关键词： 同种异体   骨髓间充质干细胞移植   治疗   大鼠   心肌梗死  

摘要： 目的　探讨同种异体骨髓间充质干细胞 (MSCs)在梗死大鼠心脏局部存活、迁移、分化及对心功能的影响 ;明确同种异体细胞移植治疗心肌梗死 (MI)的可行性及效果。方法　雌性Wistar大鼠 3 5只 ,随机分为正常对照组、急性心肌梗死 (AMI)组及MI +MSCs治疗组。分离纯化雄性Wistar大鼠骨髓MSCs ,于左冠状动脉前降支结扎后 1～ 3h植入到雌性大鼠心脏组织 ,移植后 10周检测心功能并取心脏检测各种相关指标。结果　异体大鼠MSCs经纯化后可在梗死心脏组织定居、生存 ,并与宿主心肌纤维排列方向一致 ,免疫组化检测胞质心肌特异蛋白染色阳性 ,与MI组比较 ,异体细胞移植组左室收缩压升高 (P <0 0 5) ,舒张末压明显降低 (P <0 0 1)、左心室内压最大上升和下降速率显著增快 (P <0 0 5) ,梗死边缘区心肌面毛细血管数目明显增加 (P <0 0 5) ,多功能真彩色病理图像分析系统显示MI面积缩小 (P <0 0 5)。结论　同种异体MSCs移植治疗MI可行。

关键词： 脑损伤   骨髓   干细胞   移植   神经再生  

摘要： 干细胞移植是近年来医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点及前沿.在干细胞工程兴起以前,人们在脑内移植方面作了许多探索工作,虽然获得一定的近期疗效,但同时存在胚胎脑组织来源困难、以及伦理学等方面的问题.随着干细胞工程的推进,细胞替代治疗已成为治疗损伤、遗传缺陷性或退行性疾病的新途径.骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cel1s,MSCs)是目前备受关注的一类来源于骨髓单个核细胞群、具有多向分化潜能的组织干细胞.MSCs特性稳定,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能.在体外特定的诱导条件下,MSCs可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、韧带等多种细胞[1～3].动物体内实验也发现骨髓细胞来源的神经细胞、肝脏卵圆细胞、肌肉细胞等,这可能也与MSCs有关.免疫排斥是干细胞用于异体替代治疗的一个重要问题.有实验将人的MSCs注人大鼠脑内却未发生由于免疫排斥而引起的大鼠死亡,而且MSCs能够在大鼠脑内较长时间存活,这除了与脑本身免疫原性较弱有关外,也与MSCs自身特性有关.MSCs表达组织相容性复合物Ⅰ而缺乏组织相容性复合物Ⅱ,免疫原性较弱[4～5],同时,MSCs能直接或间接抑制T细胞的功能,这为干细胞用于临床治疗增加了更多的可能性.

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌   细胞移植   心力衰竭  

摘要： 充血性心力衰竭(心衰)是现代社会发病率、病死率不断提高的主要心血管疾病,急性心肌梗死(心梗)是重要的致病原因.心梗后,心肌细胞坏死、凋亡造成心肌数目减少,心室重构促使心衰发生.通常认为,哺乳动物成体心肌为终分化组织,没有成肌前体细胞,受损后无分化和增生潜能,故心肌细胞丢失多不可逆.尽管有研究显示心衰时心肌细胞存在有丝分裂[1],但增生速度慢,不能修复组织.

关键词： 骨髓间充质干细胞   神经干细胞   神经元样细胞   星形胶质样细胞分化   脑缺血再灌注   碱性成纤维生长因子   凋亡   大鼠   分子克隆   转染  

摘要： 骨髓间充质干细胞是源于骨髓造血干细胞之外的基质细胞,具有取材方便、可用于自体移植、不涉及伦理问题等优点,现已越来越受到研究者的重视.国内外的研究应用不同的方法体外诱导MSCs分化为神经元样细胞,体内实验也发现MSCs在脑组织中可分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞,并且应用MSCs移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤.然而,具体的治疗机制仍不清楚,该实验拟用MSCs移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤,观察MSCs对缺血脑组织中碱性成纤维生长因子的表达及神经细胞凋亡的影响.探讨MSCs的脑保护机制,同时构建bFGF真核表达载体并对MSCs进行基因修饰,为缺血性脑血管病的基因修饰的细胞治疗奠定实验基础.第一部分体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化;目的 探讨二甲亚砜(DMSO)、丁羟茴醚(BHA)和β-巯基乙醇(BME)联合应用对成年大鼠骨髓间充质干细胞MSCs向神经样细胞定向分化的影响.第二部分 MSCs对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制研究;目的:研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制.第三部分 bFGF荧光真核表达载体的构建及在MSCs中的表达;目的 构建碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)荧光真核表达质粒,转染骨髓间充质干细胞(marrow stromal cells,MSCs),为进一步开展bFGF基因修饰MSCs治疗缺血性脑血管病提供实验依据.

关键词： 帕金森病   千金丹   骨髓间充质干细胞   自体移植   实验研究  

摘要： 研究内容复方中药千金丹是李连达院士依据帕金森病的病因病机,遵循辨证论治原则,结合多年临床经验与实验室的研究实践,精选而成的经验方剂.治则为:补血活血、清热化痰、熄风止痉.方选:千金藤、川芎、当归.急性毒性实验证明该方安全可靠.千金丹的作用机制是否与神经保护或免疫机制相关?MSC自体移植对帕金森病的治疗作用与可能的机制如何?二者又有何相关?针对这些问题,该工作从整体和离体实验两方面,进行了初步研究与探讨.结论 氯化锰腹腔注射造成帕金森病大鼠模型,更符合帕金森病的发病机制,并且死亡率低,重复性好,方法简单,值得推广.依据神经生理解剖部位,采用3点注射6-OHDA单侧黑质,成功率较经典法显著增高.在帕金森病模型中发现:血中的细胞因子IL-2,IL-6,IL-8,TNF-α均异常增高,提示帕金森病时,免疫损伤细胞因子的提高可能是帕金森病的一个相关因素.MSC在移植后,对帕金森病大鼠有一定治疗作用,其机制可能与改善免疫机制相关.千金丹对MSC有促进生长作用,同时,其对帕金森病的治疗可能是通过对多巴胺能神经元的直接保护,改善免疫机制作用而达到目的.

关键词： 骨髓间充质干细胞   皮肤烧伤   细胞移植  

摘要： 皮肤大面积深读烧伤的治疗，主要问题是植皮皮源的提供和瘢痕形成，目前仍无理想的治疗方法，人们一直不断地探索更好地恢复皮肤功能的新疗法。骨髓MSCs具有明显的可塑性，具有分化成损伤部位细胞能力和旺盛增殖与多向分化的机能，因此，我们拟探讨用骨髓MSCs治疗皮肤烧伤，为皮肤烧伤的治疗探索一条新的途径。本实验从雄性豚鼠中获得骨髓MSCs，经体外培养传三代，局部移植给皮肤烧伤的雌性鼠。雌性豚鼠烧伤模型在第3天清创，同一只鼠的左侧设为治疗组，右侧设对照组。治疗组涂抹细胞悬液，移植的细胞密度分别为A治疗组2×106个∕ml、B治疗组2×107个∕ml，对照组涂抹PRMI 1640培养液后，依次用覆盖无菌凡士林和油纱，普通纱布包扎4小时后去掉所有敷料裸露创面，在治疗组和对照组分别滴入MSCs的细胞上清液和PRMI 1640培养液，约30分钟，连续滴3天，每天一次，保持创面的湿润。观察豚鼠的活动情况、创面愈合情况，通过HE、Masson染色进行组织形态学观察。通过免疫组织化学方法检测创面中Ⅷ因子的含量，用PCR方法检测供体鼠MSCs中Y染色体性别决定区特异性片段，证明雄性供体鼠的细胞在雌性受体鼠的烧伤部位存活情况。结果表明：移植的MSCs对创面有明显的促进愈合作用，治疗组的愈合明显好于对照组。从创面微血管的密度变化上看，A组第15天时治疗组为30.2800，对照组为15.0600；第30天时治疗组为34.2600，对照组为19.3200。B组第15天时治疗组为16.8200，对照组为27.0000；第30天时治疗组为28.6000，而对照组为16.3600。可明显看出各组的创面治疗组微血管密度均高于对照组 约一倍左右，但不同细胞密度的治疗组之间无明显差异。从创面愈合面积上在第15天时A组治疗组创面愈合面积为10.0520，对照组为15.9600而第30天时治疗组创面愈合面积为4.0640，对照组为5.2940。B组治疗组第15天时创面愈合面积为10. 3460，对照组为14.7240，第30天时治疗组创面愈合面积为4.0640，对照组为8.2200。显然各组治疗组创面愈合面积在第15天和第30天时均小于对照组的创面愈合面积，但两组之间无明显差异。HE染色第15 天时，各组创面均有新生表皮覆盖，治疗组真皮与表皮结构清晰，表皮各层清楚；对照组创面真皮与表皮各层次不清楚，表皮层有较多的坏死细胞，真皮层充血明显。第30天时治疗组创面新生表皮各层分化良好，表皮钉脚伸入真皮层，有新生的毛细血管，无充血现象。Masson染色结果：第15天时治疗组与对照创组面的胶原排列紊乱，较稀疏，不规则但治疗组明显好于对照组，第30天时治疗组与对照组的胶原排列相对较整齐，胶原增粗、拉长，治疗组好于对照组。PCR检测结果表明，MSCs移植后第15、30、50天，分别在治疗组和对照组的部分样品中获得供体鼠的移植MSCs中Y染色体性别决定区特异性片基因段，证明纯化的MSCs 在受体鼠内定居、存活、迁移、增殖分化，无明显的排斥反应。愈合的创面瘢痕形成不明显，愈合创面的皮肤与周围的正常皮肤无明显的差异，色素沉着不明显，均有毛发长出，但治疗组毛发较多而密集，纤维化减少。 总之，移植的MSCs对创面有促进愈合作用，疗效较好，创面新生皮肤瘢痕较少。其机制可能是在机体受到损伤时由于内环境发生变化，发生的一系列复杂的生物学事件，在创面愈合的各个阶段都受到各种细胞所产生和分泌的因子调节，这些因子与MSCs分泌的因子相互作用，或者是MSCs在此环境下转化成皮肤干细胞及皮肤附属器干细胞等，MSCs在皮肤烧伤愈合过程中起了重要作用。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脊髓损伤   细胞移植   恒河猴  

摘要： 目前关于MSCs治疗脊髓损伤已经应用于大鼠等小动物,为了进一步研究其作用机理以及作用效果,为临床应用提供更为可靠的证据,必须进行灵长类动物(如猴子)的研究,因此,该实验选取恒河猴作为研究对象,将猴MSCs诱导为早期神经元,然后移植入SCI模型,观察其在宿主脊髓中的存活、迁移以及是否能促进脊髓功能的恢复.该课题的研究内容包括以下三个部分:1 猴MSCs生物学特性的研究 1.1 猴MSCs的分离、培养、扩增 1.2 猴MSCs的增殖能力 1.3 猴MSCs表面标志的鉴定 1.4 猴MSCs的核型分析 2 定向诱导猴MSCs分化为神经元样细胞 2.1 猴MSCs诱导分化为神经元样细胞 2.2 分化后的细胞的免疫细胞化学分析 2.3 分化后的细胞的基因分析 3 MSCs源性神经元移植治疗猴脊髓损伤促进功能恢复 3.1 猴脊髓损伤模型的建立 3.2 移植细胞的准备和体外标记 3.3 猴MSCs源性神经元移植治疗脊髓损伤 3.4 行为学评估 3.5 组织学分析 3.6 True blue逆行追踪实验 结论:通过以上研究,该实验结论如下:1、猴MSCs具有较强的增殖能力,可在体外大量扩增传代,P15后仍保持旺盛的增殖能力.2、流式细胞仪检测显示CD34,CD71,CD80和CD86表达阴性,CD29,CD44,CD105,CD166表达阳性.核型分析显示猴MSCs具有正常的二倍体核型.3、隐丹参酮或丹参酮ⅡA可以将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞.4、MSCs源性神经元的植入可以促进猴脊髓损伤模型的功能恢复.

关键词： 间充质干细胞   肝细胞生长因子   腺病毒载体   心肌缺血   血管新生   细胞迁移   鞘氨醇激酶/1-磷酸鞘氨醇   半胱氨酸含量丰富的蛋白61  

摘要： 冠心病以局部心肌组织缺血、部分心肌细胞坏死和坏死区疤痕形成为主要特征。其治疗应包括改善局部血液循环、修复坏死心肌和减少局部疤痕形成三个方面。肝细胞生长因子（HGF）具有很强的促血管生长和抗纤维化作用，而骨髓间充质干细胞（MSC）可以分化成心肌细胞，为此我们开展了MSC联合HGF治疗心肌缺血及其相关机理的研究。目的是评价HGF基因修饰MSC治疗缺血性心脏病的可行性及其疗效，为基因修饰干细胞治疗损伤性疾病提供实验基础；并探讨HGF诱导血管生长的机理，包括对骨髓干细胞的动员作用、对内皮细胞的生物学作用及其分子调控，为HGF基因修饰干细胞治疗缺血性疾病提供理论基础。 利用Percoll密度梯度分离方法和MSC贴壁生长的特性，我们分离纯化了人及大鼠的骨髓MSC。免疫组化染色结果表明，这些细胞表达HGF的受体c-Met。在此基础上，我们观察了重组HGF因子对MSC增殖、分化、迁移等功能的影响。结果发现，HGF刺激MSC增殖的作用不明显，也不影响MSC向肌细胞和成骨细胞的分化，但可明显诱导MSC的迁移，并能抑制anoikis诱导的MSC死亡。随后，我们分别用携带GFP和HGF基因的腺病毒载体（Ad-GFP和Ad-HGF）感染MSC，用流式对感染率进行测定，用ELISA方法检测HGF的分泌表达。流式测定结果表明，随着感染强度的加大，腺病毒感染MSC的效率也明显增高。在感染强度MOI=150时，感染率就几乎达到了100％。ELISA分析结果表明，在感染后HGF有短期（2W左右）和高效的表达（最高达128ng／mL）。通过结扎冠状动脉左前降支（LAD），我们建立了雌性大鼠的急性心肌缺血模型，将高表达HGF基因的雄性MSC注射到心肌缺血的局部。4W后分析大鼠的心肌缺血区面积大小、局部胶原沉积、心功能变化等多项指标。血液动力学测定结果表明，治疗组大鼠的心功能得到了明显改善。表现在反映心脏收缩功能的左心室收缩压（LVSP）和左心室内压最大上升速率(dP／dtmax)与模型组相比明显增加，而反映心脏舒张功能的左室舒张末压（LVEDP）则明显降低。组织病理学检查发现，治疗组心脏的缺血区面积明显缩小，新生血管明显增多，胶原沉积显著降低。进一步性别决定基因Sry原位杂交结果表明，局部注射的雄性大鼠来源的MSC部分整合到了雌性大鼠心肌缺血的局部，形态与周围心肌细胞难以区分。 在上述实验的基础上，我们对HGF促进血管生长和抑制疤痕形成的细胞和分 中文摘要 子机理进行了探索研究。 首先，考虑到HGF对细胞的扩散作用（HGF又称扩散因子）和骨髓干细胞 在血管生长中的重要作用，我们观察了HGF对骨髓干细胞的动员作用及动员细胞 在组织修复及血管新生中的角色。将Ad一HGF经尾静脉注射到大鼠或小鼠的体内， 然后于不同时间检测血浆HGF的水平和外周血中干细胞的含量变化情况。结果表 明，尾静脉注射Ad一HGF后，大鼠和小鼠血浆的HGF水平均显著升高。同时外 周血中的干细胞，表现在CD34+、UEA阳性细胞、造血集落形成细胞的数量明显 增多。对外周血进行直接培养，发现注射Ad一HGF组的贴壁生长细胞数量也明显 增多。进一步分析显示，这些贴壁细胞表达Tie一2、nk一1、c一Met和VIII因子相关抗 原等内皮细胞的表面标志。这些结果表明，HGF能够动员骨髓中包括内皮祖细胞 在内的多种干/祖细胞。为了证实这些动员的干/祖细胞是否参与了组织损伤修复 时的血管新生，我们建立了小鼠的肝CC14损伤模型和大鼠的心肌缺血模型。将动 员后的细胞经尾静脉移植到组织损伤的动物体内，Sry原位杂交结果表明，动员 的干细胞参与了组织损伤时的血管再生。 其次，我们分析了HGF对人ECV304脐静脉内皮细胞系增殖、迁移、管状化 结构形成的影响，并对其分子调控进行了探索研究。研究结果表明:HGF能明显 诱导内皮细胞的迁移，但刺激细胞增殖和诱导细胞管状化结构形成的作用不明显; HGF激活内皮细胞 ERKI/2和PI3K信号通路，并通过MAPK和PI3K通路进一步 活化鞘氨醇激酶（SPK），提高细胞内1一磷酸鞘氨醇（SIP）水平;SPK阻断剂 DMS或负显性SPK基因转染均完全阻断了HGF诱导的内皮细胞迁移，而野生型 SPK转染明显促进

关键词： 人胎盘脐血细胞   间充质干细胞/胚胎   缺氧缺血性脑病   细胞治疗  

摘要： 随着医疗技术的发展,产科和新生儿医疗保健发展迅速,但缺氧缺血所致的脑病在新生儿中发病率未见降低.随着外科手术技术的发展,大创伤性手术越来越少,细胞来源受限;来源于成人骨髓,细胞免疫分子表达成熟,异体间移植存在的免疫排斥反应不可避免.那么是否可以从细胞较原始的胚胎骨髓分离培养出MSCs?胚胎骨髓间充质干细胞(Human Fetal Mesenchymal Stem Cells,hFBMMSCs)是否具备治疗HIE的生物学特性?采用hFBMMSCs移植能否有效改善HIE所致的功能缺陷?这些就是本研究的主要目的.为此,开展以下4部份研究:第一部份:HUCBC基本生物学特性研究.第二部份:hFBMMSCs基本生物学特性研究.第三部份:HUCBC移植治疗新生大鼠HIE体内实验.第四部份:hFBMMSCs移植治疗新生大鼠HIE体内实验.

关键词： 角膜内皮细胞   间充质干细胞   移植   兔   明胶  

摘要： 目的：分离培养兔角膜内皮细胞（Corneal endothelial cells CECs）和骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells MSCs），观察它们体外生长情况；通过兔CECs移植证明利用明胶（Gelatin）膜载体进行CECs移植治疗角膜内皮损伤的可行性和初步效果，同时初步研究自体MSCs移植到兔角膜内皮细胞部位后其形态和功能的分化。 方法：采用揭膜联合胰蛋白酶消化法分离CECs；光镜和电镜对细胞进行观察；原代CECs用Brdu标记后接种在Gelatin膜载体上；利用α—氰基丙烯酸脘基酯作为组织黏合剂，将接种有CECs的载体与机械去除了内皮细胞的自体兔角膜植片相粘合，原位缝合进行兔眼CECs移植；采用骨髓穿刺密度梯度离心方法分离兔自体骨髓MSCs；并利用PE标记的CD45和FITC标记的CD44单克隆抗体对体外培养的骨髓MSCs进行鉴定；同样的方法用MSCs替代CECs进行移植；对照眼移植没有接种任何细胞的载体膜。术后在不同的时间点观察兔眼角膜移植片的透明情况、角膜厚度和眼压，并利用共焦显微镜进行移植细胞的形态观察和精确计数。术后观察12周，处死动物，角膜标本分别进行组织切片、抗Brdu单克隆抗体免疫组化染色和电镜观察。 结果：揭膜联合胰蛋白酶消化法可以获得高纯度的角膜内皮细胞，体外培养48小时后细胞大部分贴壁，贴壁率54.3％，7～10天基本汇合；细胞呈多角型，排列紧密，有明显的接触抑制。而骨髓穿刺密度梯度离心法获得的MSCs，体外培养96小时内贴壁生长，贴壁率约25.5％；原代培养的前5～6天为细胞的潜伏期，7～12天为细胞的指数增生期，之后进入平台期，大多在14～17天汇合；细胞呈单一的成纤维细胞外观，长梭形，排列呈漩涡状；体外培养的MSCs CD45表达阴性，而CD44表达阳性，纯度可达到94％左右。CECs和MSCs在Gelatin膜载体上生长良好，体外培养3～5天后细胞汇合，细胞密度CECs可以达到