关键词： 骨髓间充质干细胞   穴位移植   心肌注射   心肌梗死   心功能  

摘要： 目的：探讨于心肌内注射骨髓间充质干细胞以及通过穴位注射骨髓间充质干细胞这两种移植途径对急性心肌梗死大鼠治疗的对比实验研究，寻求一条治疗急性心肌梗死的新兴、有效的治疗方法。 材料与方法： 1.实验材料及分组： 1.1实验动物：选取60只SD大鼠 1.2分组：将60只大鼠进行随机分组，分为四个小组，分为假手术组、模型组、心肌内注射干细胞组以及穴位注射干细胞组。 1.3造模方法：本实验采用通过对于冠状动脉进行结扎的方法复制急性心肌梗死的模型，结扎大鼠的左冠状动脉前降支，观察心电图：使Ⅱ导联ST段弓背向上抬高，具体方法为：在胸骨左缘第3肋间0.5cm处用剪刀纵向剪开长约1.5cm左右的皮肤组织，用血管钳将肋间外肌和小血管夹断，小弯镊从第3肋两侧肋间隙穿过双股的结扎线，将结扎线两侧钝性分离开，肋间肌并于第3肋骨两端结扎肋间动脉，两侧结扎线的中间剪断第3肋骨向右轻拉扩大视野，将胸膜及心包打开，分离开胸腺组织，在左心耳与肺动脉圆锥之间，找到行于心肌内与心大静脉走向一致的左冠状动脉前降支（LAD）用无创缝合针于左心耳根部下方2mm处穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针，观察心电图，待其恢复稳定15min后，在心脏表面进行结扎，待心脏表面相应区域颜色变暗表明心脏缺血造模成功。 2.移植途径： 2.1穴位注射干细胞组：在急性心肌梗死大鼠造模成功以后，经过72小时，经双侧心俞、至阳、膻中等四个穴位，在每个穴位内注入骨髓间充质干细胞0.3ml。 2.2心肌注射干细胞组:在急性心肌梗死大鼠造模成功以后，经过72小时，进行第二次开胸手术，在直视下于冠状动脉左前降支血管供血区域以及其周边区域对照找出六个点，用微量注射器进行均匀地移植1×1010/L骨髓间充质干细胞1.2mL，在心肌局部呈丘样隆起时，则表示移植干细胞成功。 3.观察指标： 3.1观察大鼠的心脏功能：测量左心室舒张末期直径(LVEDD)、左心室收缩末期直径(LVESD)、左室短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)，取连续3个心动周期的平均值以及抽血行BNP检测以了解大鼠心功能情况。 3.2观察大鼠的血流动力学变化：通过左室压峰值(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室等容期压力最大变化速率(dp/dt)、曲线左室压力对数值变化速率{(dp/dt)·P-1}、血压(BP)、心率(HR)以及计算心脏质量指数(heart mass index，HMI；HMI=心脏重量/体重)、左心室质量指数(left ventricular mass index，LVMI；LVMI=左心室重量/心脏重量)的检测回报来观察大鼠的血流动力学变化情况。 3.3观察大鼠室性心律失常情况：干细胞注射后的7d、14d、28d行心电图检查，观察各组动物之间频发室早(＞5次/分)，成对室早或短阵性室速(＞10次/分)，多源性室早或落在前一心搏的易损期(R波在T波上)的出现情况，监测时间为8h。 3.4大鼠的安全性指标：通过抽血对于包括大鼠血常规、血清蛋白、血清酶谱、血清胆红素、血清肌酐及尿素氮等指标的检查作为了解移植骨髓间充质干细胞的安全性指标。 结果： 1.心功能测定结果表明，心肌内注射干细胞组和穴位注射干细胞组移植成功以后，两者测定值均表现出改善的趋势，进行各组间血浆BNP的水平以及左心室舒张末期直径(LVEDD)、左心室收缩末期直径(LVESD)、左室短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)的测定，两组治疗组与模型组进行比较P<0.05，有统计学意义，心肌内注射干细胞组和穴位注射干细胞两组间比较P>0.05，无统计学意义。 2.血流动力学的检测结果表明，通过LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEDP、HP、SAP、MAP、DAP、HR以及HMI、LVMI的测定值，两组治疗组与模型组进行比较P<0.05，有统计学意义，心肌内注射干细胞组和穴位注射干细胞两组间比较P>0.05，无统计学意义。 3.骨髓间充质干细胞移植治疗组与模型组的室性心律失常的发生率比较P>0.05,无统计学意义。 4.各组实验大鼠间血液常规、血清蛋白、血清酶学、血清胆红素、血清肌酐及尿素氮等统计回报结果比较P>0.05，无明显统计学意义。 5.对于以上各项指标的测定回报研究，心肌注射骨髓间充质干细胞与穴位注射骨髓间充质干细胞两组移植途径对于急性心肌梗死大鼠的治疗比较，两组间无明显差异。 结论： 1.心肌注射与穴位注射骨髓间充质干细胞对于急性心肌梗死大鼠心功能的监测具有改善作用，两组间无明显差异。 2.心肌注射与穴位注射骨髓间充质干细胞对于急性心肌梗死的血流动力学各项指标的具有改善作用，影响两组间无明显差异。

关键词： 急性心肌梗死   阿托伐他汀   间充质干细胞   细胞迁移   CXCR4   通心络   凋亡   信号通路  

摘要： 目的：随着干细胞再生医学不断发展,应用骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)进行急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后心肌修复成为一种有前景的方法。然而干细胞移植进行梗死心肌修复虽然有效,但是疗效有限。其疗效底下的原因之一是干细胞归巢至梗死心肌的数量较少。基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)与其特异性受体趋化因子受体4(CXC chemokine receptor4, CXCIR4)构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在MSCs归巢、定植到损伤部位参与修复的过程中发挥重要作用。既往研究表明,他汀不但能改善梗死微环境促进MSCs存活,而且能增强MSCs的自身抗凋亡能力。然而,他汀能否促进MSCs的迁移和归巢能力尚无相关研究。因此,我们进行此项研究,拟明确阿托伐他汀(atorvastatin, ATV)预处理能否增加MSCs表面CXCR4的表达,并提高MSCs的归巢能力,进而改善心梗后心功能。 方法：实验分为体外实验和体内实验两部分。体外实验部分：分离并培养Sprague-Dawley大鼠MSCs,将第3代细胞随机分为正常对照组、ATV不同浓度梯度组(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)、ATV不同时间梯度组(1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h);机制探讨部分设MSCs组、最适ATV预处理组(ATV-MSCs). MSCs+CXCR4中和抗体组(MSCs-NA)、ATV-MSCs+CXCR4中和抗体组(ATV-MSCs-NA)。流式细胞术和RT-PCR检测各组CXCR4的表达,Transwell小室评估MSCs的迁移能力。体内实验部分：共108只雌性SD大鼠(6-8周龄),随机分为SDF-1动态测定组(AMI30min、1h、12h、24h、48h、72h、5d、7d)、假手术组(Sham)、心梗对照组AMI)、MSCs移植组(MSCs)、ATV预处理MSCs移植组(ATV-MSCs).采用结扎冠状动脉前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后24小时经尾静脉注射MSCs或ATV-MSCs(2x106细胞/只),对照组动物注射等体积PBS。在干细胞移植后3天(基线)及30天(终点)分别行心脏超声检测、病理组织学及分子生物学检测。 结果：体外实验表明,与正常对照组相比,ATV剂量依赖性的增加细胞表面CXCR4表达,以1μM ATV处理组最为明显(14.76±3.05%vs.1.98±0.40%,P<0.001);与正常对照组相比,ATV处理组CXCR4的表达呈一定的时间依赖性,其中ATV处理12小时CXCR4的表达至峰值(22.77±2.03%vs.2.20±0.18%,P<0.001),24小时仍保持在较高水平(20.34±4.13%vs.2.20±0.18%,P<0.001)。CXCR4mRNA的表达趋势与细胞表面CXCR4的表达趋势相似。‘Transwell迁移结果显示,ATV预处理组MSCs向SDF-1迁移的数量是未处理组的2倍左右(24.65±5.57vs.12.70±2.40,P<0.001),然而加入CXCR4的中和抗体后MSCs的迁移能力被抑制。 体内试验发现,干细胞移植后3天,冰冻切片激光共聚焦显微镜下观察到ATV-MSCs组归巢到梗死心肌区域的细胞数明显高于MSCs组(41.68±10.80vs.65.30±13.37,P<0.05),在非梗死区域未发现移植的干细胞;在细胞移植后30天,ATV-MSCs组和MSCs组的存活率都很低,MSCs组的存活率更低。与AMI组相比,MSCs组的左室收缩末期内径和左室射血分数有适度改善。与MSCs组相比,ATV-MSCs组的左室舒张末期内径和左室收缩末期内径进一步减小,左室射血分数(62.28±3.27%vs.52.77±7.05%,P=0.014)和左室短轴缩短率(27.80±2.16%vs.22.27±3.84%,P=0.015)显著改善。组织学分析显示,与AMI组和MSCs组相比,ATV-MSCs组的心肌纤维化面积显著减小,炎细胞浸润明显减轻。Western blot分析显示,细胞移植后3天,ATV-MSCs组IL-6和TNF-α的表达水平明显降低;细胞移植后30天,其表达水平进一步降低。 结论：ATV预处理可以提高MSCs表面CXCR4的表达,进而增强MSCs的迁移和归巢能力,并通过改善梗死心肌中炎性因子的表达,进一步改善心肌梗死后心功能,ATV预处理MSCs可能成为提高干细胞移植疗效的一有效方法。 目的：骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是移植治疗急性心肌梗

关键词： 心肌梗死   再灌注   骨髓间充质干细胞   骨形态发生蛋白-2   干细胞移植  

摘要： 目的 观察骨形态蛋白-2（BMP-2）能否诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌样细胞；观察BMSCs移植治疗大鼠急性缺血梗死再灌注心肌的作用及对大鼠心功能的影响；对比观察经BMP-2预诱导和未经诱导的BMSCs植入急性梗死心肌组织的治疗效果差异，为干细胞临床治疗应用提供实验依据。 方法 采用全骨髓贴壁培养法分离SD大鼠BMSCs进行体外培养扩增；应用免疫细胞荧光法对第4代BMSCs进行鉴定；取第4代BMSCs经BMP-2预诱导培养48H后换液，用常规培养液继续培养；4w后通过免疫细胞化学法对连接蛋白43(CX-43)和心肌特异性肌钙蛋白T(cTNT)的表达分析来鉴定经BMP-2预诱导的BMSCs分化为心肌样的能力；BMSCs DAPI标记并荧光显微镜下观察；局麻下SD大鼠心肌梗死再灌注造模，造模成功大鼠随机分为三组：对照组植入培养基；干细胞组植入经DAPI标记的BMSCs，预诱导组植入DAPI标记的预诱导后的BMSCs；移植后4h、4d、4w心肌取材切片观察DAPI标记的BMSCs植入后的存活及分布情况；移植后4w利用超声检查大鼠LVEF、FS变化情况并通过心肌组织Masson及HE切片染色观察心肌细胞组织病理变化。 结果 BMSCs的形态学观察和鉴定：原代细胞多呈圆形或椭圆形，边界清晰，具有折光性，悬浮于培养液中；3天后绝大部分贴壁生长，呈多边形及圆形、纺锤形等形状，细胞周围可见长短、粗细不一的突起。一周左右，细胞分裂繁殖迅速，体积逐渐变大，数量显著增多，排列不规则，形态类长梭形，呈集落样聚集生长。第4代细胞，体积增大，形态趋近一致、排列较前规整，多呈长梭形，类似成纤维细胞样。预诱导诱导后的细胞生长良好，形态随时间特征逐渐发生变化，诱导第4周，预诱导细胞较同期未诱导细胞明显变宽、体积增大，形态多呈短棒状，排列走形趋向一致，连接紧密，可见肌丝样结构，开始表现出肌细胞的特征。对BMSCs进行鉴定，第4代BMSCs其表面抗原CD90、CD105呈阳性表达，阳性率分别为96.56%和95.46%，造血干细胞的表面抗原CD34、CD45呈阴性表达，为BMSCs特征。 经预诱导BMSCs cTnT和CX43的表达：BMSCs经BMP-2预诱导后4w，荧光显微镜下CX43呈紫红色荧光、同视野cTnT呈绿色荧光，为阳性表达标志，同期未经诱导BMSCs其CX43、cTnT呈阴性表达；BMSCs预诱导后第4周，分化为心肌样细胞。心肌特异蛋白表达阳性。 BMSCs标记情况及植入后跟踪：BMSCs经DAPI标记后，细胞核蓝染，胞浆淡染，标记率100%。经DAPI标记的BMSCs在术后4h，4d，4w,通过荧光显微镜观察心肌组织切片预诱导组及干细胞组均有经DAPI标记的BMSCs存活在梗死心肌组织中，且预诱导组的存活量较干细胞组多。 干细胞移植治疗心肌梗死：干细胞植入后可以在再灌注梗死心肌内环境存活；干细胞移植对于梗死再灌注心肌有治疗作用；与对照组相比干细胞组及预诱导组左心射血分数（LVEF）及左心室缩短分数（FS）均有提高（P<0.01)，且预诱导组更为明显。心肌组织病理切片可知：HE组织染色对照组梗死区炎性细胞浸润最严重,干细胞组炎性细胞浸润较轻。预诱导组炎性细胞浸润最轻。心肌组织切片经Masson染色可见BMSCs移植部位出现胶原纤维组织,对照组梗死区有严重纤维化,梗死呈连续性大片状分布。BMSCs组和预诱导组梗死区纤维化较轻。预诱导组纤维化程度最轻。系统观察4d到4w的切片发现胶原纤维无明显变化，且有移植的细胞成活在胶原纤维中。 结论 体外BMSCs经BMP-2预诱导可向心肌样细胞分化;BMSCs可用来移植治疗急性心肌梗死(AMI）且对再灌注损伤有一定耐受治疗作用，经BMP-2预诱导的干细胞较未诱导的治疗效果理想。

关键词： 颞下颌关节   骨关节炎   动物模型   骨髓间充质干细胞   趋化因子  

摘要： 骨关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的关节疾病，以关节软骨进行性的退变和最终的关节破坏为特征[1]。骨关节炎可造成患者疼痛和运动受限，给患者带来极大的压力。OA的病理机制尚不清楚，多种因素与OA的发生发展有关：创伤、遗传因素、关节位置异常、年龄、营养不良、生物力异常等。OA好发于膝关节、肘关节等负重关节，其中颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）也是OA的好发部位之一。由于早期OA患者的标本难以获得，动物模型研究成为研究OA进展的有效手段。关节软骨的自我修复能力有限，而自我再生的多为纤维软骨，其力学性能较健康的透明软骨差。目前尚缺少能有效逆转或终止OA进展的药物，临床治疗策略仍以止痛、物理治疗、控制炎症反应、减轻病人痛苦、减缓疾病进程等为主。干细胞治疗是近些年备受关注的治疗方法。有关OA软骨的干细胞治疗的临床和动物实验研究主要是应用影像学、功能学、形态学等指标进行简单的疗效评价，尚未见有关于其疗效的系统研究和其机理研究的系统报道。进行干细胞治疗的关键决定因素是干细胞能被受损组织趋化从而迁移至靶组织。靶组织中表达的趋化因子在干细胞的迁移中起了关键作用。趋化因子基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）和RANTES是主要的介导干细胞迁移的分子，但关于SDF-1和RANTES在OA的干细胞治疗中趋化作用的研究还未见报导。本研究在建立了致病作用确切的咬合源性的颞下颌关节骨关节炎小鼠模型的基础上，系统全面地论证了外源性骨髓间充质干细胞（bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，BMSCs）局部注射对颞下颌关节骨关节炎的治疗作用，并从干细胞存活、分化和趋化等方面探索其治疗作用的机制，发现外源性BMSCs局部注射对咬合源性的TMJ OA有积极的治疗效果，且该治疗效果的关键机制是病变髁突高表达趋化因子SDF-1和RANTES，诱导外源性BMSCs迁移并定植于病变髁突中。整个研究分为以下三个部分： 第一部分：单侧前牙反牙合致小鼠颞下颌关节骨关节炎及其机制的实验研究 背景：颞下颌关节紊乱病（Temporomandibular joint disorders，TMD）被认为有多种致病因素，其中咬合因素备受关注。目前，关于咬合是TMD的致病因素还存在很大争议。骨关节炎是TMD的严重的病理变化形式，以软骨退变和软骨下骨异常改建为主要特征。最近，Semaphorin4D（Sema4D）和Plexin-B1被发现可抑制成骨活动，但Sema4D/Plexin-B1在TMJ改建中的表达变化还未见报道。 目的：本研究的目的是建立一个原创性的改变小鼠咬合关系的动物模型，并观察TMJ软骨和软骨下骨的组织学和相关因子的变化，以及Sema4D和Plexin-B1的表达变化。 方法：在小鼠的左侧下颌切牙或上下颌切牙粘接不良修复体，造成左侧切牙的反牙合关系。用HE和甲苯胺蓝染色方法观察TMJ髁突的形态学改变。用组织化学和realtime-PCR手段检测TRAP阳性细胞和M-CSF表达水平，作为破骨活动的指标，成骨活动水平用骨钙素（osteocalcin，OCN）的表达水平来观察。用免疫组织化学和realtime-PCR检测Sema4D和Plexin-B1的表达变化。用双因素的方差分析来比较组间差异。 结果：粘接不良修复体1周和3周后，组织学上观察到软骨的退变和软骨下骨丢失。破骨活动的指标（TRAP阳性细胞数和M-CSF表达水平）在软骨和骨中均增高。OCN在软骨中的表达在3周时升高，但在软骨下骨中在1周时升高，3周时降低。Sema4D在软骨和软骨下骨中的表达在1周时降低，在3周时升高，而Plexin-B1在软骨下骨3周时升高。 结论：单侧前牙反牙合的咬合关系可造成颞下颌关节髁突的异常改建，此过程涉及到软骨退变、成骨和破骨活动的改变，以及Sema4D/Plexin-B1的参与。 第二部分：外源性骨髓间充质干细胞对颞下颌关节骨关节炎的治疗作用 背景：干细胞治疗是目前备受关注的治疗骨关节炎的新方法。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，是治疗骨关节炎的理想种子细胞。尽管有临床和动物研究报道干细胞对骨关节炎有治疗效果，但目前尚没有资料系统全面地评价骨髓间充质干细胞局部注射对骨关节炎的治疗作用，及其相关分子的表达。 目的：本研究拟系统全面地论证外源性骨髓间充质干细胞对颞下颌关节骨关节炎的治疗作用。 方法：观察拆除不良修复体后，颞下颌关节髁突的变化，以确定髁突病变的咬合源性。在造模3周时，开始每周在关节局部注射外源性的GFP-BMSCs，用HE和micro-CT的方法分析软骨和软骨下骨的形态

关键词： 成人骨髓间充质干细胞   激素性股骨头坏死   骨代谢稳态   Wnt通路   骨髓间充质干细胞   激素性股骨头坏死   骨代谢稳态   过甲基化修饰   51-氮杂胞苷   骨髓间充质干细胞   激素性股骨头坏死   表观遗传重编程   Wnt信号通路  

摘要： 目的人体内骨代谢稳态的维持有赖于骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨成脂分化的动态平衡。在外源性糖皮质激素作用下,骨代谢稳态被打破,经各种病理生理变化后逐渐发展为股骨头坏死。本研究旨在调查激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞的数目和功能是否异常,并探讨其中Wnt信号通路的变化情况。 方法选择2011-2012年就诊22例激素性股骨头坏死患者,25例股骨颈骨折患者。经患者知情同意与武汉协和医院伦理委员会审批后,在手术室无菌条件下抽取患者股骨骨髓5ml。经密度梯度离心法体外分离、培养MSCs,贴壁细胞传代,取第三代细胞,流式细胞仪进行表面标记物鉴定。22例患者及25例对照均观察骨髓间充质干细胞的集落形成能力,选取每组年龄相匹配的10例分别检测细胞活力、细胞周期、线粒体膜电位水平、细胞内活性氧水平、细胞成骨和成脂分化能力以及Wnt通路的活性和关键因子的表达水平。 结果激素性股骨头坏死组骨髓间充质干细胞的集落形成能力较股骨颈骨折组显著下降(19.6±7.7vs.262±6.2,P<0.001)。激素性骨坏死组的线粒体膜电位水平明显低于股骨颈骨折组,而活性氧水平高于股骨颈骨折组(P<0.05)。激素性股骨头坏死组骨髓间充质干细胞成骨能力显著低于股骨颈骨折组,而成脂分化能力则显著增强。免疫荧光显示Wnt通路上关键因子FZD1、β-catenin在激素性股骨头坏死MSCs上表达明显减弱,LiCL干预后能上调其表达,Wnt通路拮抗因子DKK1的表达则刚好相反。表明激素性股骨头坏死组MSCs中Wnt通路活性明显受抑制,PCR和western blot结果也证实了这点。 结论激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞数量和功能均下降,Wnt通路活性明显受抑制。激素通过改变骨髓间充质干细胞的生物学性能并最终引起骨代谢失衡、股骨头坏死。 目的表观遗传调控在干细胞分化过程中具有十分重要的作用。干细胞在从全能性至终末分化的每一阶段,都需建立稳定的表观遗传状态。在人类疾病中,研究最多的表观遗传机制是基因组DNA甲基化修饰。本研究观察激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞基因组DNA的甲基化状态及其对MSCs功能失调的影响,并探讨其中的机制。 方法选择2012-2013年就诊20例激素性股骨头坏死患者,22例股骨颈骨折患者。经患者知情同意与武汉协和医院伦理委员会审批后,在手术室无菌条件下抽取患者股骨骨髓5ml。经密度梯度离心法体外分离、培养MSCs,贴壁细胞传代,取第三代细胞,流式细胞仪进行表面标记物鉴定。LUMA技术检测22例患者、20例对照组MSCs及5’-氮杂胞苷(5'-Aza-dC)干预后的MSCs全基因组DNA整体甲基化情况,然后着重对干性基因(Oct、Nanog)和ABCB1基因启动子区CpG岛进行亚硫酸氢盐测序。同时实时定量PCR和WESTERN BLOT检测Oct4、Nanog、ABCB1、Runx2、PPAR-γ/osteocalcin等在转录和翻译水平的表达情况。检测三组细胞增殖能力、线粒体膜电位水平、细胞内活性氧水平、细胞成骨和成脂分化能力。 结果对三组MSCs全基因组DNA整体甲基化情况进行LUMA检测后发现激素性股骨头坏死组MSCs全基因组DNA整体甲基化率要明显高于对照组,5’-氮杂胞苷干预后整体甲基化率降低。亚硫酸氢盐测序进一步显示激素性股骨头坏死组MSCs的Oct4/Nanog和ABCB1基因启动子区的甲基化水平明显高于对照组。15μM5'-Aza-dC能在一定程度上促进激素性骨坏死组MSCs的增殖能力。激素性骨坏死组MSCs的线粒体膜电位水平明显低于股骨颈骨折组,15μM5'-Aza-dC干预后线粒体膜电位明显上升,并且其变化具有浓度依赖性。而活性氧水平高于股骨颈骨折组(P<0.05),15μM5'-Aza-dC干预后活性氧明显降低。15μM5'-Aza-dC能一定程度上恢复激素性股骨头坏死组MSCs成骨与成脂分化的动态失衡。实时定量PCR和WESTERN BLOT检测示：激素性股骨头坏死组MSCs的Oct4、Nanog、ABCB1、Runx2、PPAR-γ、 osteocalcin等基因在转录和翻译水平上较股骨颈骨折组均明显下调,15μM5'-Aza-dC能一定程度上上调这些基因的表达水平。 结论激素性股骨头坏死患者MSCs全基因组DNA存在过甲基化修饰,其中干性基因Oct4、Nanog和ABCB1基因的过甲基化修饰使MSCs丧失干性表型及自我防御能力,进而导致生物学功能失调并最终引起骨代谢失衡,股骨头坏死、塌陷。 目的探讨利用重编程的骨髓间充质干细胞治疗大鼠激素性股骨头坏死的有效性及其机制。 方法

关键词： 骨髓间充质干细胞   心力衰竭   Nkx2.5基因   地黄低聚糖   基因转染  

摘要： 背景：心力衰竭是严重危害人类健康的重要疾病之一。药物、介入及外科心脏移植是目前治疗心力衰竭主要方法，但不能从根本上改善患者的治疗状况，存在很大的局限性。干细胞移植能够再生功能心肌细胞，有望成为治疗心力衰竭的新手段。 目的：研究Nkx2.5基因、地黄低聚糖对骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的影响及机制。 方法：采用全骨髓差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，P3代骨髓间充质干细胞通过慢病毒转染Nkx2.5基因，培养至P5代以Brdu标记骨髓间充质干细胞用于干细胞移植。腹腔注射阿霉素制造心衰动物模型（累积剂量15mk/kg）。模型复制成功后随机分为5组:心衰对照组、骨髓间充质干细胞移植组、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞移植组、地黄低聚糖组、联合治疗组。采用心脏超声检测大鼠的心功能；处死后称取心脏湿重，并计算心脏湿重/体重的比值；心脏标本冰冻切片进行免疫组织化学染色检查；HE常规染色观察心肌的病理改变，Masson染色计算胶原容积分数检测心肌纤维化程度；提取左心室心肌组织的总RNA，实时定量PCR检测大鼠心肌中心肌转录因子MEF2、GATA4，心肌结构蛋白cTnI、CX43，心肌纤维化相关基因TGF-β1、CollagenⅠ的基因表达水平；提取心室心肌组织的总蛋白，Western blot检测MEF2、GATA4、cTnI、CX43的蛋白表达水平。 结果：1.大鼠注射阿霉素后，表现为体重降低，心脏收缩、舒张、泵血功能下降，表明动物复制心衰模型成功。2.大鼠心脏标本Brdu免疫组织化学染色显示骨髓间充质干细胞组、基因转染组、联合组心肌组织中存在干细胞来源的Brdu阳性细胞，说明股静脉注射可以使干细胞归巢进入病变心脏。3.各干预组大鼠体重较心衰组增加，心脏湿重/体重较心衰组改善（P<0.05）。4.与心衰组相比，各干预组左室收缩末直径、容积减小（P<0.05），以联合组的改善最为明显；与心衰组相比，各治疗组FS、EF升高（P<0.05），基因转染组与骨髓间充质干细胞组相比有更大程度的改善（P<0.05），联合组与基因转染组相比FS、EF改善有增大趋势，但无统计学意义（P>0.05）。5.心肌组织HE染色提示：心衰组心肌纤维排列紊乱，部分心肌细胞水肿、脂肪变性，细胞间隙增大，存在局灶性坏死；各治疗组病理改变有所改善，且局部可见较多的毛细血管增生；联合组改善最明显，细胞肿胀减轻，局灶性坏死灶明显减少。6.与正常组相比，心衰组心肌组织胶原容积分数明显升高（P<0.05）；与心衰组相比，各治疗组心肌组织胶原容积分数下降（P<0.05）；基因转染组与骨髓间充质干细胞组心肌组织胶原容积分数无明显差异（P>0.05）；联合组分别与基因转染组、地黄低聚糖组相比下降更为明显（P<0.05）。7.心衰组大鼠TGF-β1、CollagenⅠ的基因表达水平明显升高（P<0.05）；与心衰组相比，各治疗组TGF-β1、CollagenⅠ的表达下降（P<0.05）；联合组分别与基因转染组、地黄低聚糖组相比两基因表达水平明显降低（P<0.05）。8.各实验组心肌组织中特异性结构蛋白cTnI无明显改变。与正常组相比，心衰组CX43基因和蛋白表达水平明显下降（P<0.05）；与心衰组相比，各治疗组CX43表达水平升高（P<0.05）；基因转染组CX43的表达水平较骨髓间充质干细胞组升高更明显（P<0.05）。9.心衰组MEF2、GATA4表达水平较正常组明显下降（P<0.05）；与心衰组相比，各治疗组MEF2、GATA4表达水平升高（P<0.05）；基因转染组MEF2、GATA4表达水平较骨髓间充质干细胞组进一步升高（P<0.05）。 结论： 1.骨髓间充质干细胞、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞、地黄低聚糖与联合治疗均可以有效改善心衰大鼠左室收缩泵血功能，抑制心肌纤维化，改善心室重构，以联合治疗的效果最显著。 2.骨髓间充质干细胞、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞、地黄低聚糖与联合治疗均可改善心衰心肌的病理改变，减少细胞变性坏死，促进局部毛细血管增生，以联合治疗的改善最明显。各治疗组均可提高心衰心肌中CX43的表达水平，Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞与联合治疗提高CX43的效果更明显。 3.骨髓间充质干细胞、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞、地黄低聚糖与联合治疗均可减少心肌组织中胶原蛋白含量，抑制胶原纤维形成，同时降低心衰心肌中TGF-β1、CollagenⅠ的表达水平，其中联合治疗的胶原形成抑制作用最强。 4.骨髓间充质干细胞、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞、地黄低聚糖与联合治疗可增强GATA4、MEF2的表达，发挥改善心功能、抑制心室重构的功能。 5. Nkx2.5基因转染可增强骨髓

关键词： 急性心肌梗死   骨髓间充质干细胞   基质细胞衍生因子1-α   脱细胞基质   临床疗效  

摘要： 前言　　心肌梗死等心血管疾病是一种严重威胁人类生命健康的疾病。随着生活方式的变化，我国冠心病发病率逐年升高。目前临床治疗冠心病有三大方法:药物保守治疗、经皮冠脉支架介入、冠脉搭桥手术。因为心肌的再生能力几乎没有，以上无论哪种方法都无法使梗死心肌恢复收缩功能达到治愈的效果。由于干细胞的多向分化潜能以及无限增殖分裂等特性，近年来，利用干细胞治疗心肌梗死已经成为临床科研的热门领域，以及具有广阔前景的治疗选择。干细胞种类繁多，目前最有希望应用于临床的是骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)和心脏干细胞(cardiacstemcells，CSCs)[1，2,3]。　　BMSCs是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞。由于BMSCs不易引起免疫排斥，易于外源基因的导入和表达，而同时又具有比其他间充质干细胞来源更加广泛、更加易于分离培养、可自体移植等特点，BMSCs治疗越来越受到学者们的青睐，被认为是即将被引入临床治疗的最佳干细胞。但是由于移植的BMSCs局部存活细胞少以及向心肌细胞分化能力低，使得BMSCs应用效果受限。解决这一难题，成为干细胞治疗心梗的关键。　　基质细胞衍生因子（Stromalcellderivedfactor1，SDF-1）是一种G蛋白偶联受体的配体，SDF-1为CXC家族成员。在体内SDF-1的形式主要有两种分别为SDF-1α和SDF-1β，以SDF-1α为主。心肌组织损伤后，外周血中循环干细胞数目明显增多，外周血中的循环干细胞随着血液循环可到达各个组织器官，而最终会在哪个组织器官栖息、增殖分化与SDF-1的作用有关。已有研究证实SDF-1能够促进骨髓干细胞的动员，增强细胞的运动能力和细胞黏附到纤维蛋白、间质和内皮细胞的作用[4]。　　但作为细胞因子的SDF-1α并不稳定，单独应用时，半衰期短，其易被蛋白酶水解，其蛋白水解活性以及在梗死区快速的扩散限制了其生物作用，如果能将SDF-1α控释，使其在梗死区达到稳定的浓度进而延长其针对BMSCs作用时间，这可能是基质细胞衍生因子辅助BMSCs治疗的一个关键。　　目前已有多种生物材料应用于传递生物活性物质研究，纤维蛋白[5，6]、胶原[7，8]人工基底膜[9，10]、藻朊酸盐[11]、自组装肽[12]、壳聚糖[13]等。但这些材料都不能充分的还原天然ECM的结构及化学组成[14]。近期已经开发出来源于自体细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的脱细胞支架组织并应用于细胞工程学[15-18]。这种材料单独注射于小动物的梗死区域后，能够促进细胞的渗透并显示出心梗后的细胞保护作用[19,20]。通过多价粘合剂的肝素介导，ECM与细胞因子共价结合，使其可以作为载体捕捉及释放细胞因子，另外，心脏脱细胞外基质作为模拟原生心肌ECM生物及化学特性的最佳材料[19]，这种渗透性、纤维性的支架组织可以促进缺血区域的渗透性和血管再生[21]。　　由此，本研究将利用心脏脱细胞外基质作为缓释载体，采用体外和体内实验，分三个部分，以脱细胞基质缓释基质细胞衍生因子-1对BMSCs作用作为主要研究内容，研究BMSCs参与心肌再生的机理，尝试不同处理因素干预BMSCs，以增强BMSCs移植的治疗效果，改进干细胞治疗方法。　　关键词:骨髓间充质干细胞;基质细胞衍生因子;脱细胞基质;肝素化;缓释;急性心肌梗死;第一部分脱细胞基质缓释基质细胞衍生因子-1的体外研究　　目的　　用“去细胞化”制备心脏细胞外基质并进行SDF-1α修饰，通过观察SDF-1α的释放规律分析评价心脏脱细胞细胞外基质预载SDF-1α后的缓释情况。　　方法　　离体心脏取自健康成年大耳兔(2.0±0.5kg)，采用1％十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate，SDS)循环灌注的方法得到脱细胞心脏纤维骨架并制成匀浆。利用含有2％肝素、2％EDC及1.2％羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（2-N-morpholoinolethanesulfonicacid，MES）中行肝素固化，进行SDF-1α修饰。利用ELISA测定3h、6h、24h、96h、168h液体浓度绘制释放曲线。　　结果　　通过ELISA计算不同时间点心脏脱细胞释放SDF-1α量，绘制出一条释放曲线。　　结论　　经过ELISA绘制曲线证实，心脏脱细胞外基质通过肝素化摄取并释放SDF-1α，其性质稳定。　　第二部分脱细胞基质缓释SDF-1α联合骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的效果观察　　目的　　动物在体实验采用SDF-1α预载肝素固化的心脏脱细胞细胞外基质与BMSCs共同作用，干预梗死心肌，观察其对梗死心肌的治

关键词： 乳腺增生   骨髓间充质干细胞   WNT   β-catenin   ddk-1  

摘要： 目的：乳腺增生(Hyperplasia of Mammary Gland, HMG)是指乳腺上皮增生又被叫做“乳腺囊性增生症”,是女性常见病、多发病,近年来发病率呈上升趋势。乳腺增生患者有2%的继发癌变率。然而目前对乳腺增生的治疗并不是十分的理想。 本实验经过给已创建乳腺增生模型的大鼠通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells, BMSCs),进而验证间充质干细胞治疗乳腺增生的可行性。采用免疫组化和流式细胞学的方法检测β-catenin蛋白的含量和在细胞内外的表达,探讨间充质干细胞治疗乳腺增生的机制是否为间充质干细胞分泌的dkk-1通过抑制WNT途径中的β-catenin蛋白的表达从而治疗乳腺增生。 方法：将50只SD大鼠等分为正常组、模型组、乳癖消组、三苯氧胺组、BMSCs组每组各10只。模型组、乳癖消组、三苯氧胺组、BMSCs组注射苯甲酸雌二醇与黄体酮建立乳腺增生模型。模型建成后正常组、模型组正常喂养。乳癖消组每天给予乳癖消灌胃共28天,三苯氧胺组给予三苯氧胺灌胃共28天,BMSCs组在第1、8、15、22天分别通过尾静脉注射BMSCs。每周测量右腋下第二对乳头高度及直径。实验结束后经腹主动脉采血检测雌激素和孕激素水平。测量胸腺、脾脏、子宫、卵巢等脏器指数。采用免疫组化和流式细胞学的方法检测β-catenin蛋白的含量和在细胞内外的表达。制作HE切片观察组织细胞的形态。 结果：1乳头直径变化 正常组和模型组治疗前后乳头直径变化较小。BMSCs组经过治疗后乳头直径变化最大,乳癖消组次之,三苯氧胺组变化相对较小。正常组与其它各组均具有统计学差异P<0.05。模型组的改变与其它各组均具有统计学差异P<0.05。BMSCs组与乳癖消组和三苯氧胺组均有统计学差异P<0.05。乳癖消组与三苯氧胺组没有统计学差异P>0.05。提示：BMSCs治疗乳腺增生的效果优于三苯氧胺与乳癖消,三苯氧胺和乳癖消治疗乳腺增生的效果是没有显著差异的。 2乳头高度变化 正常组和模型组治疗前后乳头高度变化较小。BMSCs组经过治疗后乳头高度变化最大,乳癖消组次之,三苯氧胺组变化相对较小。正常组与其它各组均有统计学差异P<0.05。模型组的改变与其它各组均有统计学差异P<0.05。BMSCs组与乳癖消组和三苯氧胺组均有统计学差异P<0.05。乳癖消组与三苯氧胺组没有统计学差异P>0.05。提示：BMSCs治疗乳腺增生的效果优于三苯氧胺与乳癖消,三苯氧胺和乳癖消治疗乳腺增生的效果是没有显著差异的。 3激素水平 雌激素和孕激素各组间均无明显没有统计学差异P>0.05,雌激素与孕激素的比值有统计学差异P<0.05。提示：乳腺增生可能是孕激素和雌激素失调引起的,单独的雌激素与孕激素失调是否是导致乳腺增生的病因还需进一步验证。 4脏器指数 4.1子宫指数 乳腺增生大鼠的子宫指数小于正常大鼠的子宫指数。正常组与各组均有统计学差异P<0.05。模型组与三苯氧胺组有统计学差异P<0.05。乳癖消组与三苯氧胺组有统计学差异P<0.05。三苯氧胺组与BMSCs组有统计学差异P<0.05。提示：乳腺增生大鼠较正常大鼠的子宫质量小。 4.2卵巢指数 乳腺增生大鼠的卵巢指数小于正常大鼠的卵巢指数。正常组与各组均有统计学差异P<0.05。模型组与不不BMSCs组有统计学差异P<0.05。提示：乳腺增生大鼠较正常的大鼠的卵巢质量小。 4.3胸腺指数 各组均无统计学差异P>0.05。提示：乳腺增生对胸腺可能没有影响。 4.4肾上腺指数 正常组与乳癖消组、三苯氧胺组均有统计学差异P<0.05。 5β-catenin表达情况 正常组β-catenin含量最低。BMSCs组和模型组β-catenin含量高。三苯氧胺组和乳癖消组的β-catenin含量低。BMSCs组分别与正常组、三苯氧胺组有统计学差异P<0.05。BMSCs组与模型组、乳癖消组无统计学差异P>0.05。三苯氧胺组与乳癖消组没有统计学差异P>0.05。提示：间充质干细胞并不影响β-catenin蛋白在乳腺组织中的表达。 6β-catenin的免疫组化情况 β-catenin在正常组为细胞膜染色,β-catenin在模型组为细胞浆和细胞核染色,β-catenin在乳癖消组为细胞浆染色,在三苯氧胺组β-catenin为细胞浆染色,在BMSCs组β-catenin为细胞浆和细胞核染色。其中模型组和BMSCs组的染色程度相似,乳癖消组和三苯氧胺组的染色程度相似。提示：间充质干细胞其实不影响β-catenin蛋白在乳腺组织中的表达。 7显微镜下组织细胞形态学

关键词： 自身免疫性肝炎   骨髓间充质干细胞   动物模型   C57BL/6小鼠   细胞移植   示踪   免疫调节  

摘要： 目的 自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是一种病因不明的肝脏慢性炎症性疾病。目前,AIH的治疗主要是应用免疫抑制剂如糖皮质激素,它可单独应用也可与硫唑嘌呤联合应用,但这种治疗方案的完全缓解率并不高,且长期服药存在较多副作用,因此迫切需要寻找和探讨新的有效治疗方法.骨髓间充质干细胞(Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)是来源于骨髓中的一种多能干细胞,具有多方向分化的潜能及强大的免疫调节作用,大量动物实验和临床研究证实BMMSCs对多种自身免疫性疾病都有很好的治疗作用。本实验以刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)诱导小鼠建立AIH模型,通过尾静脉途径移植氯甲基苯甲酰胺(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine,CM-Di1)标记的BMMSCs,观察其在AIH中的治疗效果,以及移植后细胞在肝组织内存活、分布情况,并对其可能的治疗机制进行探讨,为临床BMMSCs的应用提供实验基础。 材料和方法 1.小鼠BMMSCs的分离、培养、鉴定及体外标记采用全骨髓贴壁法体外分离C57BL/6、鼠的BMMSCs,并进行传代培养。采取第三代BMMSCs,应用流式细胞仪检测其细胞表型,并采用茜素红染色鉴定其骨向分化能力,以油红0染色鉴定其脂向分化能力。体外应用CM-Dil荧光染料标记第三代BMMSCs,荧光显微镜下观察细胞标记率。 ***模型小鼠的建立将C57BL/6小鼠随机分为4组,分别为实验A、B、和C组及正常对照组。A组、B组和C组分别由尾静脉注射ConA10mg/kg-1、15mg/kg-1和20mg/kg,而正常对照组由尾静脉注射等体积的磷酸盐缓冲液。于注射后8h取血清检测谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平；取肝脏制作病理切片,根据Knodell肝炎活动指数评分系统对肝组织的炎症程度作出评分；取实验组小鼠心、脾、肺等组织观察有无炎症反应。 3. BMMSCs肝组织中的分布情况及对AIH的治疗效果由尾静脉注射移植CM-Dil标记的BMMSCs,依据不同细胞量,将C57BL/6小鼠AIH模型组分为4组,尾静脉输注ConA,30min后移植CM-Dil标记的BMMSCs。模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、模型Ⅲ组和模型Ⅳ组移植的细胞量分别为1×105,5×105,1×106,1×107；而空白对照组尾静脉输注ConA,30min后注入等体积的磷酸盐缓冲液。24h后处死小鼠,取血清标本检测ALT、AST及肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、干扰素γ (Interferon-γ, IFN-γ)及白细胞介素(Interleukin-4, IL-4)的水平；取肝组织行病理检查其炎症程度并作出Knodell评分；取模型组心、肝、脾、肺组织在荧光显微镜下观察切片组织荧光分布情况。 结果 1.小鼠BMMSCs原代培养在接种48h后可见贴壁细胞,培养到第三代细胞形态趋于统一,细胞排列呈束状、漩涡状或放射状。流式细胞仪检测BMMSCs的表面特异性抗原,结果显示CD29、CD90呈阳性表达,CD34呈阴性表达；经诱导后茜素红染色、油红0染色均呈阳性,符合BMMSCs的特征。体外应用CM-Dil荧光染料标记第三代BMMSCs,24h后荧光显微镜下观察可见CM-Dil标记在细胞膜上发红色荧光,且标记率达90%以上。 2.给以不同剂量的ConA后,A组、B组和C组血清ALT、AST的水平及Knodell评分均明显高于对照组(P<0.05),且随着ConA注射剂量的增加,上述各项检测指标均有增高(P<0.05)。实验组小鼠除肝组织病理可见肝损害,呈炎症改变以外,心、肺、脾未见损伤。 ***移植治疗后,模型Ⅳ组小鼠有4只死亡,其余各组小鼠未见死亡。24h后模型Ⅱ组、模型Ⅲ组小鼠血清ALT、AST的水平及Knodell评分均明显低于空白对照组(P<0.05)；模型Ⅰ组与空白对照组之间比较上述指标无显著性差异(P>0.05)。模型Ⅱ组、模型Ⅲ组小鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4的水平明显低于空白对照组(P<0.05)；模型Ⅰ组与空白对照组之间比较上述指标无显著性差异(P>0.05)。荧光显微镜下在受损的肝组织内可观察到植入的BMMSCs,而在心、脾、肺等重要脏器并未观察到标记的BMMSCs。 结论 1.小鼠的BMMSCs可采用全骨髓贴壁法在体外分离、培养、传代、扩增。新型荧光染料CM-Dil体外标记BM

关键词： 骨髓间充质干细胞   Mash1基因   移植   癫痫   γ-氨基丁酸   分化  

摘要： 癫痫是发病率最高的中枢神经系统功能障碍，表现为慢性、反复发作的大脑神经元异常放电。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）的数据显示，全球癫痫患者约为五千万至一亿，并且全球约5%的人群一生中具有罹患癫痫的风险。癫痫患者中有约30%行药物治疗效果欠佳，而药物治疗之外的手术治疗以及神经电刺激治疗（迷走神经电刺激术（vagus nerve stimulation, VNS）、脑深部电刺激治疗（deepbrain stimulation, DBS））等并不适合于所有癫痫患者特别是无手术指征者，因此，有必要寻找更有效、安全、持久的新治疗方法。 脑内伽马氨基丁酸（gamma-amino butyric acid, GABA）能神经元减少会导致癫痫是目前了解的可能核心机制。研究显示，源自不同类别干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）、神经干细胞（neural stem cells, NSCs）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）等）的GABA能神经元可以抑制痫性发作、延长模型动物生存期，因此，大量学者把目光聚焦于基于干细胞的癫痫治疗策略。但细胞来源无法满足需求成为个中羁绊。 间充质干细胞因具有自我更新和多向分化潜能的特性使其成为细胞治疗策略的优良候选细胞并逐渐成为热点。作为间充质干细胞中的一员，骨髓间充质干细胞（bone morrow mesenchymal stem cells, BMSCs）来源于骨髓，它在人体内分布广泛，易于提取、分离，而且在应用于自体时不存在免疫排斥以及伦理学障碍，有研究显示BMSCs移植治疗可以抑制癫痫动物模型的自发性痫性发作（spontaneous recurrentseizure, SRS）的频率。使用其进行移植治疗并使之与宿主神经元形成突触联系帮助其功能重建是有可能实现的。但针对在癫痫模型中起关键作用的GABA能神经元的间充质干细胞来源的特异性分化以及用其治疗癫痫以促进疗效的研究很少。尽管有研究显示BMSCs可以经条件诱导培养向GABA能神经元样细胞分化，但需使用化学成分（如氯化钾（potassium chloride，Kcl），β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol, BME），维甲酸（retinoic acid， RA）等）或细胞因子（如碱性成纤维细胞生长因子）等，上述方案如果应用于体内则不仅难以实现而且可能产生无法预期的副作用。 碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）基因在干细胞的增殖与分化过程中起着重要的作用，其中，促分化转录因子哺乳动物无刚毛-鳞甲同源物（mammalian achaete-scute homologue，Mash1）基因作为bHLH家族中的一员，它不仅启动神经干细胞分化成神经元的过程，而且同时决定着神经元亚型的形成，与GABA能神经元的分化形成有着密切的关系。本研究假设，过表达BMSCs中的Mash1基因将可促进其向GABA能神经元样细胞分化。本研究采用慢病毒转染技术使BMSCs过表达Mash1基因，通过条件诱导培养技术诱导分化为GABA能神经元样细胞，对比BMSCs和Mash1过表达的BMSCs向GABA能神经元样细胞分化的比率以验证假设，并且将Mash1过表达的BMSCs移植入癫痫大鼠模型体内，观察其是否具有更进一步抑制癫痫的治疗效果。 第一部分大鼠来源的骨髓间充质干细胞的提取、体外分离、培养和鉴定 目的：建立成熟高效的提取、分离与鉴定BMSCs的方法。 方法：无菌手术取材2～3周龄大鼠的双侧股骨与胫骨，提取骨髓，分别使用全骨髓贴壁培养法和应用Histopaque分离液的密度梯度离心分离法分离细胞并培养，采用流式细胞仪鉴定细胞表面分子标记并通过成脂肪、软骨、骨诱导分化鉴定其多向分化潜能，使用噻唑蓝（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）检测增殖曲线。 结果：与全骨髓贴壁培养法相比，密度梯度分离法获得的BMSCs杂质细胞少、细胞形态更标准并且均一，增殖曲线标准（接种第1～3天处于潜伏期，随后进入对数生长期，至第7～9天时进入平台期），同时细胞表面分子标记表达（密度梯度分离法提取并传代得到的用于本实验研究的P3（passage3）代BMSCs低表达CD34抗原（（1.79±0.23）%，图4-A）并且高表达CD105抗原（（98.6±0.68）%，图4-B）、CD90抗原（（98.5±1.02）%，图4-C）和CD73抗原（（98.8±0.98）%，图4-D）及多向分化潜能均符合国际统一规范。