关键词： 缺血再灌注   脑梗死   骨髓间充质干细胞   移植   凋亡   动物模型  

摘要： 目的:探讨大鼠缺血再灌注(ischemia-reperfusion)6小时分别经动、静脉途径移植骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)后,对血清肿瘤坏死因子(TNF-α)水平;缺血半暗带处星形胶质细胞(GFAP)、血管内皮生长因子(VEGF)、B淋巴细胞瘤-2基因蛋白(Bcl-2)、bcl-2相关x蛋白(Bax)、凋亡细胞数、神经功能缺损评分(mNSS)和体重计数的影响以及干细胞在器官分布有无差异,初步探讨BMSCs治疗急性脑梗死的具体机制和比较动、静脉移植途径差异。方法:1、采用改良线栓法栓塞阻隔大鼠大脑中动脉供血供氧,制作MCAO模型。2、采用全骨髓贴壁分离法提取、提纯和扩增培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测鉴定细胞表面抗原,氯甲基苯甲酰胺(CM-dil)染色标记BMSCs以示踪。3、MCAO6小时后分别经颈动脉、尾静脉途径移植等剂量的BMSCs和被标记的BMSCs。4、移植后第7天观察记录神经功能缺损评分和体重计数。5、酶联免疫吸附剂测定血清TNF-α水平。6、免疫组化测定GFAP、VEGF、Bcl-2和Bax表达。7、原位末端标记法测定缺血半暗带处凋亡细胞数。8、荧光观察BMSCs在脑组织、肺脏、脾脏、肝脏、肾脏和心脏的分布差异。结果:1、流式细胞仪检测细胞表面抗原结果示:CD90表达率为95.7%、CD29表达率为97.3%、CD106表达率为52.7%、CD11b表达率为6.01%、CD34表达率为2.95%、CD45表达率为2.26%。2、颈动脉BMSCs组mNSS评分显著小于颈动脉PBS组,尾静脉BMSCs组mNSS评分显著小于尾静脉PBS组,颈动脉BMSCs和尾静脉BMSCs组相比较mnss评分无差异;颈动脉bmscs体重计数显著大于颈动脉pbs组,尾静脉bmscs组体重计数显著大于尾静脉pbs组,颈动脉bmscs和尾静脉pbs组体重计数比较无差异。3、gfap阳性细胞主要集中在梗死中心周边缺血半暗带处,移植组阳性细胞数显著大于pbs组,颈动脉bmscs组和尾静脉bmscs组相比较无差异。vegf阳性细胞数在缺血半暗带处强表达,尾静脉bmscs组阳性表达强于尾静脉pbs组,颈动脉bmscs和颈动脉pbs组阳性表达无差异,但颈动脉bmscs组有增高趋势,颈动脉bmscs组和尾静脉bmscs组阳性表达无差异。4、vegf在尾静脉bmscs组显著大于尾静脉pbs组,颈动脉bmscs组和颈动脉pbs组无统计学差异,但颈动脉bmscs组有增高趋势,颈动脉bmscs组和尾静脉bmscs组无统计学差异。5、bcl-2阳性细胞普遍见于梗死侧和健侧大脑半球,脑梗死缺血半暗带处阳性表达最为强烈。暂且不论移植途径差异,bmscs组阳性细胞累积光密度值显著多于pbs组。颈动脉bmscs组和尾静脉bmscs组阳性细胞累积光密度值无差异。bax阳性细胞主要集中表达于缺血半暗带处,颈动脉bmscs组、尾静脉bmscs组、颈动脉pbs组和尾静脉pbs组阳性细胞累积光密度值比较无差异。6、颈动脉bmscs组血清tnf-α浓度值显著低于颈动脉pbs组,尾静脉bmscs组显著低于尾静脉pbs组,颈动脉bmscs组和尾静脉bmscs组血清tnf-浓度值无统计学差异,颈动脉pbs组较尾静脉pbs组血清tnf-α浓度值有增高趋势,但无统计学差异。7、凋亡细胞主要出现在缺血半暗带处,健侧未见阳性细胞。bmscs组凋亡细胞数显著小于pbs组,颈动脉bmscs组和尾静脉bmscs组阳性细胞数无差异。8、示踪标记的bmscs主要集中于肺脏和脾脏,梗死周围组织可见干细胞分布,健侧未见;肝脏和肾脏干细胞分布较少,心脏未见干细胞荧光信号,颈动脉bmscs组和尾静脉bmscs组中同一器官干细胞分布数量无统计学差异。结论:bmscs可通过增强gfap、vegf的表达,维持神经血管单元的完整性,增加bcl-2的表达、减少凋亡细胞数,降低炎症因子tnf-α水平,以促进缺血再灌注后神经功能的恢复。在缺血再灌注6小时经颈动脉和尾静脉途径移植bmscs后干细胞在各器官分布和疗效无差异。但尾静脉途径创伤微小,可接受细胞量多,为脑梗死早期最佳移植途径。

关键词： 冠心病   心肌梗死   骨髓间充质干细胞   细胞因子  

摘要： 目的:骨髓间充质干细胞(MSC)治疗心肌梗死(MI)是MI治疗可选择的治疗手段之一,MSC可以通过旁分泌机制分泌多种细胞因子,发挥其抑制凋亡、促进血管新生、调节心室重塑、改善心脏功能的作用。与MSC移植治疗MI的动物实验不同,其临床试验的效果并不确切。其原因可能是临床患者常合并其他疾病,如糖尿病等。目前关于糖尿病人的MSC的生物学特性及其基因表达差异尚无报道。本研究的目的是比较糖尿病来源与非糖尿病来源的MSC在基因表达方面存在的差异,及其在治疗心肌梗死方面的差异,发现可能引起这些差异的关键细胞因子(Bcl-2、Bcl-x L),并验证通过MSC修饰Bcl-x L是否可以增加MSC的存活率、改善心脏功能。方法:本实验通过Affymetrix全基因组基因芯片技术进行MSC功能基因表达谱分析,以期发现冠心病合并糖尿病(CAD+DM)患者与冠心病非糖尿病(CAD)患者MSC基因表达的差异。并通过慢病毒转染基因修饰MSC的方式研究h Bcl-x L在增加MSC在心肌梗死区域存活率、促进血管新生、抑制凋亡、改善心脏功能等方面的作用。主要内容包括三部分:1、冠状动脉旁路移植(CABG)术中获取患者骨髓,体外扩增MSC,收集第3代细胞进行流式细胞仪筛选鉴定、绘制生长曲线、提取RNA制作基因芯片、比较基因表达差异。2、CAD+DM与CAD患者MSC移植到大鼠心肌梗死区域,观察其对于心肌梗死的治疗作用(抑制凋亡、改善心脏功能),以及Bcl-2、VEGF等表达情况。3、应用慢病毒载体转染系统转染h Bcl-XL-IRES2-EGFP融合基因达到过表达,同时单独转IRES2-EGFP作为对照。通过荧光显微镜、WB方法验证病毒转染效率;流式细胞技术测定是否增强细胞抗凋亡的能力、ELISA测定MSC在低氧培养基上清中细胞因子变化,确定基因修饰后细胞分泌功能的变化。进而进行治疗心肌梗死的动物实验,观察是否能够提高MSC在梗死区的存活率、抑制梗死区域的细胞凋亡、减少瘢痕形成、促进血管新生、改善心脏功能。结果:1、糖尿病患者来源的MSC具有MSC的生物学特性:表达CD29、CD44;不表达CD34、CD45,体外培养发现其增殖能力显著低于非糖尿病患者来源的MSC;2、Affymetrix基因芯片证实:CAD+DM组与CAD组MSC相比较,功能蛋白表达基因中涉及细胞凋亡、细胞因子、细胞内信号传导系统的基因有27个,其中13个基因表达明显上调,分别为TNFRSF10B、TNFRSF21、NGF、CAV2、ITGA8、TNS1、ITGA2、AKT3、MBP、MAP2、INHBA、FST、PLA2G5;有14个基因表达明显下调EPR1、BIRC5HELLS、BCL2、HGF、CASP1、SEPP1、ITGA9、MAP2K6RUNX3、TGFBR2、RUNX2、CTNNB1、CDC42。3、CAD+DM组与CAD组MSC细胞移植到大鼠心肌梗死边缘区均能显著抑制心肌细胞凋亡、改善心脏收缩功能,但CAD+DM组这些作用与CAD组相比显著降低,可能与CAD+DM组移植后Bcl-2表达显著低于CAD组有关。4、慢病毒可以安全、有效的转染h Bcl-x L-IRES-EGFP融合基因、IRES-EGFP融合基因到MSC内,EGFP的共转染可以确定转染效率并测定后续动物实验中MSC的存活率。研究显示,病毒转染未影响MSC的生物学特性,过表达h Bcl-x L可以增加MSC分泌细胞因子和抗凋亡能力,Western Blot检测、Annexin V/PI检测、ELISA检测显示,h Bcl-x L基因修饰的MSC表达h Bcl-x L显著增加、抗凋亡能力增强、分泌VEGF、IGF-1、PDGF等细胞因子增加(p<0.05)。5、h Bcl-x L基因修饰的MSC移植治疗心肌梗死的在体实验提示:过表达h Bcl-x L的MSC在移植区域的存活率提高、可以显著降低梗死边缘区心肌细胞凋亡、促进毛细血管新生、减少瘢痕组织形成、改善心脏功能(p<0.05)。结论:1、糖尿病来源的MSC在细胞增殖等方面与非糖尿病来源的MSC存在显著差异,两者存在基因表达差异,其Bcl-2表达显著降低;2、糖尿病来源的MSC治疗大鼠心肌梗死疗效与非糖尿病来源的MSC相比显著降低;3、应用慢病毒转染系统转染使MSC高表达Bcl-x L后可以显著提高MSC在低氧条件下的抗凋亡能力、显著增加VEGF、IGF-1、PDGF等细胞因子的分泌。4、高表达Bcl-x L的MSC移植到心肌梗死区域可以显著提高MSC的存活率、抑制细胞凋亡、促进血管新生、抑制瘢痕形成、改善心脏功能。

关键词： 异基因造血干细胞移植   慢性广泛性皮肤移植物抗宿主病   骨髓间充质干细胞   临床疗效  

摘要： 目的：通过前瞻性随机对照试验观察骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stromal Cells, MSCs)用于治疗糖皮质激素耐药的广泛性皮肤慢性移植物抗宿主病(Chronic Graft-Versus-Host Disease, cGVHD)患者的临床疗效及安全性。 方法：收集浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心共24例异基因造血干细胞移植后合并慢性广泛性皮肤移植物抗宿主病并经过常规免疫抑制治疗3个月及以上临床症状无明显改善的cGVHD患者,通过随机数字方法对其进行分组,8例对照组病人继续原有的免疫抑制治疗,16例试验组病人在原有的免疫抑制治疗基础上联合MSCs输注；随访时间为2011年1月至2014年12月,期间通过观察比较两组患者病变皮肤改善状况、临床症状缓解率、不良反应的发生以及总体生存率(Overall Survival,OS)、治疗相关死亡率(Treatment Related Mortality, TRM)、无进展生存率(Progression Free Survival, PFS)等来评价MSCs的临床治疗疗效及安全性。病变皮肤改善状况通过改良的皮肤厚度评分(Modified Rodnan Skin Score, MRSS)、病变累及的体表面积(Body Surface Area, BSA)百分比以及卡氏行为状态评分(Karnofsky Performance Score, KPS)进行评估。不良反应包括皮疹、发热、氧饱和度改变等输注相关反应、继发感染及严重不良事件。 结果：试验组皮肤病变程度较前好转,MSCs输注后1月、2月、3月、6月、12月患者的KPS分别为60.00±13.66、63.13±11.38、65.63-12.09、66.92±11.82、68.18±14.71,3个月KPS与输注前(58.75±12.58)对比有显著性差异(P=0.013)。MSCs输注后1月、2月、3月、6月、12月患者的MRSS分别为20.00±11.25、18.62±10.72、18.06±9.25、16.38±8.69、15.82±±9.78,3月、6月、12月MRSS与输注前(22.63±11.65)对比有统计学差异(P<0.05)。MSCs输注后1月、2月、3月、6月、12月患者的BSA(%)分别为66.19±28.77、64.94±30.65、63.81±±31.60、60.92±30.70、58.64±29.03, MSCs输注后12月BSA%与输注前(68.88±30.03)对比有显著性差异(P=0.039)；患者出现症状改善时间从1个月至6个月不等。对照组总有效率25%(2/8)；试验组总有效率87.5%(14/16),其中疗效评估达到部分缓解的有37.5%(6/16)；两组间有显著性差异(P=0.04)。试验组和对照组移植后1年OS分别为93.75%、87.5%,2年OS分别为87.5%、87.5%；1年PFS分别为93.75%、87.5%,2年PFS分别为87.5%、87.5%；1年TRM分别为6.25%、12.5%,2年TRM分别为12.5%、12.5%；两组数据均无统计学差异(P>0.05)。MSCs输注期间1例出现水痘病毒感染,1例出现充血性皮疹,1例合并肺部感染,1例合并口腔溃疡明显,经积极对症处理后均完全康复。对照组随访期间1例合并肺部感染,1例合并肠道感染,经积极对症处理后均完全康复。随访至2014.12.31,试验组有2例患者、对照组有1例患者因移植相关并发症死亡。 结论：输注骨髓间充质干细胞能够改善糖皮质激素耐药的广泛皮肤慢性移植物抗宿主病的临床症状且不增加血液系统恶性疾病的复发率,安全性好,是治疗cGVHD的新途径。MSCs作用的持久性以及输注时间、剂量、途径等仍需进一步探索,其在临床治疗移植物抗宿主病中有广阔的应用前景。

关键词： 膝关节   骨关节炎   骨髓间充质干细胞   临床疗效  

摘要： 目的本研究的目的在于评估早期膝骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)患者接受关节腔内注射自体骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的临床疗效。分析自体BMSCs对膝骨性关节炎的影响,为临床寻求治疗早期膝骨性关节炎提供一种新的思路与方法。方法纳入对象为河南省人民医院自2013年9月至2014年7月间收治的10例早期膝骨性关节炎患者,符合中华骨科杂志2007版的骨性关节炎诊治指南的诊断标准,其中男性4例,女性6例,平均年龄48.4岁(从42—57岁),就诊前病程3个月—23个月,平均10.6个月,患者膝关节有行走或上下楼疼痛、僵硬、摩擦感、下蹲受限等症状。入院后常规检查,与患者充分沟通,排除有重要脏器严重器质性病变、血液系统特别是凝血功能异常、精神心理疾病等情况的患者。然后在消毒室中行骨髓穿刺术,经患者髂后上棘处穿刺抽取骨髓约100ml,在实验室中分离出骨髓间充质干细胞,并培养扩增至107个水平(从0.92×107个到1.13×107个),后经皮注射入患膝关节中。治疗后分别在1个月、3个月、6个月时予以定期随访,随访标准参照膝关节损伤和骨关节炎结果评分(Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score,KOOS),Lysholm评分,视觉模拟评分法(Visual Analogue Scale,VAS)来评估膝关节疼痛,并在末次随访中调查患者满意度。结果治疗后所纳入研究的患者均获得随访,没有不良事件的发生。在末次随访中,7例患者症状显著减轻,2例好转,KOOS平均评分从治疗前的61.19分到6个月随访时的78.62分。Lysholm评分从治疗前的49.64分到6个月随访时的86.70分,VAS评分也从治疗前的4.5分到研究最终为1.9分。治疗前、后KOOS评分、Lysholm评分及VAS评分对比具有统计学意义(P<0.05)。结论膝关节腔内注射由自体髂骨获取的骨髓间充质干细胞能减轻早期膝骨性关节炎患者疼痛、肿胀、僵硬等症状,有助于提高膝关节的功能,治疗早期膝关节OA是有效的。

关键词： MESENCHYMAL stem cells   ENDOTHELIAL cells   STEM cell treatment   HYPERTENSION -- Treatment   MICROCIRCULATION disorders   NEOVASCULARIZATION   TREATMENT  

摘要： Systemic arterial hypertension (SAH), a clinical syndrome characterized by persistent elevation of arterial pressure, is often associated with abnormalities such as microvascular rarefaction, defective angiogenesis, and endothelial dysfunction. Mesenchymal stem cells (MSCs), which normally induce angiogenesis and improve endothelial function, are defective in SAH. The central aim of this study was to evaluate whether priming of MSCs with endothelial growth medium (EGM-2) increases their therapeutic effects in spontaneously hypertensive rats (SHRs). Adult female SHRs were administered an intraperitoneal injection of vehicle solution (n = 10), MSCs cultured in conventional medium (DMEM plus 10% FBS, n = 11), or MSCs cultured in conventional medium followed by 72 hours in EGM-2 (pMSC, n = 10). Priming of the MSCs reduced the basal cell death rate in vitro. The administration of pMSCs significantly induced a prolonged reduction (10 days) in arterial pressure, a decrease in cardiac hypertrophy, an improvement in endothelium-dependent vasodilation response to acetylcholine, and an increase in skeletal muscle microvascular density compared to the vehicle and MSC groups. The transplanted cells were rarely found in the hearts and kidneys. Taken together, our findings indicate that priming of MSCs boosts stem cell therapy for the treatment of SAH.

关键词： 干细胞   骨髓干细胞   鼻内移植途径   骨髓间充质干细胞   干细胞移植  

摘要： 背景:动物实验发现骨髓间充质干细胞移植后可促进脑损伤的修复。目的:综述经鼻内途径移植骨髓间充质干细胞到颅内的现状。方法:应用计算机检索1999年1月至2014年1月PubMed相关文章,检索词为"bone marrow mesenchymal stem cell,brain injury,transplantation",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索1999年1月至2014年1月万方数据库相关文章,检索词为"骨髓间充质干细胞、脑损伤、移植",并限定文章语言种类为中文,最终纳入符合标准的文献38篇。结果与结论:近年来,较多的研究证实骨髓间充质干细胞移植能明显改善脑损伤模型动物的脑神经功能。许多研究者对移植的方法和途径进行了细致的研究和探索,并取得了多方面的进展。文章比较了骨髓间充质干细胞进入颅内的不同移植途径,重点从鼻黏膜的处理、移植入脑的路径、干细胞的标记与颅内观察、动物实验4个方面对经鼻内移植的途径进行了介绍,可见经鼻内途径将骨髓间充质干细胞移植到颅内,作为一种非侵袭性移植方法是具有广阔应用前景的。

关键词： 骨髓间充质干细胞   重型脑外伤   大鼠  

摘要： 目的比较不同数量骨髓间充质干细胞治疗重型脑外伤的疗效。方法 48只成年SD大鼠随机分为3组治疗组和1组对照组,采用改良的Feeney氏法建立大鼠创伤性脑损伤模型,外伤后注射5×105(A组),2×106(B组),1×106(C组)BMSCs;采用行为测试试验评分观察肢体功能恢复,采用免疫组化法观察并比较4组大鼠制模后海马齿状回及损伤区域Brd U阳性细胞的表达。结果 A、B、C组前肢放置试验和平衡试验评分均优于对照组,C组优于A、B组(P<0.05)。A、B、C组中大鼠海马和损伤区域出现的Brd U阳性细胞数明显多于对照组,C多于A、B组(P<0.05)。结论三个治疗组均可促进肢体功能的恢复,但1×106治疗组治疗效果最为明显。

关键词： 干细胞   移植   肾缺血再灌注损伤   骨髓间充质干细胞   CD4+CD25+T细胞   免疫调节   动物模型  

摘要： 背景:干细胞治疗肾缺血再灌注损伤一直是众多学者研究的热点,其机制相当复杂,不能用单纯的干细胞分化机制来解释,是多种机制共同参与的结果。目的:探讨骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤时对免疫细胞的影响,从而初步总结骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的免疫调节机制。方法:首先建立SD大鼠肾缺血再灌注损伤模型,将体外培养纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞移植入模型体内,采用流式细胞仪检测技术,分析大鼠脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的比例,探讨骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤时对免疫细胞的影响,然后将上述受体SD大鼠的脾细胞移植到裸鼠体内,再使该裸鼠经历肾缺血再灌注损伤,监测裸鼠肾损伤前后肾功能和肾脏组织学变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞移植能够明显抑制肾缺血再灌注损伤导致的大鼠脾细胞CD4+CD25+调节性T细胞比例的降低;移植此组大鼠的脾细胞给裸鼠,可以明显保护裸鼠肾缺血再灌注损伤,表现为血清肌酐和尿素氮的降低以及肾小管病理损伤评分降低。因此,骨髓间充质干细胞可以通过调节免疫系统来治疗肾缺血再灌注损伤。

关键词： SDF-1/CXCR4信号轴   心力衰竭   骨髓间充质干细胞  

摘要： 心力衰竭(heart failure,HF)是由多种心血管疾病所致心脏泵血功能障碍的一类临床常见危重症。目前逐渐兴起的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)移植对HF的治疗带来希望,但由于植入细胞存活率低、迁移能力及心肌修复能力弱而削弱了其治疗效应。通过激活基质细胞衍生因子1/CXC族趋化因子受体4(SDF-1/CXCR4)信号轴可有效地解决上述问题。因此,SDF-1/CXCR4信号轴介导的BMMSCs移植可能成为HF治疗的新方向。

关键词： 干细胞   骨髓干细胞   线粒体转移   骨髓间充质干细胞   连接管道   Miro1   急性肺损伤   国家自然科学基金  

摘要： 背景:骨髓间充质干细胞对多种疾病具有治疗价值,其治疗疾病的线粒体转移机制是近年来被提出的新概念,具体作用机制及调控因素尚不明确。目的:对现有关于干细胞及线粒体转移相关文章进行综述,并对其未来临床实际应用进行展望。方法:第一作者应用计算机检索PubMed数据、维普、万方数据库中所有关于干细胞与线粒体转移相关文章。中文检索词为"干细胞、胚胎干细胞、祖细胞、线粒体",英文检索词为"Stem Cell[s],Mother cell[s],Progenitor cell[s],Colony-Forming Unit[s],Colony Forming Unit[s],Mitochondria[l]transfer",共检索到13篇文章,结合引文追踪法共纳入42篇文章进行综述。结果与结论:骨髓间充质干细胞可以将具有正常功能的线粒体转移至损伤细胞,重建其有氧呼吸功能。细胞间通过形成连接管道结构进行线粒体转移,线粒体转移具有一定方向性。钙敏感性衔接蛋白Miro1对线粒体转移具有加速与引导作用。线粒体的成功转移可能伴随受体细胞内损伤线粒体的清除。早期防止线粒体损伤可能对包括急性肺损伤在内的很多疾病具有治疗意义。