关键词： 急性肝衰竭   骨髓间充质干细胞治疗   肝细胞   细胞凋亡   细胞增殖  

摘要： 目的:　　急性肝衰竭(ALF)是由多种因素引起的突然而严重的肝脏损伤，常会导致肝脏代谢紊乱、合成解毒功能障碍，最终发展为肝性脑病、凝血障碍甚至多器官衰竭。尽管急性肝衰竭发病率不高，但疾病凶险死亡率高，经济负担重且主要发病人群为青壮年。肝脏移植是目前最有效的治疗方法，但由于肝源短缺、经济费用高、免疫排斥、需长期使用免疫抑制剂等因素的存在，而限制了其应用。如何治疗肝衰竭仍是世界性难题，寻找新的治疗措施已成为临床基础研究的热点之一。　　间充质干细胞(MSCs)是一种不均匀的基质干细胞，可以从人体多种组织分离，如骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带等。间充质干细胞具有多向分化能力，不仅能分化为中胚层细胞如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，还能分化内胚层和外胚层细胞。此外，间充质干细胞还能与固有免疫和获得性免疫细胞相互作用，从而对免疫系统进行调节。急性肝衰竭的发病机制涉及各种炎症因子、细胞因子及广泛的肝细胞凋亡。有体内移植实验证明，间充质干细胞可导致外周免疫耐受并向损伤的组织趋化，抑制炎性因子的释放，抑制细胞的凋亡，促进损伤细胞的存活。此外，有研究证实下调促肝细胞凋亡通路能有效的保护肝细胞。　　本实验通过移植骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)到急性肝衰竭大鼠体内，观察其疗效及对肝细胞增殖凋亡的影响。　　方法:　　1.骨髓间充质干细胞(BMSCs)的提取、培养及鉴定取一只雄性SPF健康SD大鼠，9周，约170g，过量水合氯醛注射安乐死后，酒精浸泡消毒，立即无菌条件下分离大鼠两侧股骨与胫骨，用装满培养基的注射器将股骨胫骨的骨髓冲出，离心重悬浮后，将细胞种植于25cm2中，培养基为含10％胎牛血清的α-MEM，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，24小时半换液，观察细胞贴壁情况及贴壁细胞的形态，3天一次换液，10天后，镜下观察，贴壁细胞生长至80％-90％时，按1∶2传代。细胞培养至第三代时收集一瓶细胞用于流式鉴定。采用流式细胞检测术检测细胞表面特异抗原标志物CD29、CD90、CD11b、CD45的表达情况。　　2.肝衰竭大鼠模型的建立及指标检测48只健康雄性SD大鼠，体重150±20g，随机分为肝衰竭对照组（24只）、BMSCs移植治疗组（24只）。D氨基半乳糖按400mg/kg剂量腹腔注射，LPS按80μg/kg的剂量腹腔注射，全部48只大鼠诱导急性肝衰竭。随后，治疗组的大鼠每只按3×107/kg剂量尾静脉注射BMSCs，细胞悬浮于0.5ml生理盐水，而对照组的大鼠尾静脉单纯注射0.5ml生理盐水。对照组和治疗组大鼠分别在干预后24小时、72小时、120小时随机取8只大鼠处死。所有处死大鼠均留取血清及新鲜肝组织标本，用以后续检测:检测血清ALT和AST水平;肝脏病理HE染色;免疫组化检测PCNA表达水平;TUNEL法检测肝脏细胞凋亡水平;采用PCR检测各组肝脏AFP和GPC3的mRNA水平;采用Western印迹法检测各组肝脏Bax和Bcl-2蛋白表达情况。采用SPSS19.0软件统计分析，用(x)±s表示计量资料，单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05提示差异具有统计学意义。　　结果:　　1.鉴定BMSCs:细胞传至第三代时，细胞聚集成团，呈漩涡状，单独细胞镜下显示为梭形。流式细胞术鉴定结果显示，细胞表达特异性抗原CD29、CD90达99.91％、96.82％，而表达CD11b、CD45为6.63％、6.86％，表现为CD29、CD90阳性表达，CD11b、CD45阴性表达。　　2.成功建立大鼠肝衰竭模型:血清生化检测显示对照组和BMSCs治疗组ALT，AST均逐渐降低，均在24小时最高。但各个时间点治疗组又明显低于对照组。病理结果对照组显示肝小叶结构紊乱，出血，大量肝细胞肿胀坏死，炎性细胞浸润;但各个时间点治疗组与对照组相比，肝细胞坏死减轻，炎性细胞浸润明显减少。　　3.免疫组化PCNA结果:免疫组化结果，棕色核染色视为阳性表达细胞。肝衰竭对照组24小时，72小时，120小时PCNA阳性细胞占总细胞数比率分别为1.69±0.38％，3.50±2.07％，6.01±0.93％，而治疗组为5.12±1.9％，9.65±3.38％，31.1±9.54％。两组随着时间的延长，PCNA表达增加;在72小时，120小时治疗组的PCNA表达明显高于对照组(均P＜0.05)。　　***检测结果:TUNEL法检测结果，凋亡细胞为棕色染色细胞。ALF对照组24小时，72小时，120小时凋亡指数分别为51.92±11.02％，30.29±7.89％，20.48±4.93％;而经间充质干细胞治疗后降为32.39±10.89％，12.04±3.62％，3.22±2.02％。两组随着时间的延长，凋亡细胞比率下降;在24小时，72小时，120小时治疗组凋亡细胞数均低

关键词： 骨保护素   骨髓间充质干细胞   骨质疏松   慢病毒   SD大鼠  

摘要： 目的:将携带有OPG基因的慢病毒体外转染至大鼠BMSCs,并检测其表达结果,为体内基因治疗骨质疏松提供种子细胞。然后将转染成功的BMSCs注射到骨质疏松大鼠的骨髓腔内,分不同时段测定相关指标,观察测定其治疗效果,探索其治疗骨质疏松症的可行性。方法:体外实验选取清洁级2月龄的雌性SD大鼠2只,无菌条件下取其股骨和胫骨,分离和培养BMSCs,第三代时进行慢病毒转染,设立对照组(未经任何特殊处理)、未携带OPG基因慢病毒载体组(转染PGC-FU-RFP)、携带OPG基因慢病毒载体组(转染PGC-FU-OPG-RFP)。72h后,免疫荧光显微镜观察其荧光表达,流式细胞仪测定表达效率。体内试验选取健康6月龄雌性SD大鼠30只,随机分成5组,每组各6只:A组:假手术组;B组:双侧卵巢切除组。造模三个月后测定大鼠的骨密度。造模成功后,给予各组左股骨髓腔注射:B1组生理盐水;B2组BMSCs;B3组未转染OPG基因的BMSCs;B4组转染OPG基因的BMSCs。分别于注射后第6、12周后测定大鼠的骨密度,血清钙、磷浓度、血清骨碱性磷酸酶(B-ALP)及I型胶原交联C-末端肽(CTX-1),X线摄片观察股骨大体情况。12周后颈椎脱臼处死大鼠,进行双侧股骨标本大体观察,右侧股骨三点弯曲试验,并进行统计学分析。结果:体外实验成功培养出第三代大鼠的BMSCs,以MOI=100转染,72h后荧光表达满意,转染效率达70—80%。体内试验,造模前:骨密度测定,各组间无统计学差异。造模3月后:骨密度、血磷B组明显低于A组;血钙、B-ALP、CTX-1 B组明显高于A组,且有统计学意义(P<0.05)。骨髓腔注射BMSCs或生理盐水6周后:骨密度B组仍低于A组,B4组高于其余B组,B2、B3组均高于B1组;血钙B4组低于其余B组,血磷B4组高于其余B组,明显低于A组;B-ALP和CTX-1,B组仍明显高于A组,B4组明显低于其余B组,且有统计学意义(P<0.05)。骨髓腔注射BMSCs或生理盐水12周后,除血磷、B-ALP、CTX-1 B4组与A组无差异外,其余比较结果与6周后相同,且有统计学意义(P<0.05)。骨髓腔注射BMSCs或生理盐水12周后,B4组骨密度明显高于6周后,B-ALP、CTX-1明显低于6周后,且有统计学意义(P<0.05),血钙、血磷的变化不明显。不同时期各组大鼠的股骨X线片比较,变化不明显。各组大鼠股骨标本差异不明显。股骨三点弯曲试验示:右侧股骨最大载荷、最大挠度、最大能量吸收、最大应力及弹性模量,B4组略低于A组,明显高于其余B组,且有统计学意义(P<0.05)。结论:携带OPG基因的慢病毒能有效转染BMSCs,并能稳定地表达,当MOI=100时,转染效率可达70-80%。将携带OPG基因的BMSCs对骨质疏松大鼠有以下效果:(1)可以有效改善骨质疏松大鼠的骨密度继续下降的趋势;(2)可以有效抑制破骨细胞活性,降低骨质疏松风险,提高抗骨折能力。

关键词： 骨髓间充质干细胞   溃疡性结肠炎   治疗  

摘要： 目的:对自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)治疗溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的临床有效性、可靠性及安全性探讨评价。方法:病例选自山西医科大学第二临床医院普通外科从2012年10月—2013年6月间经收治的临床确诊溃疡性结肠炎患者17例,经医院伦理委员会批准,与患者及家属签署知情同意书,根据自愿原则随机分为细胞治疗组(8例)和规范化药物治疗组(9例)。细胞治疗组采用自体骨髓间充质干细胞经体外培养扩增细胞,并在肠镜直视下局部粘膜下多点注射,每点注射细胞量约1.0×107,每间隔30天注射一次,共注射3次;药物治疗组采用规范化药物治疗。结果:细胞治疗组5例达完全缓解,3例部分缓解,有效率100%。药物治疗组6例达完全缓解,3例部分缓解,1例无缓解,有效率90%。随访3-14个月,细胞治疗组5例中无一例复发,另外3例症状无加重。药物治疗组9例中3例第2个月复发再次治疗,另4例分别在第3、5、10个月再次复发。结论:自体骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎是一种可靠的、安全的、有效的方法。

关键词： 骨髓间充质干细胞   移植   肝硬化   疗效   影响因素   分析  

摘要： 背景和目的:肝硬化(Liver Cirrhosis,LC)是临床常见疾病,常因上消化道出血、自发性细菌性腹膜炎、肝性脑病、肝癌、肝肾综合征等一个或多个并发症而死亡。2010年全球疾病负担研究报告显示,全球有超过数百万人因LC而死亡,肝病已成为全球发病和死亡的主要原因之一。近年来,骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs)移植已运用于肝脏疾病的治疗,但目前其疗效和安全性仍存在争议。本课题研究目的是探讨BM-MSCs移植治疗LC患者的疗效及其影响因素和安全性。方法:本研究包括两方面内容:(1)Meta分析:系统检索the Cochrane Library、Pub-Med和EM-BASE数据库和手工查阅相关期刊,检索时间为建库至2014年2月,收集BM-MSCs移植治疗LC患者的相关文章共78篇,病例对照研究数据采用Review Manager 5.1软件分析,治疗前后数据比较采用Meta-Analyst 3.13软件分析。(2)临床病例对照研究:收集2007至2012年在我院行BM-MSCs移植联合基础治疗的121例LC患者为治疗组,在符合BM-MSCs移植纳入标准和排除标准并具有合理基础治疗的前提下,设立年龄、性别、病种为匹配变量,进行1:1的倾向性评分匹配建立对照组。采用t检验比较治疗组与对照组间不同随访点的生化、凝血功能和肝脏纤维指标的差异,通过单因素和logistics回归分析影响移植疗效的相关因素,以及移植对肝癌发生的影响,采用Kaplan-Meier法进行36月的生存分析。结果:(1)Meta分析:共纳入5个研究,其中2个病例对照研究的数据合并显示,终末期肝病模型(the Model for End-stage Liver Disease,MELD)评分在第2、4、24周治疗组与对照组的均数差分别为-1.23[95%CI:-2.45-(-0.01)],-1.87[95%CI:-3.16-(-0.58)],-2.01[95%CI:-3.35-(-0.68)],差异显著(均P<0.05)。单治疗组研究数据合并显示血清白蛋白(Albumin,ALB)在术后第8、16、24和48周与术前均数差分别为-0.28,2.60,5.28,4.39g/L;谷丙转氨酶(Alanine Transaminase,ALT)、总胆红素(Total Bilirubin,TBIL)、凝血酶原时间(Prothrombin Times,PTs)和meld评分均有显著改善。(2)临床病例对照研究:①治疗组与对照组的乏力发生率在第4、8和12月分别为43.5%vs.64.7%、52.3%vs.66.4%和49.7%vs.67.4%,差异显著(均p<0.05);腹水发生率在第2、4、8和12月分别为35.8%vs.47.6%、30.6%vs.43.5%、33.4%vs.45.9%和40.2%vs.47.5%,差异显著(均p<0.05),术后第2年人均住院天数分别为37.9天vs.49.5天,差异显著(p<0.05)。②4周疗效显示,治疗组的前白蛋白和alt于术后第1周开始显著改善,tbil、pts和肝纤维指标于术后第2周开始显著低于对照组,而alb于术后第4周才开始显著升高。36月的疗效显示治疗组的前白蛋白、alb和pts在第1-18月显著高于对照组,但至术后第24月差异无统计学意义。tbil仅在术后第1月时显著低于对照组,而alt在术后第2月时高于对照组,余各时间点无差异;进一步研究发现两组的36月总生存率无显著性差异(χ2=0.564,p=0.453)。③4例患者7人次进行了肝脏病理检查,结果提示ck18在术前肝细胞中少量表达,术后第5周和第14月高表达,至术后第22月表达量显著减少,与术前相当,而ck8和ck19仅在移植术后第5周的肝细胞中表达。④logistics多元回归分析显示meld评分(or=4.703)、国际标准化比值(internationalnormalizedratio,inr)(or=3.014)、并发症(or=2.134)、肌酐(or=1.404)、alb(or=1.195)、tbil(or=1.002)和术后hbvdna载量(or=1.243)为影响术后疗效的危险因素,进行roc分析显示meld评分、alb、inr和tbil的临界值分别为25.0分、24.5g/l、2.1和95.7μmol/l。进行分层分析显示,当meld评分<25分时,治疗组的36月生存率显著优于对照组(χ2=4.207,p=0.040)。⑤36月的随访结果显示,两组的原发性肝癌发生率无显著性差异(p=0.516)。结论:bm-mscs移植治疗lc的4周疗效显著,36月疗效对部分患者显著,合适于mel

关键词： 再生障碍性贫血   骨髓间充质   疗效   护理  

摘要： 目的 :对再生障碍性贫血患者运用骨髓间充质干细胞进行治疗,观察临床效果,并分析护理要点。方法 :选取本院2014年3月至2015年3月收治的22例再生障碍性贫血患者作为研究对象,对22例患者实施观察,并且采取护理措施,观察疗效,分析护理要点。结果 :8例患者基本治愈,5例患者缓解,3例患者明显进步,总有效率为73%;4例患者无效,仍然在治疗中,2例患者死亡,原因为严重感染。结论 :为再生障碍性贫血患者运用骨髓间充质干细胞治疗,能够取得良好的治疗效果,优质的护理质量具有至关重要的作用。

关键词： 2型糖尿病   骨髓间充质干细胞疗法   游离脂肪酸   疗效评价  

摘要： 目的:研究SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对2型糖尿病C57b1/6小鼠治疗作用及游离脂肪酸对该治疗作用的影响。　　方法:1.体外分离、培养并鉴定SD大鼠BMSCs;2.C57b1/6小鼠Ⅱ型糖尿病模型的建立;3.通过检测空腹血糖(FBG)、胰岛素浓度(FINS)、游离脂肪酸浓度浓度(FFA)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、小鼠糖耐量试验(OTGG)及小鼠胰腺组织病理结果，研究BMSCs对2型糖尿病C57b1/6小鼠2型糖尿病的治疗作用及游离脂肪酸对该治疗作用的影响;***在Ⅱ型糖尿病小鼠体内示踪。　　结果:1.联合运用梯度密度离心法及细胞贴壁法获得高纯度的SD大鼠BMSCs。该BMSCs可诱导分化为成脂肪细胞、成骨细胞及成软骨细胞。BMSCs高表达CD29、CD44H和CD90表面抗原，低表达CD11β、CD34、CD45和C106表面抗原。2.高脂饮食饲养3w周腹腔注射链脲佐菌素100mg/kg剂量可获得2型糖尿病实验模型，待血糖稳定后更改小鼠饮食可获得不同血清FFA浓度2型糖尿病实验模型。***治疗后，空白对照A、B组各项指标未见显著差异(P＞0.05);***治疗后，D、F两组小鼠FBG、FINS、OGTT有显著改善(P＜0.05)且F组改善情况好于D组(P＜0.05)。***治疗后，D、F两组小鼠胰腺组织病理情况均较对照组有显著好转，相比于D组，且F组保存胰岛数量较多，胰岛结构、胰岛分泌细胞及纤维化程度改善情况更好。5.注射荧光-BMSCs后，D、F两组均可见荧光-BMSCs聚集于胰腺组织且F组胰腺区域荧光光通量强度大于D组(P＜0.05)。　　结论:1.联合密度梯度离心法及细胞贴壁法可成功分离并培养出高纯度SD大鼠BMSCs。***对2型糖尿病有积极的治疗作用。***对BMSCs治疗2型糖尿病效果呈负性影响。

关键词： 脊髓损伤   骨髓间充质干细胞   NF200   GFAP  

摘要： 目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是十分严重的脊柱疾病并发症,常会引起损伤节段以下肢体严重的功能障碍,其发生率呈逐年上升的趋势,但由于神经元本身再生能力不足,脊髓损伤的治疗一直是医学界难点。随着细胞技术的进步,外源性干细胞移植为脊髓损伤的治疗提供一种可能有效的方法。骨髓间充质干细胞有较强的自我更新和增殖能力,且来源广泛、分离培养简单,有望成为治疗脊髓损伤的“种子细胞”。但由于移植后的骨髓间充质干细胞在宿主体内成活率及转化率较低,其在实验研究及进一步应用中受到很大的限制。mi RNA是一类高度保守的非编码小RNA分子,在生物体内广泛存在,对真核生物的基因表达、细胞周期调控和个体发育等均有影响。有研究发现mi RNAlet-7b有促进干细胞分化,调控神经干细胞的自我修复和更新。但在治疗脊髓损伤方面,mi RNAlet-7b修饰的骨髓间充质干细胞是否比单纯的骨髓间充质干细胞移植修复疗效更好,目前尚未有研究报道。本实验目的是通过免疫组织化学染色法检测骨髓间充质干细胞移植后大鼠脊髓组织中神经丝蛋白200(neuro filament200,NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(gilal fibrillary acidic protein,GFAP)的表达,初步探讨mi RNAlet-7b修饰骨髓间充质干细胞在大鼠脊髓损伤修复中的作用及其机制。方法:选取SD大鼠60只,采用随机数字表法分为3组:对照组、BMSCs组、mi RNA组,每组20只。3组均采用改良Allen’s法制备T12脊髓损伤模型。造模后1周,对照组仅在损伤部位注射等量的生理盐水,BMSCs组大鼠移植阴性对照慢病毒载体感染的BMSCs,mi RNA组大鼠移植mi RNA let-7b慢病毒载体感染的BMSCs。分别于移植后3天、1周、2周、4周、8周按Basso Beattie Bresnahan(BBB)标准量表对大鼠后肢运动功能进行评分。采用免疫组织化学染色法检测并统计脊髓组织中NF200染色阳性细胞数和GFAP染色阳性面积,应用HE染色方法评估损伤段脊髓组织的病理变化。所有数据均用SPSS19.0软件统计分析,定量资料用x?s的形式来表示。各组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析,如3组方差齐时,采用t(LSD-t)检验进行组间的比较,如3组之间方差不齐时,则采用Tamhane’s T2进行检验,检验水准α=0.05。结果:1、造模后3组大鼠均出现了严重的双下肢功能障碍,此时3组大鼠BBB评分结果比较,差异无统计学意义(F=0.500,P=0.622);细胞移植后,3组大鼠BBB评分均不断升高,大鼠双下肢运动功能也有所改善,移植后各时间点大鼠BBB评分比较:mi RNA最高、BMSCs组次之、对照组最低,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。2、NF200免疫组化结果显示:细胞移植后3天,3组大鼠脊髓内NF200阳性细胞数比较,mi RNA组略高,但各组间比较无统计学意义(F=1.275,P=0.325);随实验进展,细胞移植后1周、2周、4周、8周NF200染色阳性细胞数均不断增多,其中mi RNA组最多、BMSCs组次之、对照组最少,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)3、GFAP免疫组化结果显示:对照组GFAP染色阳性面积比较持续性升高,mi RNA组和BMSCs组先升高后降低。3组GFAP染色面积比较:对照组最高、BMSCs组次之,mi RNA组最低,3组间差异有统计学意义(P<0.05)。4、HE染色观察:3组大鼠脊髓组织内均可见组织结构紊乱充血,神经细胞水肿等病理变化,mi RNA组和BMSCs组病理学改变较对照组轻。结论:1、骨髓间充质干细胞移植可以提高脊髓损伤大鼠的双下肢功能,mi RNAlet-7b修饰的骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤修复效果更好。2、骨髓间充质干细胞在脊髓组织微环境下能分化为神经元样细胞,mi RNAlet-7b能促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化;骨髓间充质干细胞移植可以减少星形胶质细胞的GFAP表达量,抑制损伤脊髓组织中胶质瘢痕的生成,mi RNAlet7b修饰的骨髓间充质干细胞作用更强。3、mi RNAlet7b修饰的骨髓间充质干细胞可减轻大鼠脊髓损伤后的病理变化。

关键词： 骨髓间充质干细胞   miRNA-21   心肌梗死  

摘要： 目的:通过过表达或抑制micro RNA-21(mi R-21)在SD大鼠骨髓间充质干细胞SD-BMSCs(MSCs)内的表达,评估其在治疗心肌梗死的效果上的变化,并研究其作用机制。方法:采用全骨髓差异贴壁法分离培养SD大鼠MSCs至第4代,使用脂质体转染法转染mi R21-agomir(过表达)及mi R-21 antagomir(抑制)调控mi R-21在MSCs内的表达,转染成功后收集细胞并收集条件培养基,用于后续研究。体内实验中,建立SD大鼠心肌梗死模型后,采用心肌内注射方法,分别将MSCsmi R-21 agomir组、MSCsmi R-21antagomir组、MSCs未转染组及PBS移植至心梗及周边区域,通过检测大鼠心梗后心功能变化及心梗面积评估治疗效果。体外实验中,购买原代脐静脉内皮细胞(HUVEC),心肌细胞系H9C2细胞,子宫颈癌细胞系Hela细胞。以Hela细胞为载体,通过双荧光素酶报告验证mi R-21的靶点是否为Jagged1。同时利用收集的MSCs转染组产生的培养基和MSCs未转染组产生的培养基及含有10%FBS+双抗的DMEM/HIGH培养基(空白对照),用作以下两个实验,一是处理HUVEC细胞72小时后在Matrigel基质胶上培养,于12小时观察成管样结构;二是处理H9C2细胞72h后加入CCK-8溶液孵育1个小时,检测细胞增殖情况。结果:体内实验中:MSCsmi R-21 antagomir组平均LVEF(%)变化值:17.14±2.63,MSCs mi R-21 agomir组LVEF(%)变化值:13.09±1.74,MSCs未转染组LVEF(%)变化值:13.34±2.25,三组与对照组LVEF(%)变化值:7.09±4.23相比,心功能恢复效果更佳,差异有统计学意义(P<0.05),三组之中,MSCsmi R-21antagomir组与心功能恢复效果最佳,与其他两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。通过Masson染色分析心梗面积发现心梗区域纤维化组织与正常心肌面积所占横截面外周径比值(%):MSCsmi R-21 antagomir组最小,为10.50±3.15,与MSCsmi R-21 agomir15.91+4.12、MSCs未转染组20.34±3.25、PBS组37.09±6.23均有统计学差异(P<0.05)。心梗区域纤维化组织与正常心肌面积所占横截面面积比值(%)MSCsmi R-21 antagomir组同样最小,为8.31±2.35,与MSCsmi R-21 agomir组19.91+4.93、MSCs普通组25.14±2.19、PBS组31.04±5.93均有统计学差异(P<0.05)。通过双荧光素酶报告基因验证,我们发现mi R-21可与Jagged1的m RNA 3’UTR段结合,说明mi R-21对Jagged1具有调控作用。q RT-PCR显示,转染mi R-21 antagomir的MSCs内的Jagged1、NOTCH、VEGF等基因全部上调。体外管样生成实验中,MSCsmi R-21 agomir培养基组体外管样结构连接长度(11976.14±866.62)与MSCsmi R-21 antagomir培养基组(12196.52±858.00)、MSCs未转染培养基组(12275.09±561.74)之间均无统计学差异(P>0.05),但三组与空白组之间均有统计学差异(P<0.01);CCK8实验中,抑制了mi R-21在MSCs内的表达后,其条件培养基促心肌增殖的能力得到了明显的增强。结论:抑制了mi R-21在MSCs内的表达后,其治疗心肌梗死的能力得到了增强。mi R-21可与Jagged1 m RNA结合,对其产生调控。抑制了mi R-21在SD大鼠MSCs的表达后,Jagged1,Notch,VEGF等基因上调。MSCs产生的条件培养基具有促进心肌细胞增殖的能力,抑制了mi R-21在其内的表达后,这种能力得到了提升。MSCs产生的条件培养基也具有促进管样结构生成的能力,但这种能力与mi R-21的表达无关。

关键词： 骨髓间充质干细胞   microRNA-211   STAT5A   迁移   心肌梗死  

摘要： 背景：骨髓间充质干细胞(MSCs)移植修复梗死心肌已经成为研究的热点。MSCs迁移到损伤心肌区域是修复组织至关重要的一步,但很多研究均表明经血管移植时,迁移到受损区域的MSCs极少。因此,研究调控MSCs迁移的相关机制至关重要。我们前期研究证实,缺氧预处理能提高MSCs的迁移能力,同时缺氧预处理也能上调miR-211的表达。根据相关文献报道,miR-211能调控多种肿瘤细胞的迁移。因此,我们推测miR-211在MSCs迁移过程中起重要作用。本课题的目的就是研究miR-211对MSCs迁移能力的调控作用及具体机制。 方法和结果：体外的Transwell迁移实验提示,miR-211过表达能提高MSCs的迁移能力,而下调miR-211的表达能降低MSCs的迁移能力。miR-211过表达或表达下调的雄性MSCs经尾静脉移植到雌性大鼠急性心梗模型中,2天后检测GFP表达和SRY基因来定性和定量MSCs迁移到梗死周边区的能力。实验结果提示miR-211过表达能增加MSCs迁移梗死周边区的细胞数量。心梗28天后,与PBS及MSCs对照组相比,miR-211过表达的MSCs组大鼠心功能改善,疤痕面积缩小。Targetscan等生物信息学软件预测STAT5A可能是miR-211的靶基因,双荧光素酶报告基因系统、RT-PCR和蛋白电泳,证实miR-211能结合至STAT5A的3’-UTR区,调控STAT5A的转录。体内和体外功能学实验提示,上调STAT5A能抑制MSCs的迁移能力,下调STAT5A能提高MSCs的迁移能力。miR-211过表达诱导的迁移能力增加,能被STAT5A抑制。根据文献报道,STAT3在MSCs的迁移中起到及其重要的作用,且缺氧预处理也能调控STAT3的活性。我们预测STAT3与miR-211可能有相互作用。染色质免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验验证STAT3可以直接结合到miR-211的启动子区域并能调控miR-211的表达。 结论：STAT3/miR-211/STAT5A信号通路在MSCs的迁移过程中起到关键作用。经静脉移植miR-211过表达的MSCs改善心梗后心功能。

关键词： SD大鼠   骨髓间充质干细胞   全骨髓贴壁法   细胞培养   流式细胞仪   骨髓间充质干细胞   慢病毒载体   转染   神经营养因子-3   超顺磁性氧化铁   脊髓损伤   骨髓间充质干细胞   蛛网膜下腔   神经营养因子-3   修复  

摘要： 脊髓损伤是临床上较常见的而且非常严重的神经系统创伤性疾病,常常导致严重的运动和感觉功能障碍,而且目前临床上尚无行之有效的治疗方法。骨髓间充质干细胞的移植治疗结合基因疗法是当前脊髓损伤治疗研究的热点。在脊髓损伤后,神经营养因子在神经修复中起着非常重要的作用。为了探索一条脊髓损伤治疗的新途径,我们的研究将包含神经营养因子-3基因通过慢病毒转染骨髓间充质干细胞,并在用超顺磁性氧化铁颗粒标记细胞后,经蛛网膜下腔移植到体内,使其在体内能稳定表达神经营养因子-3,同时在移植后,利用磁场的作用靶向传送移植的干细胞到病变区,以加速干细胞向病变区的趋化运动的速率和增加干细胞在病变区的数量,从而使骨髓间充质干细胞的神经修复的作用得到加强、效率得到提高,进一步促进功能恢复,提高治疗效果。同时,我们还能借助MRI观察移植的磁标干细胞在体内的分布。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、传代、鉴定目的：使用全骨髓贴壁法分离纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞,将提取的细胞经传代培养后,并从细胞的形态、表面抗原及增值能力方面进行鉴定,为实验提供细胞来源。方法: 1.采用全骨髓贴壁法分离纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞,并对获得分离的细胞进行传代培养,同时对细胞形态进行观察。2.用MTT法测定分离的细胞的生长曲线,对其生长规律进行分析。3.用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表面标志物(CD29、CD34、CD44、CD45),以鉴定所培养细胞是否具有骨髓间充质干细胞的特征。结果: 1.经全骨髓贴壁法分离纯化大鼠的骨髓间充质干细胞,呈长梭形,在体外可以培养、传代。2.经MTT法测定第3、4、5代细胞的生长曲线呈S型,且形态相似,具有较强的增殖能力。3.经流式细胞仪检测细胞的表面标记志物,细胞表面的CD29和CD44表达呈阳性,CD34和CD45表达呈阴性,这符合一般骨髓间充质干细胞的特征。结论： 应用全骨髓贴壁法可以分离纯化大鼠的骨髓间充质干细胞,该法操作简单、经济实用、提取率高。所获得的细胞生长增殖旺盛、可进行连续多次传代,可以满足研究使用。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的神经营养因子-3基因转染和超顺磁性氧化铁颗粒标记目的： 利用慢病毒将神经营养因子-3转导入骨髓间充质干细胞,使其能稳定表达神经营养因子-3,同时用超顺磁性氧化铁颗粒标记干细胞,为脊髓损伤的细胞移植治疗做准备。方法: 1.首先通过重叠PCR扩增att B1-NTF3-att B2,然后利用Gateway技术构建p Down-NTF3,利用Gateway技术构建包含神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)及红色荧光蛋白(red fluorescent protein,Ds Red)基因的质粒p ***3d.P/puro-EF1α>NTF3>IRES/Ds Red Express2,最后进行慢病毒包装。2.利用慢病毒对骨髓间充质干细胞转染NT3-Ds Red基因。3.实时荧光定量PCR检测转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞的NT3 m RNA的表达。*** blotting检测转染NT3-Ds Red基因后的骨髓间充质干细胞的NT3蛋白的表达。5.利用浓度为25μg/ml的超顺磁性氧化铁(Superparamagnetic Iron oxide,SPIO)颗粒标记NT3-Ds Red基因转染的鼠骨髓间充质干细胞,然后用普鲁士蓝染色检测细胞的标记率。结果: 1.构建的包含NT3-Ds Red基因的质粒p ***3d.P/puro-EF1α>NTF3>IRES/Ds Red Express2经测序检验完全正确,并能够成功转染293FT细胞,包装好的慢病毒滴度约为1.4×108TU/ml。2.成功转染NT3-Ds Red基因后的骨髓间充质干细胞荧光显微镜下可以观察到红色荧光。3.实时荧光定量PCR检测显示转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞的NT3 m RNA表达水平是未转染NT3基因的骨髓间充质干细胞的13倍。*** blotting检测结果显示转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞可以高表达NT3蛋白,而未转染NT3基因的骨髓间充质干细胞则不能表达。5.普鲁士蓝染色显示,浓度为25μg/ml的SPIO成功标记转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞,胞质蓝染,胞核呈淡红色,标记率100%。结论： 构建的含NT3-Ds Red基因的慢病毒载体,能够将NT3-Ds Red基因转移并整合入鼠BMSC的DNA中,并使其高效、稳定地表达NT-3因子。同时浓度为25μg/ml的SPIO能够有效的标记转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞。为进一步的活体实验奠定了基础。第三部分磁靶向NT3基因转染的BMSCs治疗大鼠脊髓