关键词： 细胞心肌成形术   间充质干细胞   基因治疗   疾病模型  

摘要： 背景:由于再生能力有限,心肌梗死（MI）后存活的心肌细胞不能修复梗死区。目前,生物学治疗缺血性心肌病是一种潜在的方法,但细胞移植和基因治疗的联合应用仍有争议。本实验在猪心梗模型上自体移植经5-氮胞苷（5-aza）体外诱导、转化生长因子（pTGF-β3）基因体外转染的骨髓间充质干细胞（MSCs）,探讨移植的MSCs 能否在梗死区存活、向心肌方向分化,以及梗死后心功能和心肌灌注是否得到改善,并探讨其机理。 第一部分猪心肌梗死模型的建立 目的经心导管用明胶海绵栓子栓塞猪的冠状动脉左前降支（LAD）,建立心肌梗死的大动物模型。 方法对7 头猪用明胶海绵经导管栓塞LAD,致前室壁梗死。4 周后行心脏超声、冠状动脉造影及组织学检查。 结果与对照组相比,心梗（MI）组左室舒张未内径（LVEDd）增大（P＜0.01）,射血分数（EF）下降（P＜0.001）;复查冠脉造影提示LAD 栓塞仍存在。MI 组前室壁、室间隔形成了透壁梗死灶,梗死区面积/左室心肌面积为18.4%±1.6%,梗死区厚3.5 mm±0.8 mm。 结论这种模型接近临床病理生理过程,稳定可靠。 第二部分猪骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养及体外转化为心肌样细胞的实验研究 目的建立猪骨髓间充质干细胞体外培养及转化为心肌样细胞的方法,为细胞心肌成形术提供新材料。 方法猪的骨髓MSCs 分离纯化后,流式细胞仪检测细胞周期;用5-氮胞苷（5-aza）诱导后,用抗结蛋白（desmin）、肌球蛋白重链（MHC）、心肌特异性肌钙蛋白I（cTnI）、连接蛋白-43（Cx-43）进行免疫细胞化学染色鉴定。

关键词： 定量组织多普勒   超声心动图   激光心肌血运重建术   骨髓间充质干细胞   急性心肌缺血   自体骨髓干细胞移植  

摘要： 目的:采用定量组织多普勒及其衍生的一系列指标测量、评估局部心肌运动,检测自体MSC移植联合TMLR研究中不同治疗组别在正常时、心梗后及治疗后的心肌运动情况,探讨这些新技术在评价心肌运动以及心肌缺血中的意义.将超声结果与相应病理结果对照,探寻能够定量、客观、敏感、无创、可重复地评价心肌局部收缩功能的新方法.结论:采用自体骨髓干细胞移植技术能够改善实验动物急性心肌缺血后的整体及局部心脏功能,激光血运重建术虽然能够增加缺血区的毛细血管密度,但是未能有效地改善梗死区内局部心肌运动及整体功能.通过与病理结果对照显示定量组织多普勒新技术及衍生的一系列新指标能够敏感、实时地评价不同程度实验性心肌缺血,客观量化评估局部心肌功能.

关键词： 慢性心肌缺血   骨髓间充质干细胞   血营生长素   血管内皮细胞生长因子   细胞移植   基因转染   血管新生   腺病毒载体  

摘要： 目的 评价转染ANG或VEGF基因的自体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗慢性缺血性心脏病的疗效。方法 采用Percoll密度梯度分离和贴壁相结合的万法分离自体MSCs,***或***165转染MSCs并移植于置Ameriod的猪慢性心肌缺血模型上,通过冠脉造影、心脏彩超、MRI,缺血区血管计数,心肌细胞凋亡程度、移植细胞数量及分化的观察,以及目的蛋白的表达,评价治疗效果。结果 获得的MSCs体外增殖速度快及具有多向分化能力,且获得的细胞纯度高,数量多。腺病毒对于MSCs具有很高的转染效率。置环后的动物均为有效的动物模型。转染***和***的MSCs移植后侧支血管增生明显,血管计数增加,Rentrop分数、EF、FS、RSWT改善,梗塞区缩小,心肌凋亡降低而移植细胞的成活率高,目标蛋白表达量增高。结论携带ANG或VEGF基因的自体MSCs移植治疗缺血性心脏病可明显改善心功能,局部血液循环改善明显。

关键词： 骨髓间充质干细胞   阿霉素   心力衰竭   移植  

摘要： 目的:分离纯化骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞移植对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心功能的影响。 方法:1、12 周龄F344 大鼠(n=46)先随机选取10 只作为正常对照组,其余36 只通过腹腔注射阿霉素(2 mg/kg,每周一次,连续6 周)建立心衰模型。6 周后存活大鼠(n=32)再随机分为细胞移植组(n=14)和移植对照组(n=18)。正常对照组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。2、另从8 周龄F344 大鼠分离纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)进行体外培养,采用流式细胞仪对体外培养的MSCs 的表型CD11b/c、CD34、CD44 和CD90 进行鉴定。取第三代MSCs 进行移植。移植前MSCs 用5-溴-2′脱氧尿苷(BrdU)进行标记。3、末次阿霉素注射后一周,将3×10～6个MSCs 通过股静脉注射的方法移植到细胞移植组大鼠。移植对照组大鼠注射等量培养基。细胞移植后4 周,采用生理记录仪测量三组大鼠的心功能,心脏切片行免疫组化了解移植细胞在受体心脏的存活情况。 结果:体外培养的第三代MSCs 流式细胞仪鉴定结果显示:CD44 阳性细胞数占99.8%±0.9%,CD90 阳性细胞数占97.7%±0.4%,而CD11b/c 阴性细胞数占84.2%±0.2%,CD34 阴性细胞占97.91%±0.7%。细胞移植后4 周,在受体大鼠的心脏切片上有BrdU 标记的移植细胞存活。心功能测定显示:与正常对照组(n=10)相比,移植对照组(n=11)大鼠的最大左室收缩压(LVSP)、心率(HR)、左室压上升最大速率(LV+dP/dt)和左室压下降最大速率(LV-dP/dt)均明显下降(分别为86.34±6.53 vs 128.23±14.82,347.17±24.30 vs 451.33±32.78,2292.07±106.04 vs 3776.14±209.98,2226.30±138.93 vs 3264.85±256.22,P 均<0.01),而最大左室舒张末压(LVDP)明显升高(17.31±2.86 vs 3.61±2.53,P<0.01);与移植对照组相比,细胞移植组(n=10)大鼠的LVSP、心率、LV +dP/dt和LV -dP/dt 均有明显升高(分别为126.93±4.26 vs 86.34±6.53,379.78±6.48 vs 347.17±24.30,2892.02±174.51 vs 2292.07±106.04,2815.04±154.11 vs 2226.30±138.93, P 均<0.01),而LVDP 明显降低(11.02±2.74 vs 17.31±2.86,P<0.01);与正常对照组相比,细胞移植组大鼠细胞移植组大鼠的心功能指标中除LVSP(126.93±4.26 vs 128.23±14.82,

关键词： 肌萎缩侧索硬化症   骨髓干细胞移植   力如太治疗   安全性评价  

摘要： 本研究采用病例对照方法，对于符合世界神经病学联盟的El Escorial 1998诊断标准中“确诊”级别和“很可能”级别的散发性肌萎缩侧索硬化（ALS）患者进行自体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植的试验性治疗，通过与两组（非特殊治疗对照组1和力如太治疗对照组）同样诊断级别的ALS患者对照，包括全面体格检查、试验室检查、主观症状的变化、APPEL评分、ALS－FRS评分、ALS/HSS评分和Zung抑郁量表评分的分析，完成MSCs移植治疗ALS的安全性与有效性的初步报告。 目的：探讨自体骨髓间充质干细胞移植治疗散发性ALS的安全性与有效性。 方法：试验组35例患者分别进行骨髓穿刺，对骨髓间充质干细胞进行分离、提取、培养、鉴定、收集。21～28天后通过腰椎穿刺将总量为3×106个，以0.9％的生理盐水定容为5ml的MSCs注入蛛网膜下腔。试验组在治疗前，治疗后1周、2个月进行一般情况、APPEL评分、ALS－FRS评分、ALS/HSS评分和Zung抑郁量表的记录。对照组1(非特殊治疗组)进行间隔时间为2个月的两次APPEL评分。对照组2（力如太组）记录开始服用力如太100mg/天及服用两个月后的ALS－FRS评分。使用SPSS11.0软件包对试验数据进行统计分析。 结果：(1)骨髓间充质干细胞移植治疗的安全性评价：MSCs移植治疗后仅有短时的轻微发热和头痛，未见严重不良事件发生，短期安全性较好。（2）骨髓间充质干细胞移植治疗的有效性评价：A.与对照组1比较：试验组与对照组1个体性别构成、年龄分布匹配。MSC移植治疗一周后与治疗前相比APPEL评分总分和各分项评分变化差异无显著性（p>0.05）。APPEL评分总分在MSC移植治疗2个月后（91.20±30.282）与治疗前（88.43±31.835）相比有统计学显著性差异（p=0.033,p<0.05），各分项的评分变化中，延髓功能评分，呼吸功能评分和肌肉力量评分无显著性差异（p>0.05），而下肢肌肉功能和上肢肌肉功能评分有显著性差异（p<0.05），说明接受细胞移植治疗后，试验组患者的病情仍在进一步发展，虽然肌肉力量评分的变化无显著性差异，但是以肢体活动功能评分的变差为主。对照组1两个月前后APPEL评分总分和各分项评分变化中，延髓功能评分和呼吸功能评分变化无显著性差异（p>0.05），而肌肉力量评分（p=0.012）、下肢肌肉功能(p=0.013)、上肢肌肉功能评分(p=0.009)以及总分(p=0.011)均有显著性差异(p<0.05)，反映出对照组1的患者在肌肉力量、肢体活动和总体病情方面均在加重。若以APPEL评分变化速度为指标来反映病情发展速度，即APPEL评分变化（2个月后－治疗前）/单位时间（2个月），则试验组病情发展速度（2.77±7.369）较对照组（12.35±20.273）为慢，有统计学显著性差异(P＝0.014)。B.与对照组2比较：试验组与力如太组个体性别构成、年龄分布以及病情程度匹配。试验组和力如太组LS-FRS评分变化均无显著性差异（p>0.05）。以ALS-FRS评分变化速度为指标来反映病情发展速度，试验组和力如太组之间也无统计学显著性差异。C.试验组还有一些主观症状的改善，并有少数患者在治疗后症状、体征发生比较明显的改善，显示出“病情逆转”的特征。Zung抑郁量表在一定程度上反映试验组患者接受MSC移植后没有明显的抑郁或焦虑的情绪变化，能够平静的接受试验治疗和配合各项评分检查。 结论：自体骨髓间充质干细胞移植治疗散发性ALS是比较安全的，与非特殊治疗患者比较，MSC治疗在2个月的观察时间内显示了一定的延缓疾病进展的趋势。

关键词： 糖尿病   骨髓间充质干细胞   分化   PDX-1   细胞治疗  

摘要： 对于胰岛细胞功能受损的糖尿病(Ⅰ型及部分Ⅱ型)患者来说,植入胰岛β细胞或其替代物是一个很理想的治疗手段。近年来,经门脉胰岛细胞移植技术在临床上已有开展。但细胞来源不足及严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的广泛应用。干细胞作为一类具有极强自我更新及多向分化潜能的细胞,已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。 大量研究表明骨髓干细胞具有多向分化潜能,它们可以分化成心肌细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、神经细胞等。骨髓干细胞能否分化为胰岛细胞,从而成为糖尿病细胞治疗的种子细胞是本课题想解决的问题。为此,我们首先构建了链脲霉素导致的小鼠胰腺损伤模型(糖尿病模型),然后将分离的骨髓干细胞或间充质干细胞(分4次)经腹腔或尾静脉注射到糖尿病小鼠体内。在移植细胞后定期检测各移植组的小鼠的血糖值,结果显示各糖尿病小鼠的高血糖状态无明显缓解。表明移植的骨髓干细胞并不能发挥细胞治疗作用。在植入细胞后3、4、6、9、12周时分别取胰腺组织作冰冻切片或石蜡切片,利用雌雄标记法进行Y染色体原位杂交,或荧光显微镜直接观察预先经DAPI标记的细胞。原位杂交结果显示移植细胞散在分布于胰腺组织中;通过荧光显微镜观察胰腺冰冻切片,也可检测到DAPI标记的外源细胞。从形态来看,多数细胞分化成腺泡细胞或导管细胞,结合胰岛素的免疫荧光染色未检测到胰岛素阳性的细胞。这些结果表明在胰腺损伤的情况下移植的骨髓干细胞可以定居到胰腺,但并不能分化为胰腺β细胞。分析原因可能与小鼠的高血糖状态不利于移植的细胞向胰岛样细胞分化,或者由于外源细胞分化为胰岛细胞的数量较少,长期高血糖导致这些胰岛细胞功能代偿而再次受到损伤。 鉴于骨髓干细胞移植实验并没有取得治疗效果,我们考虑选择骨髓中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)进行体外扩增、定向诱导分化,然后植入糖尿病小鼠体内观察它们的治疗效果。选择MSCs作为种子细胞,是因为它本身具有很多优势,如易于分离培养扩增,遗传背景稳定,体内植入反应较弱,在特定的诱导条件下可分化为多种中胚层组织细胞,如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞,并可跨胚层分化为神经细胞等。本研究根据胰腺与神经系统具有相似发育机制的特点,设计了诱导hMSCs向胰岛样细胞分化的条件。首先利

关键词： 骨髓间充质干细胞   5-氮胞苷   诱导分化   心肌细胞   急性心肌梗死   心力衰竭   细胞移植   心肌再生   自体   心内膜注射   心外膜注射   冠状动脉   心功能   安全性  

摘要： 急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)及梗死后的心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是严重危害人们身体健康的常见病、多发病。尽管目前临床采用了药物、介入及外科手术等多种治疗方法,但由于血管远端病变、完全闭塞或不能耐受手术等原因对于梗死心肌及血管再生仍然缺乏根本性治疗手段。研究证实胎儿心肌细胞、胚胎干细胞、骨骼肌干细胞、骨髓干细胞等移植,特别是自体骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)作为多能干细胞,具有获得容易,扩增性强,无免疫抑制,易于外源基因的转染和表达等优点,因而可能是细胞治疗和基因治疗的理想靶细胞,可作为心肌梗死后心肌细胞及血管再生、从而改善心功能全新的生物治疗方法。本研究探讨了化学诱导剂浓度对体外MSCs分化为心肌细胞的影响、心内膜注射移植自体MSCs治疗AMI方法的可行性、体外扩增培养的MSCs自体移植治疗AMI的安全性及疗效、并比较三种不同移植途径的治疗效果,以期对干细胞移植用于心肌再生治疗的临床应用提供可靠的实验依据。 一、小型猪MSCs体外分离、培养扩增及向心肌细胞的化学诱导分化 建立小型猪MSCs体外分离、培养、扩增方法,探讨不同浓度5-氮胞苷(5-azacytiding,5-aza)体外诱导小型猪MSCs向心肌样细胞分化的可能性及其对细胞扩增速度的影响。方法:抽取小型猪10ml骨髓液,1.077g/mlFicoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),第2代传代细胞分别加入3μmol/L、51μmol/L、10μmol/L浓度5-aza化学诱导24小时,与对照组一起连续培养4周,细胞爬片免疫荧光法鉴定结蛋白desmin及心肌特异性肌钙蛋白(cardiac troponin Ⅰ,cTnI)的表达,电镜观察诱导细胞的超微结构变化。结果:分离出的MSCs在含10%胎牛血清(fetal calf Serum,FBS)的

关键词： 骨髓   间充质干细胞   细胞移植   扩张型心肌病  

摘要： 作为心肌梗死和心力衰竭的一种治疗手段,细胞移植在过去的10年里逐渐引起了人们的注意。目前已经有很多细胞被用作心肌内细胞移植的供体,包括心肌细胞、平滑肌细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)、骨骼肌成肌细胞、肝脏干细胞等。其中骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自体移植无免疫排斥反应,无伦理道德的争议,取材容易制备简单等优点,是最有前景的一类心肌内细胞移植供体。到目前为止,已有大量基础实验和临床研究证实了MSCs移植用于治疗缺血性心肌病的可行性。本研究将MSCs自体移植到兔扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM),并观察其在DCM微环境中的增殖分化情况及对心功能的保护作用。 目的:研究MSCs体内外分化为心肌样细胞的可行性及条件;研究MSCs自体移植到兔扩张型心肌病后对心功能的影响。 方法:体外部分于无菌条件下骨穿抽取兔胫骨骨髓,分离骨髓间充质干细胞接种培养,并于培养第3天加入诱导剂5-氮胞苷(5-azacytiding, 5-aza)10μmol/L作用24h,培养观察14d后,采用免疫细胞化学方法检测被诱导细胞心肌肌钙蛋白T和α-肌动蛋白的表达,未加5-aza诱导组为对照组。体内部分将健康日本大耳白兔46只随机分为4组:(1) DCM细胞移植组(n=12);(2) DCM对照组(n=12);(3) DCM假手术组(n=12);(4) 正常对照组(n=10)。分离培养DCM细胞移植组MSCs后,前三组动物用盐酸阿霉素建立兔扩张型心肌病(DCM)模型,第四组注射等量生理盐水。模型建立成功后第三周,将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的MSCs自体移植到细胞移植组心肌内,对照组注射培养基,假手术组只开胸,不做注射。细胞移植4周后采用超声心动图检测心脏结构和功能,利用左心导管测定左室压力变化,随后处死动物取左室移植区域心肌组织做冰冻切片,进行BrdU、心肌特异性肌钙蛋白T(Troponin T)、Ⅷ因子相关抗原的免疫荧光染色以观察移植细胞的增殖分化情况。另选部分心肌组织做HE染色查看各组动物心肌组织形态学改变。 结果:① 原代培养中,骨髓间充质干细胞贴壁生长,贴壁后成为纺锤形、梭形的成纤维细胞形态,均以分散的克隆集落的形式增殖;② 5-氮胞苷诱导的细胞形态与心肌细胞形态相似,且心肌肌钙蛋白T和α-肌动蛋白均染色阳性;③ 与正常

关键词： 脑缺血治疗   成纤维生长因子   骨髓间充质干细胞   bFGF  

摘要： 本文从大鼠骨髓中分离出单个核细胞，密度梯度离心后，贴壁培养和扩增，用流式细胞仪对第6代细胞进行CD29、CD106、CD45和CD34抗原检测以证实为MSCs。用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和叔丁基对羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)在体外对MSCs进行诱导分化，然后用免疫细胞化学法检测MSCs神经细胞特异性标志物的表达，鉴定诱导后的细胞分化类型，并观察其变化规律。采用脂质体转染法，将外源性bFGF转入MSCs中，并用RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot方法检测bFGF在转染后的MSCs中的分泌表达情况。最后，将MSCs和bFGF基因修饰的MSCs(MSCs-bFGF)通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内，观察比较两者对大鼠脑缺血后神经功能及脑梗死体积的影响，并应用免疫组化、双重荧光标记方法观察MSCs在脑内迁移和分化情况。经实验得出结论：***在体内外均能分化为神经细胞;***移植对脑缺血具有保护作用;3.b-FGF基因修饰可提高MSCs移植对大鼠脑缺血后损伤的保护作用和神经功能恢复的促进作用，其作用可能与增加移植后MSCs存活率，并提高MSCs向神经元的分化率有关。

关键词： 骨髓间充质干细胞   重组腺伴随病毒载体   基因转染   基因治疗   细胞治疗  

摘要： 研究背景及目的 腺伴随病毒载体是目前进行的基因治疗探索中唯一安全性和疗效稳定的病毒载体。其血清型有8种,不同的血清型由于其包壳蛋白的不同而对不同的组织细胞有不同的感染效率。目前对其感染进入细胞的机制仍不清楚,而应用较多的是血清型2型腺伴随病毒载体。骨髓间充质干细胞作为一种成体干细胞,来源于骨髓,对于维持骨髓的造血微环境及机体的造血功能起着非常重要的作用。它经体外分离培养增殖后,20代内其干细胞的特性不发生改变,同时体外扩增培养的骨髓间充质干细胞经过静脉回输后,可回巢定位到造血器官如:骨髓、肝、脾等部位。且诸多证据证明骨髓间充质干细胞在体外可被作为基因转染的靶细胞。而目前应用腺伴随病毒载体对骨髓间充质干细胞进行基因转染的研究尚未展开。重组人粒巨噬细胞集落刺激因子,在血液系统疾病的治疗中广为应用。能否将重组腺伴随病毒载体和骨髓间充质干细胞的特点结合起来,使粒巨噬细胞集落刺激因子能够长期稳定的在体内表达?因此,我们做如下设想:将重组人粒巨噬细胞集落刺激因子基因和鼠粒巨噬细胞集落刺激因子基因作为靶基因,克隆到重组腺伴随病毒载体上,探索带有重组人粒巨噬细胞集落刺激因子基因和鼠粒巨噬细胞集落刺激因子基因的重组腺伴随病毒载体在体外能否有效转导到人骨髓间充质干细胞。并观察其在体外,和体内的表达情况。从而,为腺伴随病毒载体和骨髓间质干细胞在恶性血液病的基因治疗方面的应用做一