大的潜力，其具备分化为肝细胞和胆管细胞的能力并行使其部分功能，且有取材方法简便多样、体外培养成活率高、自身移植时无免疫排斥反应以及无医学伦理道德束缚等特点而成为目前治疗肝纤维化及其他终末期肝病的选择。虽然大多数实验证实进行BMSCs移植对肝纤维化的干预治疗是有效的，但仍然存在争议。目前的实验均为一次性移植BMSCs的研究，但是骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗肝纤维化是否可以反复进行呢？本实验即针对这一疑问进行研究。　　方法:将80只SD(Sprague-Dawley)随机分为四组:A组（空白对照组）;B组（肝纤维化模型组）;C组（一次性移植BMSCs组）;D组（两次移植BMSCs组）。通过检测大鼠血清中透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PⅢP)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层粘连蛋白(LN)的水平比较一次性移植BMSCs的肝纤维化大鼠与间隔一个月经过两次移植BMSCs的肝纤维化大鼠的治疗效果。　　结果:通过测定肝纤维化程度的几个指标发现经过一次移植骨髓间充质干细胞的肝纤维化大鼠和经过两次移植骨髓间充质干细胞的肝纤维化大鼠在治疗效果上无明显差异。　　结论:两次移植骨髓间充质干细胞较单次移植对SD大鼠肝纤维化的治疗效果无明显差别。

关键词： 心肌梗死(MI)   整合素连接激酶(ILK)   间充质干细胞(MSCs)   干细胞移植  

摘要： 研究背景 心肌再生能力低下是心肌梗死(MI)后多种治疗方法效果不佳的主要原因。虽然一些研究证实了骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗MI有效,但是心功能改善十分有限。其中移植细胞归巢率低是其疗效不佳的主要原因。因此提高移植细胞归巢能力是改善MSCs移植疗效的关键因素之一。将细胞移植与基因治疗相结合,用促进归巢的基因修饰MSCs,使其高表达,增加MSCs向MI局部的归巢效应,是可能策略之一。整合素连接激酶(ILK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在正常心肌细胞中有较高表达。ILK通过激酶区与整合素β1胞浆区结合,与细胞归巢关键分子密切相关。我们的前期研究发现ILK基因可以调节细胞生长、存活、增殖及分化。但ILK对MSCs归巢的作用尚不清楚。因此,本项目拟用SPIO标记ILK基因转染的MSCs,建立猪MI模型后进行移植治疗,应用MR动态观察移植细胞向缺血心肌迁移、归巢的变化及对心功能的影响。本项目有望为提高MI细胞治疗疗效提供新的理论和科学依据。研究方法 1、以表达ILK及绿色荧光蛋白GFP(ad-GFP/ILK)或仅表达GFP(ad-GFP)的腺病毒载体转染体外培养的猪MSCs,确认转染成功后,观察体外高表达ILK基因对MSCs的细胞活力、增殖能力、迁移能力及细胞凋亡的影响;2、用超小超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)标记MSCs,体外MR检查,并检验USPIO标记对MSCs的细胞活力、增殖能力、迁移能力及细胞凋亡的影响;3、经冠脉球囊封堵方法构建猪心肌梗死模型,一周后再次经冠脉随机移植ILK-MSCs、MSCs(均为5×107细胞)或PBS,移植后24h、3天、1周及2周进行MR分子影像学检查,观察移植细胞归巢情况;心肌首过灌注成像观察局部心肌血流灌注情况;延迟增强观察梗死心肌面积;心脏电影成像观察局部心脏功能状态;2周后冰冻切片观察GFP表达情况;普鲁士蓝染色观察细胞内铁的分布;HE染色观察梗死心脏形态;Masson染色检测纤维化程度;Ki67染色观察细胞增殖情况;CD31及vWF染色观察血管新生情况;Caspase3染色检测细胞凋亡情况。4、统计学处理应用SPSS17.0统计软件,所有数据以均数士标准差表示,两组间均数比较采用独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)最小显著差数(LSD)法,p<0.05(双侧)提示有显著的统计学差异。研究结果 1、体外实验中,高表达ILK基因能促进MSCs的细胞活力(p<0.001)、细胞增殖(p<0.001)、细胞迁移能力(p<0.001),同时减少细胞凋亡(p<0.001);2、USPIO标记MSCs的标记率达到100%,本实验的最佳标记浓度为50ug/ml,最低检测到的细胞数为1×104/0.5ml细胞;MR信号随标记浓度、细胞数及代数减低。3、在体MR内实验显示,MR显示MSCs及ILK-MSCs移植后3天的MR低信号区面积及信号变化幅度均较24h增大(P<0.05),而1周时面积较3天增大(P<0.05),但信号变化幅度较3天减低(P<0.05),2周后面积及信号变化幅度均较1周时减低(P<0.05)。两组比较,ILK-MSCs组移植后24h、3天及1周时MR低信号面积及信号变化幅度均较MSCs组大(P<0.05),而2周时MR低信号面积及信号变化幅度均较MSCs组小(P<0.05)。心肌首过灌注显示ILK-MSCs组移植后随时间相对灌注值较MSCs及PBS组高(P<0.05),MSCs组较PBS组高(P<0.05);延迟增强成像发现ILK-MSCs组细胞移植后梗死面积较移植前减小,MSCs组面积变化不大,而PBS组较移植前面积增大;心功能成像发现ILK-MSCs组局部心功能较另外两组改善明显(P<0.05);ILK转染组GFP及USPIO颗粒较对照组多;ILK转染组的MSCs移植能降低纤维化程度(P<0.001),减少细胞凋亡(p<0.001),增加血管密度(p<0.001),增加细胞增殖(p<0.001)。研究结论 本研究首次在在体证实,ILK-MSCs移植能够提高移植细胞的归巢率,促进梗死心肌周围心肌细胞增生,减少凋亡,促进血管新生,减少胶原增生,最终明显提高猪心肌梗死MSCs移植的疗效。本研究结果为提高缺血性心脏病的细胞治疗疗效提供了新的方法.。

关键词： 股骨头坏死   骨髓间充质干细胞   中药治疗  

摘要： 目的:探究股骨头坏死患者采用骨髓间之干细胞的治疗效果。方法:选取2012年8月-2014年1月收治的54例股骨头坏死患者进行治疗,随机分组,实验组32例给予骨髓间充质干细胞的治疗,对照组22例患者采用中医治疗,对比患者疗效。结果:实验组治疗有效率为87.5%,对照组治疗有效率为63.6%,治疗效果差异较大,有统计学意义(P<0.05)。实验组安全率为96.9%,对照组安全率为95.5%,差异小,无统计学意义(P>0.05)。结论:股骨头坏死患者采用骨髓间充质干细胞的治疗,可明显缓解病情,并发症较少,并促进关节功能的良好恢复,值得推荐。

关键词： 慢病毒   microRNA-1   骨髓间充质干细胞   移植   心肌梗死  

摘要： 目的： 通过携带miRNA-1的慢病毒载体（Lentivirus vector,LV）转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells），观察miR-1过表达慢病毒载体转染的BMSCs移植治疗大鼠心肌梗死（Myocardia infarction,MI）的作用及其相关机制，以期为心肌梗死寻找新的治疗策略。 方法： 以全骨髓培养法获取BMSCs，并予以扩增、鉴定；构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的miR-1慢病毒载体并转染BMSCs，建立miRNA-1基因修饰BMSCs（GFP作为细胞标记）；通过冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠心肌梗死（AMI）模型。将30只大鼠通过随机平分法分为空白对照组、假手术组（Sham组）、心肌梗死组（Vehic组）、未转染病毒组（BMSCs组）、miR-1重组慢病毒组（miR-1/BMSCs组），每组6只，在AMI建模1天后，经尾静脉注射途径分别以100μl生理盐水或2×106/100μl相应BMSCs分别干预各实验组并继续饲养28天。分别于建模前及建模后28天超声心动图观察心脏功能及结构改变；饲养28天后处死大鼠，留取血液标本酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组血清血管内皮生长因子（VEGF）的浓度；留取心脏标本计算心脏左室质量指数，伊红-苏木素（Hematoxylin Eosin,HE）染色观察心肌病理变化，免疫组织化学方法（Immunohistochemistry,IHC）检测血管Ⅷ因子表达；免疫荧光检测心肌细胞特异蛋白cTnT及connexin43的表达。 结果： 原代培养的BMSCs48小时后有少量贴壁细胞，呈短棒状或扁平多角形；最初3天细胞生长较慢，见少量小集落形成，之后快速增殖，流式细胞仪检测BMSCs的表面标志性抗原显示CD29、CD44阳性，而CD34、CD45阴性，符合BMSCs特征；成功构建miR-1过表达慢病毒载体（病毒滴度3×108TU/μl）并转染BMSCs，四天时转染效率达90%以上并检测到miR-1高水平表达。建模前各组大鼠超声心动图检测指标无明显差异，建模28天时BMSCs组及miR-1/BMSCs组超声检测指标较Vehic组改善，其中miR-1/BMSCs组改善尤为明显。ELISA提示相较空白组及Sham组，其他各组血清VEGF浓度均明显升高，其中miR-1/BMSCs组VEGF浓度升高最显著；HE染色显示其结构破坏及瘢痕形成均明显轻于其他实验组；血管Ⅷ因子免疫组织化学检测同样显示miR-1/BMSCs组毛细血管密度较其他各组显著升高。免疫荧光检测显示miR-1/BMSCs组大鼠心肌梗死区部分BMSCs表达心肌细胞特异蛋白cTnT及connexin43。 结论： 心肌梗死后移植骨髓间充质干细胞能改善心肌梗死后SD大鼠心功能，并能一定程度抑制或逆转心室重构，miR-1基因修饰BMSCs可进一步增强大鼠心肌梗死治疗效果；miR-1基因修饰BMSCs可能通过提升BMSCs向心肌细胞分化效率及促进VEGF等有益因子旁分泌作用实现心肌梗死的治疗效应。

关键词： 骨髓间充质干细胞   大鼠   诱导分化   细胞   归巢   胞膜   表达   肠损伤   放射   刺激  

摘要： 第一部分SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及其生物学特性鉴定 目的:SD大鼠BMSCs的体外分离、培养和纯化，以及生物学特性鉴定，为整个课题打下基础。 方法：联合采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养法，分离培养和纯化BMSCs，同时显微镜下观察细胞生长状况。流式细胞仪鉴定细胞表面标记物，鉴定其向成骨、成脂分化潜能。 结果：分离培养的BMSCs呈梭形、大小均一，类似成纤维细胞样。流式结果显示BMSCs表面CD44、CD90阳性表达，而CD45阴性表达。P3代BMSCs可向成骨、成脂诱导分化。 结论：本部分实验成功分离培养了BMSCs，纯度高、形态均一，可用于之后的 相关实验研究。 第二部分VEGF刺激骨髓间充质干细胞后CXCR4表达的实验研究 目的：探讨BMSCs经VEGF刺激后对其归巢的影响 方法：将第一部分分离培养的BMSCs随机分成3组，A组：空白对照组，完全培养基培养；B组：在BMSCs的完全培养液中加入VEGF，使最终VEGF浓度为10ng/ml。C组：在BMCs的完全培养液中加入VEGF，使最终VEGF浓度为50ng/ml。流式细胞分别测量刺激48h后各组胞膜和胞膜内CXCR4的表达。 结果：各组BMSCs胞膜和胞膜内均有CXCR4表达，且胞膜内高于胞膜的表达，其中C组表达均最高，P<0.05 结论：1、BMSCs和经VEGF刺激的BMSCs胞膜和胞膜内均有CXCR4表达；2、VEGF刺激BMSCs后，胞膜和胞膜内CXCR4表达增高；且50ng/ml浓度下表达最高； 第三部分SDF-1在放射性损伤的肠组织中的表达 目的：1、建立急性放射性肠损伤的模型；2、进一步探讨VEGF对BMSCs的归巢影响。 方法：90只雌性的SD大鼠随机分成3组（每组30只），即对照组（A组）、BMSCs治疗组（B组）和经VEGF刺激的BMSCs的治疗组（C组）。B组和C组在照射后4小时内通过尾静脉注射1×106/ml的雄性大鼠BMSCs悬液1ml及经50ng/ml的VEGF刺激48小时后的BMSCs悬液1ml；A组于照射后4小时内尾静脉输注生理盐水1ml。造模后第1、3、7、14、21天每组随机处死6只大鼠，留取全血与两份末端回肠标本。显微镜下观察肠道组织结构，测量绒毛高度及隐窝深度；ELISA法测量血清中瓜氨酸和VEGF的浓度。免疫组化SP法检测造模后3天肠组织SDF-1的表达。 结果：1、成功建立了放射性肠损伤模型；造模后第3、7、14天，C组大鼠精神状态，运动量，饮食量，排泄状况均优于A组、B组，而造模后第1、21天三组大鼠之间无明显差异。HE染色结果显示，造模后第3、7、14天，C组肠道结构较A、B组完整，肠粘膜上皮细胞坏死少，伴有的炎性细胞较少，而腺体结构却较丰富。通过测量肠道绒毛高度和隐窝深度评估肠道功能，造模后第3、7、14天，同一时期绒毛高度和隐窝深度，C>B>A，P<0.05有统计学差异。造模后第1、21天，同一时期绒毛高度和隐窝深度，各组无统计学差异，P>0.05. 2、免疫组化SP法测量各组受损肠组织SDF-1的表达量，发现C组SDF-1的表达量明显高于A、B组，且B组表达量高于A组。 结论：1、直线加速器建立放射性肠损伤模型的剂量为12Gy； 2、放射性肠损伤可以自我修复，周期在2～3周左右； 3、经VEGF刺激的BMSCs能够促进急性放射性肠损伤的修复，能提高其修复的效率，但从远期效果来看无明显差异； 4、经VEGF刺激的BMSCs能通过提高BMSCs的归巢率促进损伤肠道修复，机制与SDF-1/CXCR4轴有关。

关键词： 髓芯减压   骨髓间充质干细胞   股骨头无菌性坏死  

摘要： 目的:观察髓芯减压联合自体骨髓间充质干细胞治疗45例股骨头无菌性坏死的的临床效果及安全性。方法:采取随机原则对2011年11月至2012年3月期间在我院骨科住院治疗的54例患者分成两组,对照组接受髓芯减压治疗,治疗组接受髓芯减压联合自体骨髓间充质干细胞移植治疗治疗。结果:术后随访一年,治疗组的Harris评分为(86.78±9.48)分,对照组为(71.18±8.36)分,两组相互比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗组的优良率为84.38%,对照组的优良率为55.17%,治疗组的优良率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:髓芯减压联合自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头无菌性坏死效果显著,优于单纯髓芯减压治疗。

关键词： 骨髓间充质干细胞   干细胞治疗   静脉留置针   心血管疾病   多向分化潜能   护理操作技术   MSCs   静脉输液  

摘要： 骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）是存在于骨髓中除造血干细胞以外的另一类具有“无限”增殖和多向分化潜能的干细胞，是实现糖尿病的自体细胞治疗的一种新型方式。糖尿病已成为人类继心血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病，若将自体MSCs诱导分化为胰岛细胞，可望解决细胞来源和免疫排斥问题。临床上多通过静脉输液输送骨髓间充质干细胞达到体内，此方法是实现治疗目的重要手段之一，也是主要的护理操作技术。对于日常静脉输液的多是为患者采用常规输液方式完成穿刺技术。由于骨髓间充质干细胞为特殊制品，为了安全、准确输入体内，达到有效治疗的目的，笔者采用置入静脉留置针的方法输入骨髓间充质干细胞，效果较好，现报道如下。