关键词： 骨髓间充质干细胞   脑源性神经营养因子   体外扩增   基因治疗   细胞移植  

摘要： 帕金森病是中枢神经系统常见的一种神经退行性疾病,是由于中脑多巴胺能神经元丢失,导致纹状体多巴胺分泌减少造成的一种老年人易患疾病。随着老龄人口的不断增加,帕金森病已经成为了家庭和社会的沉重负担。时至今日,其发病机理和影响因素还不清楚,似乎环境因素和遗传背景在其中扮演了重要角色。不过,在病理和多巴胺的生化研究中,多巴胺能神经元的死亡和多巴胺的减少还是十分明确的。由于神经递质的失调,从而导致一系列的临床症状的出现,诸如肌肉强直,静止性震颤以及运动减少等。 长期以来,人们一直在探寻一种能从根本上治愈帕金森病的办法,基于其特有的病理学改变,如将能合成和分泌多巴胺的细胞移植入患者的脑内,有可能治疗该病。骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种多能组织干细胞,在体外能诱导分化成间质和非间质细胞。体外有分化为成骨,成软骨,脂肪和肝细胞的先例,也有分化为包括神经细胞在内的其他细胞的报道。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族中的一员,可以由MSCs产生,能促进神经组织的存活和分化。因此,MSCs被看作是治疗神经系统外伤,遗传性疾病和神经退行性疾病的种子细胞。 本实验对人骨髓MSCs进行了分离,纯化和扩增,并在体外利用重组逆转

关键词： 骨髓间充质干细胞   急性心肌缺血   超声心动图   血管密度   细胞移植   冠心病   心脏功能  

摘要： 目的:本实验以兔急性心梗模型为基础,探讨自体MSC移植联合TMLR在治疗急性心肌缺血中是否能提高心功能,是否能提高缺血心肌局部灌注,并探讨联合治疗是否优于单纯MSC移植或TMLR治疗.结论:1.自体MSC移植后,可在心肌微环境下,诱导分化为心肌样细胞,提高心脏功能.2.自体MSC移植联合TMLR治疗心肌梗死,在增加梗死区心肌血管密度方面具有协同性,优于单纯的MSC移植和TMLR治疗.3.自体MSC移植联合TMLR治疗心肌梗死,在提高整体和局部心脏功能方面,显著优于单纯TMLR治疗,但无足够证据表明优于单纯的自体MSC移植.

关键词： 儿童   骨髓间充质干细胞   T 细胞   造血干细胞   趋化   扩增   移植  

摘要： 目的:研究儿童骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSC)在体外对T 淋巴细胞和造血干细胞的作用及移植治疗造血损伤的可行性。 方法:收集正常儿童骨髓单个核细胞贴壁培养,取第三代后的细胞,通过流式细胞仪检测表型;将其按1.0×10、1.0×10分别与活化T 淋巴细胞共培养,通过3H-TdR掺入,β液闪计数,分析其对T 淋巴细胞增殖的影响;分别用1.0×10、1.0×10、1.0×105 个BMSC 培养后的上清液在24 孔趋化板中对T 淋巴细胞和脐血CD34+细胞进行趋化;分别用1.0×103、1.0×104BMSC 作为饲养层,建立脐血单个核细胞培养体系,观察其对造血干/祖细胞的数量及CFU-GM、CFU-E、CFU-GEMM 集落的扩增效率;将SCID 小鼠经60Co2.5Gy 照射后,建立造血损伤模型,将Hoechst33258体外标记的BMSC 按不同数量联合脐血单个核细胞移植给造血损伤的SCID 小鼠,观察第21 天小鼠存活率及外周血白细胞和血小板恢复情况。 结果:(1)儿童BMSC 易培养,流式细胞仪检测分析其高表达CD29、CD44、CD10,不表达CD19 、CD34、CD45;(2)在200ul 培养体系中1.0×10BMSC 促进10×10T淋巴细胞增殖,而1.0×104BMSC 对1.0×105T 淋巴细胞增殖起抑制作用;(3)不同数量级BMSC 培养三天后的上清液对T 淋巴细胞和脐血CD细胞均有趋化作用,但以1.0×10的作用最强;(4) 在200μl 培养体系中,以1.0×10BMSC 作为饲养层的培养体系对造血干祖细胞及集落扩增效率较高,培养早期(第8 天) CD细胞扩增明显,培养后期(第15 天)则主要向定向祖细胞分化;(5)移植实验发现,在相同的植活率下,较高数量(1.0×105)的BMSC 联合脐血单个核细胞移植,可降低一个数量级的造血单个核细胞用量,提高小鼠存活率,加快外周血白细胞的回升。

关键词： 下肢缺血   间充质干细胞   干细胞移植   电刺激   治疗性血管生成   血管内皮生长因子   血管生成素  

摘要： 第一部分同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗下肢慢性缺血的实验研究 目的：研究同种异体骨髓间充质干细胞在后肢缺血大鼠缺血肌肉组织内存活、迁移、分化情况。评价同种异体骨髓问充质干细胞移植的治疗性血管生成作用及治疗下肢慢性缺血的效果。 方法：分离、纯化、扩增培养雄性wistar大鼠的MSCs，并用Brdu标记。20只Wistar大鼠，体重200-250g。经左股总动脉切断后制成后肢缺血模型再随机分成2组：A缺血对照组，BMSCs移植组：大鼠股动脉切断后7天接受同种异体MSCs移植治疗(5×106MSCs／100μl，分6点注入大腿缺血的肌肉)。治疗3周后分别对缺血对照组、MSCs移植组进行了血管造影、皮温测定、新生血管内皮细胞数及毛细血管密度的测定。 结果：同种异体大鼠的骨髓间充质干细胞可在后肢缺血大鼠缺血肌肉组织内存活、迁移、分化为血管内皮细胞形成新生血管;血管造影发现MSCs移植组治疗后侧枝循环明显增加。下肢皮温测定发现缺血的左下肢同正常的右下肢之间的温差，治疗组均较缺血对照组显著降低，(2．66±O．17vs1．04±0．23，P

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌病   细胞移植   心功能   心衰  

摘要： 目的:近年来研究显示骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)移植能够再生心肌组织并能改善局部受损的心脏功能,而对于能否改善心脏功能整体受损的疾病研究较少。本文探讨了①阿霉素(Adriamycin,ADR)静脉给药建立兔扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)模型的可行性;②MSCs自体移植入兔DCM的心肌,在其中的微环境依赖性分化及对心功能的影响。 方法:将46只动物随机分为组Ⅰ:自体移植组,18只;组Ⅱ:心肌病对照组,18只;组Ⅲ:假手术组,10只。分离培养组Ⅰ的MSCs后,将组Ⅰ、Ⅱ的兔耳缘静脉注射ADR(总剂量16mg/kg)建立心肌病模型,将溴氮胞苷(bromodeoxyuridine,Brdu)标记的自体MSCs(1.0x10)和相同体积的无血清培养基分别直接心肌内注射入组Ⅰ和组Ⅱ动物,未经ADR处理的兔作假手术组仅作开胸术而无细胞移植。于术后4周经超声心动图和血流动力学左室终末收缩内径(Ds)、左室终末舒张内径(Dd)、左室射血分数(EF)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室最大收缩及舒张速率(±dP/dt),并取细胞移植部位心肌组织切片,免疫荧光染色检测移植细胞的存活及分化。 结果:术后4周超声心动图与血液动力学指标显示与假手术组相比,移植组和对照组Ds、Dd、LVEDP增加,EF、LVSP和±dP/dt减小,心肌组织严重损伤:心肌细胞呈现广泛的变性、萎缩和部分溶解坏死,胞浆中空泡形成,间质纤维化。与对照组相比,移植组EF、LVSP增加,LVEDP减小,而两者Ds、Dd、±dP/dt无差异;并在心肌内移植部位发现Brdu标记的心肌样细胞,并有心肌肌钙蛋白T的表达。 结论:①兔静脉注射一定剂量的ADR可成功建立起DCM的模型;②MSc移植入ADR心肌病的心肌组织中后,可在其微环境中存活并分化为心肌样细胞,并显著改善左室功能。

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌梗死   心肌细胞   标测   心内膜注射   心肌缺血/治疗   紫杉醇   支架   内皮   血小板  

摘要： 研究背景 冠心病(CHD)具有较高的发病率和致死率,已成为二十一世纪影响人类健康的主要疾病之一。由于CHD的药物治疗不能从根本上去除CHD的发病因素——冠状动脉狭窄,所以,近年来CHD的手术治疗得以广泛开展,包括经皮腔内冠状动脉介入治疗(PCI)和冠状动脉旁路移植术(CABG)。但是,PCI术后较高的再狭窄率(25%～40%)严重影响了手术的中、远期疗效,而且有相当一部分CHD病人(如多支或远端冠状动脉的弥漫性病变以及闭塞支远端血管细小者)不适宜进行上述手术治疗,因此,近些年来人们针对缺血性心脏病的病理生理机制,提出了“细胞水平心肌成形术”(Cellularcardiomyoplasty,CCM)。目前骨髓间质干细胞初步显示出作为干细胞移植种子细胞的潜力,大动物干细胞移植的途径和有效性是目前研究的重点之一。 同时,冠心病介入治疗已经进入第三个里程碑时代—药物洗脱支架(drug eluting stent)时代,目前经过批准和已经临床使用的DES之一的TAXUS支架在国人应用的疗效和安全性,及DES面临的主要问题—亚急性血栓形成的机制及可能的防治措施目前尚缺乏研究。

关键词： 同种异体   骨髓   间充质干细胞   肝硬化   肝细胞样细胞   移植   大鼠  

摘要： 背景与目的 肝硬化是我国常见疾病和主要死亡原因之一。其关键在于预防、早期诊断、针对病因的早期治疗,使病情缓解及延长代偿期。对失代偿期患者主要是对症治疗、改善肝功能和处理并发症。原位肝移植可以从“根本”上治疗失代偿期肝硬化,但供肝缺乏、费用昂贵、需长期服用免疫抑制剂等缺点限制了其在临床的广泛应用。虽然人工肝对改善终末期肝病患者症状有一定作用,但物理型人工肝的发展还不完善,无法替代肝脏的合成及生物转化功能,摆脱不了血液透析,并非真正意义上的人工肝,治疗效果不能达到期望的水平;生物型人工肝由于肝细胞来源匮乏而限制了其临床应用。肝细胞移植治疗也因肝细胞来源所限而停滞不前。目前急需找到一种治疗肝病的高效手段或者解决肝细胞的来源问题。 具有无限或较长期自我更新和多向分化潜能的干细胞及其横向分化特性的研究为各种疾病的治疗提供了一种新的手段。骨髓中含有两类干细胞,一类是造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs),另一类是间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs源于中胚层,具有很强的自我更新能力和可塑性,在适当的条件下,可以跨胚层“横向分化”为不同胚层来源的细胞如成骨细胞、神经细胞、肝系细胞等。MSCs一方面因其来源广泛,取材方便,且对身体无害,另一方面MSCs无免疫排斥反应,所以成为近年来的研究热点。干细胞在生物医学领域取得的成就,为肝脏疾病的治疗提供了新的思路。国内外均已证明MSCs在体内、外均可转化为肝细胞样细胞,并能行使肝细胞的合成、分泌等功能。因此,本课题旨在利用大鼠肝硬化模型,进行性别交叉骨髓MSCs移植,探讨骨髓MSCs体内的整合和对肝硬化治疗的情况,为终末期肝病的治疗提供一种新的治疗手段或为生物型人工肝提供一种新的细胞来源。

关键词： 骨髓间充质干细胞   骨髓单个核细胞   冠心病  

摘要： 目的:探讨骨髓间充质干细胞和单个核细胞的分离、培养。方法:无菌条件下从患者髂后上脊抽取骨髓30～40ml,采用密度梯度离心、贴壁法获取骨髓间充质干细胞,进行体外培养、扩增,并观察所培养细胞的形态;采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。结果:骨髓间充质干细胞在体外生长、增殖良好,刚分离出的骨髓间充质干细胞呈球形,12～24小时后开始贴壁,48～72小时后贴壁完全,细胞呈梭形,生长缓慢。随时间延长,细胞增殖、迁移,逐渐有规律地平行排列。骨髓单个核细胞体外呈圆形,不增殖。结论:密度梯度离心贴壁培养法是一种适合的骨髓间充质干细胞的培养方法;密度梯度离心法是一种适合的骨髓单个核细胞的分离方法。

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌细胞   急性心肌梗死   心力衰竭   细胞移植   心内膜注射   心外膜注射   冠状动脉  

摘要： 急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)及梗死后的心力衰竭(chronicheartfailure，CHF)是严重危害人们身体健康的常见病、多发病。尽管目前临床采用了药物、介入及外科手术等多种治疗方法，但由于血管远端病变、完全闭塞或不能耐受手术等原因对于梗死心肌及血管再生仍然缺乏根本性治疗手段。研究证实胎儿心肌细胞、胚胎干细胞、骨骼肌干细胞、骨髓干细胞等移植，特别是自体骨髓来源的间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，MSCs)作为多能干细胞，具有获得容易，扩增性强，无免疫抑制，易于外源基因的转染和表达等优点，因而可能是细胞治疗和基因治疗的理想靶细胞，可作为心肌梗死后心肌细胞及血管再生、从而改善心功能全新的生物治疗方法。本研究探讨了化学诱导剂浓度对体外MSCs分化为心肌细胞的影响、心内膜注射移植自体MSCs治疗AMI方法的可行性、体外扩增培养的MSCs自体移植治疗AMI的安全性及疗效、并比较三种不同移植途径的治疗效果，以期对干细胞移植用于心肌再生治疗的临床应用提供可靠的实验依据。 一、小型猪MSCs体外分离、培养扩增及向心肌细胞的化学诱导分化 建立小型猪MSCs体外分离、培养、扩增方法，探讨不同浓度5-氮胞苷(5-azacytiding，5-aza)体外诱导小型猪MSCs向心肌样细胞分化的可能性及其对细胞扩增速度的影响。方法：抽取小型猪10ml骨髓液，1.077g/mlFicoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)，第2代传代细胞分别加入3μmol/L、5μmol/L、10μmol/L浓度5-aza化学诱导24小时，与对照组一起连续培养4周，细胞爬片免疫荧光法鉴定结蛋白desmin及心肌特异性肌钙蛋白(cardiactroponinI，cTnI)的表达，电镜观察诱导细胞的超微结构变化。结果：分离出的MSCs在含10％胎牛血清(fetalcalfserum，FBS)的DMEM-F12(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium-F12，DMEM-F12)中生长良好，培养24h即可见长梭形细胞贴壁生长，36～48h内出现多个小克隆，72h细胞克隆增大，7～10天细胞迅速增殖，为形态均一的长梭形，排列密集，细胞生长旺盛时呈旋涡样，10ml骨髓液，2～3周后正常传至第3代即可获得3.8±0.6×106个细胞，继续培养可扩增至10代以上，仍维持原增长特性，未见自发分化。5-aza化学诱导后MSCs形态变长、增大，排列更加紧密、整齐，5μmol/L和101μmol/L组可见较多的多核细胞，部分管状结构，诱导率分别为36％和31％，无显著性差异;3μmol/L组上述变化的细胞极少，三种浓度及对照组4周后细胞扩增数量分别为3.81±0.40×106、3.76±0.62×106、3.67±0.80×106及2.9±0.21×106，10μnol/L组增殖速度明显减慢(P＜0.05)。 二、应用自制心内膜注射导管移植自体MSCs治疗AMI 研制心内膜注射导管，探讨其应用于干细胞移植治疗AMI的可行性。方法：小型猪10只，每只抽取40ml骨髓液，1.077g/mlFicoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，体外扩增培养2～3周、4'6-二脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2'-phenylindole，DAPI)标记后1小时内移植;取6FJR4.o造影导管、8FJR4.0指引导管、27号皮试针头及7F鞘管，改装成可调整针头长度的注射导管。开胸结扎左前降支(1eftanteriordescendingcoronaryartery，LAD)形成AMI后再灌注模型，截取0.014”BMW/ACS导丝头端不透X线部分约20cm缝在梗死部位的心外膜上，作为心内膜移植时的标记，2～3周后经自制的注射导管将DAPI标记的自体MSCs移植入梗死区域的心内膜内，移植前后、6周及3个月超声心动图测定左心功能，3个月时取梗死周围心肌组织冰冻切片，免疫荧光法鉴定结蛋白desmin和cTnI的表达。结果：每40ml骨髓液经2～3周传3代平均获得3.81±0.09×107个MSCs，DAPI标记率为100％;注射导管残留液体约0.5ml，移植细胞重悬液1ml，每点移植细胞悬液100μl，共进行11点心内膜注射，有效移植10.04±0.02点(n=5)，对照组为9.03±0.14点(n=5)，结扎部位及心梗后心外膜标记周围经左心室腔心肌内注射;移植术后6周、3个月左室射血分数(1eftventricularejectionfraction，LVEF)分别为69.3±2.5％、34.9±0.9％、46.6±3.5％、

关键词： 人骨髓间充质干细胞   诱导分化   5-AzaC   DNA甲基化   基因表达  

摘要： 第一部分 5-氮杂胞苷在骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞中诱导机制的研究 作为心脏组织工程学中的种子细胞,干细胞已成为心肌细胞移植的主要对象。由于伦理问题、免疫排斥反应等使胚胎干细胞移植的发展受到制约;成熟组织来源的干细胞即成体干细胞的研究及应用可避免上述问题。 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells MSCs)存在于骨髓基质中,传统认为它参与构成造血干细胞的生存和分化环境,对其起到支持作用,近年来发现MSCs具有向骨骼肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经细胞、胶质细胞、肝细胞、脂肪细胞、骨及软骨等细胞分化的特性即所谓的“横向分化”的能力。MSCs可在体外进行原代和传代培养而仍保持其分化潜能。 大量研究证实MSCs在5—AzaC体外诱导下可定向分化为心肌样细胞,并表达心肌特异性蛋白标志:横纹肌肌动蛋白和连接蛋白43(Connexin-43)。然而,对其诱导机制的探讨,国内外少有报道。 本实验目的:(1)了解人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stemcells hMSCs)的生物学特性;(2)探讨5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-AzaC)在hMSCs分化为心肌样细胞中的可能作用机制。 材料和方法: ***的分离、培养和表面标志测定: 从心肌梗死或心肌病患者髂骨处抽取骨髓液10mL,用Ficoll-淋巴细胞分离