关键词： 治疗   骨髓间充质干细胞移植   脑梗死   骨髓问充质干细胞   中胚层   自身修复   多向分化   自我复制能力   造血   中非  

摘要： 从传统的发生生物学观点来看,成年受损伤大脑不具备结构上有意义的自身修复功能,成熟脑细胞一旦受损就不能再生.骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),又称骨髓基质干细胞,是骨髓中非造血实质细胞的干细胞,具有高度的自我复制能力和多向分化潜能,可分化成多种细胞.传统观点认为,MSCs只能够分化成中胚层来源的间质细胞,如:成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、网状细胞和血管内皮细胞,但近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化,如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等,故MSCs近年来被用于脑缺血动物模型的治疗,初步研究表明它能改善脑缺血动物的神经功能缺失症状,MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法.本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究近况进行综述.

关键词： 移植治疗   自体骨髓   心血管疾病   间充质干细胞   护理   早期发现   血管迷走反射   完善   保障   准备  

摘要： 探讨骨髓间充质干细胞移植治疗心血管疾病的护理,通过总结自体骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性心脏病及扩张性心肌病患者20例的护理经验,提出术前完善的准备、术中娴熟紧密的医护配合,以及术后对心力衰竭加重、再次心肌梗死、心包填塞、血管迷走反射、造影剂肾病等的早期发现、及时处理,保障了骨髓间充质干细胞移植术的顺利开展。

关键词： IL-10   治疗   静脉移植   心外膜   注射   心脏结构   大鼠   浓度   配制   改善  

摘要： 目的 :观察炎症抑制因子IL -10干预后静脉移植骨髓间充质子细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)与心外膜注射MSCs疗效的比较 ,探讨IL -10干预后静脉移植MSCs治疗心肌梗死的可行性。方法 :抽取大鼠股骨和胫骨骨髓 ,获得较纯MSCs ,溴氮胞苷 (BrdU)标记 ,配制成终浓度 3× 10 6/ml细胞悬液备用 ,制备IL -10溶液。结扎大鼠冠状动脉左前降支 ,建立急性心梗模型后随机分为 3组 ,对照组、IL- 10 +MSCs静脉移植组及MSCs心外膜注射组。 4周后处死大鼠 ,检测心肌内MSCs ,观察心脏结构和功能的改变。结果 :细胞移植 4周后可在心梗周边找到BrdU阳性标记的移植细胞。血流动力学和超声检查显示 ,与对照组相比 ,其它各组心脏结构和功能均明显改善 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ,而IL 10 +MSCs静脉移植组和MSCs心外膜注射组之间无明显差别 (P >0 .0 5 )。结论 :IL- 10 +MSCs静脉移植组和MSCs心外膜注射组均能明显改善心脏结构和功能且差异无统计学意义 ,故IL -10干预后静脉移植MSCs治疗心肌梗死可行。

关键词： 骨髓间充质干细胞   皮肤烧伤   细胞移植   治疗   豚鼠  

摘要： 目的探讨骨髓间充质干细胞 (MSCs)治疗皮肤深Ⅱ度烧伤的机制。方法体外培养扩增的MSCs悬液 ,以 2× 10 6/ml(A组 )和 2× 10 7/ml(B组 )两种细胞密度移植给皮肤深Ⅱ度烧的受体鼠创面 ,观察创面愈合速度 ,用免疫组织化学检测因子Ⅷ的表达。细胞移植后的第 15、3 0、5 0天 ,通过PCR方法检测创面皮肤组织中移植供体鼠的Y染色体基因表达。结果A、B组治疗侧的创面愈合速度均快于对照侧 ,A、B组治疗侧间无显著性差异。因子Ⅷ检测示第 15、3 0天时 ,A、B两组的微血管密度均多于对照侧 ,A、B组治疗侧间无显著性差异。PCR检测结果表明 ,第 15、3 0、5 0天时在部分受体鼠恢复的创面上有供体鼠Y染色体基因表达。结论骨髓MSCs对皮肤深Ⅱ度烧伤具有明显的疗效。

关键词： 骨髓   间充质干细胞   帕金森病   移植   分化   大鼠   脑  

摘要： 目的:（1）探讨成体大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）生物学特性;（2）体外诱导MSCs向神经元样细胞分化;（3）制作大鼠帕金森病（PD, Parkinson's disease）模型;（4）移植MSCs治疗大鼠PD,探讨MSCs治疗PD大鼠的可行性及可能的机制。方法:（1）MSCs扩增纯化后,计数培养板中细胞数量,测定生长速度;应用流式细胞仪测定分化前后细胞周期;利用膜片钳技术,了解分化前后细胞的电生理性质。（2）用bFGF联合N2诱导MSCs分化为神经元样细胞,对分化后细胞行免疫细胞化学染色鉴定。（3）应用大鼠立体定向仪,向大鼠内侧前脑束微量注射6-OHDA,制作大鼠PD模型。（4）15只PD大鼠,随机分为2组,一组移植Brdu标记的MSCs到模型大鼠的纹状体内（n=11）,一组注射PBS（n=4）到相同靶点处。术后4个月中定期对大鼠进行旋转实验测试,并分别在术后2周和4月时进行脑内针道处免疫组化TH和Brdu检测。结果:（1）应用贴壁培养筛选法体外完全可以培养出大鼠骨髓MSCs,当MSCs接种浓度为2×10～3/ml时,在标准条件下,约6天可以增殖4倍。在MSCs无血清DMEM/F12培养液中加入bFGF和N2,可以诱导MSCs分化为神经元样细胞,72小时分化率达95.6%,免疫细胞化学染色显示神绎元样细胞NESTIN、NSE、NF阳性表达,流式细胞仪测定分化后细胞G0/G1期97.5%,而分化前细胞S+G2/M期23.7%。但分化前后细胞电生理检测中没有检测到明显的动作电位。（2）注射6-OHDA 12μg到大鼠内侧前脑束,通过大鼠的旋转实验测试,有16只大鼠制模成功,成功率为23.8%,成功大鼠模型的毁损侧黑质处TH阳性神经元仅占正常侧毁损侧3.8%。（3）Brdu标记的MSCs移植到模型大鼠的纹状体内,术后2周及4月时移植针道处及针道周围可见外源性Brdu阳性MSCs,并有外源性细胞表达TH。细胞移植组的PD大鼠症状较PBS注射组行为学也明显改善。结论:（1）骨髓MSCs取材容易,易于体外培养,并可以向神经元样细胞分化。（2）通过注射6-OHDA到大鼠脑内,可以成功制作出PD模型。（3）移植成体骨髓MSCs到大鼠PD模型的纹状体内可以改善PD模型大鼠的症状,且表达TH蛋白。

关键词： 间充质干细胞   VEGF基因   缺血性心脏病   细胞治疗   基因治疗   心肌梗死  

摘要： 心肌梗死是导致猝死和心衰的重要原因之一，其在我国的发病率也日益升高。急性心肌梗死后的基本病理变化是大量心肌细胞丢失，最终由纤维性的非收缩细胞所替代。尽管心肌组织中残余有少量具有轻度扩增能力的心肌细胞，加上心脏外干细胞所具有的有限扩增分化能力，心梗区的心肌细胞可产生一定程度的再生性代偿，然而，此类细胞的代偿，如不加以有效的干预措施，是不足以减轻心梗后心功能衰竭的进行性发展。当前的治疗手段主要有药物、多种介入和外科手术治疗等，但都不尽如人意。因此，为保护幸存的心肌和恢复受损的心脏收缩功能，心肌缺血的细胞治疗和基因治疗逐渐成为基础与临床的研究热点。 骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemCell，BMMSC)是存在于成体骨髓组织中的中胚层发育的早期细胞，可自我更新并具有多向分化潜能，具有来源广泛、分离容易方便、遗传稳定、无免疫排斥和伦理障碍等优势，是干细胞治疗及基因治疗的理想供体细胞。同时，BMMSC可接受多种载体的基因转染并在体内分化后仍保持良好的遗传稳定性，使外源性基因易于得到长期和稳定的表达;而外源性基因在BMMSC中的表达有利于增强其移植效应及提高其分化率。由此，我们设想如能将血管内皮细胞生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)基因转入BMMSC中，并获得有效的表达，再把携带外源性VEGF基因的BMMSC移植到心梗区，就有可能起到基因或细胞治疗二者相互协同、相互促进的作用;其效果可能优于单用。 本实验分为两个部分。第一部分(VEGF基因转染BMMSC)以密度梯度离心一贴壁培养法获取Wistar大鼠BMMSC，采用阳离子脂质体法转染对大鼠BMMSC进重组人VEGF165外源性基因修饰，以ELISA、RT-PCR和Western检测基因表达情况;第二部分(VEGF基因转染BMMSC移植对大鼠心功能的影响)于大鼠心梗2周后心肌直接注射移植携带VEGF基因的BMMSC到心梗区，4周后通过检测心功能、心梗面积、心梗区血管新生及移植细胞的示踪分化等指标，来检验是否优于独立的细胞治疗或基因治疗，并通过RT-PCR分析VEGF基因的体内表达，探讨VEGF基因以BMMSC为细胞载体的表达特征。 第一部分：血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞目的：探讨对大鼠BMMSC进行重组人VEGF165基因修饰的可行性。 方法：1.采用密度梯度离心一贴壁培养法获Wistar大鼠BMMSC。测定其生长曲线，表面标志CD34、CD44、CD45和SH3，进行向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化的研究。2.采用脂质体Lipofectamine2000介导下行pcDNA3.1-hVEGF165转染BMMSC，在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化，通过RT-PCR，Western和ELISA鉴定VEGF在细胞中的表达情况。 结果：1.采用密度梯度离心一贴壁培养法易获取大鼠BMMSC，检测结果为CD44、SH3阳性，CD45、CD34阴性，可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。***-PCR、Western和ELISA检测均证实采用阳离子脂质体Lipofectamine2000能成功地将hVEGF165基因转染至大鼠BMMSC中，并获得有效的表达。 结论：真核表达载体pcDNA3.1-hVEGF165可以成功地在BMMSC中表达，为进一步探讨VEGF基因转染BMMSC移植对大鼠心功能及心室重构的影响提供了实验依据。 第二部分：血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植对大鼠心功能的影响 目的：探讨VEGF基因转染BMMSC后心肌移植对缺血性心脏病心功能及心室重构的影响，并比较联合治疗与基因治疗、细胞治疗单独使用的疗效差别。 方法：以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型，60只心肌缺血模型动物随机分为5组(各组12只)。联合组(Combogroup)在心梗模型建立2周后于心梗区移植转染VEGF基因的BMMSC，细胞组(Cellgroup)移植等量的BMMSC，基因组(Genegroup)注射脂质体-pcDNA3.1-hVEGF165DNA复合物，对照组(Controlgroup)注射等容积的培养液，模型评估组(Model-assessmentgroup)仅用于模型评估;另取12只未结扎冠脉的Wistar近交系大鼠为假手术组，未作任何治疗。移植4周后以Buxco系统检测心功能，测量心梗面积，免疫组化检测Brdu、肌钙蛋白T双染确定移植细胞的存活与分化，通过Ⅷ因子染色检测血管新生，通过RT-PCR检测VEGF基因的体内表达。 结果：冠脉结扎法制作的大鼠心梗模型，其有效使用率为

关键词： 骨髓间充质   干细胞   大脑动脉阻塞   脑梗塞   神经元  

摘要： 本文探讨了MSCs分化为神经元样细胞对损伤脑组织的修复以及其功能恢复的机制，进而评估其有效性、安全性和可靠性，具有积极的临床意义。 　　本文通过网屏握持实验、平衡木实验及抓握牵引实验时间与评分两个指标分析，比较了大鼠在肌力、平衡能力等方面的恢复情况，发现了移植组较对照组而言有一定程度恢复，部分指标未能恢复到正常水平的特点。

关键词： 骨髓间充质干细胞   细胞移植   急性心肌梗死   生长激素   心肌再生  

摘要： 目的 本实验应用骨髓间充质干细胞(MSCs,Mesenchymal Stem Cells)移植与重组人生长激素(rhGH,recombinant human Growth Hormone)注射相结合的方法治疗大鼠急性心肌梗死,评价骨髓间充质干细胞在梗死组织中的存活、生长和分化状态。 方法 取体重150g的雄性Wistar大鼠的长骨骨髓作供体来源,经密度梯度离心和贴壁筛选法培养并纯化MSCs。采用液氮直接冷冻方法建立大鼠的急性心肌梗死模型。将体重160～180g雌雄各半的Wistar大鼠38只随机分为5组:①假手术组(S组,n=6):只开胸而不冷冻心肌;②心肌梗死对照组(C组,n=8);心肌冷冻后注射与MSCs移植组等量的生理盐水;③MSCs移植组(M组,n=8):冷冻大鼠心肌后30min移植培养并经BrdU(5-bromo-2’-deoxyuridine,5-溴-2-脱氧尿苷)标记的MSCs12.5×10个/50μL,分5点注射:④重组人生长激素治疗组(G组,n=8):冷冻大鼠心肌后第2天开始皮下注射重组人生长激素2IU·kg·d共14天;⑤MSCs移植+重组人生长激素治疗组(MG组,n=8):冷冻心肌后既移植MSCs,又注射生长激素。经治疗的存活大鼠4周后处死,称取大鼠体重、心脏重量,计算心脏重量/体重的比值。取心脏组织切片进行HE染色,评价梗死面积、毛细血管密度,BrdU和cTnI(cardiac Troponin I)双重免疫组织化学染色评价移植的MSCs的存活、生长和分化状态。 结果 液氮冷冻法制作的心肌梗死模型大鼠心电图上有ST段弓背向上抬高、

关键词： 间充质干细胞   5-氮胞苷   诱导   心肌细胞   移植   心肌梗死   心功能   间质干细胞   阿托伐他汀   联合   应用  

摘要： 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化为心肌细胞的研究 目的 观察MSCs的生物学特性，探讨5-氮胞苷（5-aza）诱导MSCs向心肌细胞分化的机制。 方法 无菌分离大鼠下肢长骨，密度梯度离心法获取骨髓细胞，用含15％胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培养液培养，通过贴壁筛选法纯化MSCs。细胞生长达80％以上融合时，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，进行传代、扩增。第二代MSCs传代48小时后，四个实验组分别加入不同浓度的5-aza，作用24小时；对照组不加任何诱导剂。用免疫细胞化学法检测诱导后1、2、3周各组细胞对α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、连接蛋白43（Cx-43）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达；通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测MSCs是否分化为心肌细胞。 结果 （1）接种后，MSCs贴壁生长，呈长梭形、多角形等；随着不断换液MSCs得到纯化。原代细胞10-12天达到传代标准。（2）MSCs具有活跃的增殖能力，传代后细胞生长较快，第6-7天生长达到高峰。（3）MSCs经5-aza诱导后，细胞体积增大，形态不规则。（4）免疫细胞化学检测显 示5μM组2、3周、10μM组2周细胞α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43、心肌肌钙蛋白T阳性表达较少；10μM组3周有较多阳性表达。50μM组大部分细胞在培养过程中死亡，弃去。其余未见阳性表达。（5）RT-PCR显示经5μM、10μM的5-aza诱导后2、3周的细胞分别扩增出与目的基因一致的扩增带，表明可表达心肌肌钙蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白。其余未能出现扩增带。 结论 骨髓MSCs易于体外培养、扩增，含15％胎牛血清的L-DMEM培养液符合MSCs生长需要。MSCs具有多向分化潜能，在合适的诱导条件下可分化为心肌细胞。5-aza可诱导MSCs向心肌细胞分化，最合适的诱导浓度为10μM，作用时间24小时。 第二部分 骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死作用的研究 目的 观察同种异体MSCs移植到大鼠心肌梗死区后的增殖、分化情况，研究MSCs移植对梗死心肌和心功能的作用，探讨其机制，为细胞移植治疗急性心肌梗死提供新的种子细胞。 方法 用成年大鼠结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。2周后再次开胸，在梗死心肌周围及中央，三个实验组分别移植L-DMEM培养液、PBS和预先用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记的MSCs。移植前、移植4周后进行超声学检测，了解心功能情况。第二次超声学检测后，处死并取出心脏行常规组织脱水，石蜡包埋，5μm厚连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学染色，观察心肌梗死区细胞及组织学变化。 结果 （1）培养液组和PBS组大鼠的心功能逐渐恶化；MSCs移植组心功能与移植前、同期培养液组和PBS组比较有明显改善（P＜0.05）。（2）MSCs移植组梗死心肌内有BrdU标记阳性移植细胞。（3）MSCs移植到梗死区4周后表达心肌细胞特异性蛋白。 结论 MSCs移植到心肌损伤部位后，能够存活和增殖，在心脏微环境作用下，能分化成心肌细胞。MSCs移植能够修复梗死心肌和改善心功能，是治疗急性心肌梗死可以选择的种子细胞。 第三部分 间充质干细胞移植合并阿托伐他汀应用治疗急性心肌梗死的研究 目的 观察单纯MSCs移植、MSCs移植合并阿托伐他汀应用对急性心肌梗死心功能的不同影响，探讨阿托伐他汀对细胞移植、心肌梗死的作用机制，为提高细胞移植治疗心肌梗死的疗效而提供依据。 方法 建立急性心肌梗死模型，分成四个实验组。培养液对照组：梗死部位注射L-DMEM培养液。阿托伐他汀组：梗死部位注射L-DMEM培养液；术后阿托伐他汀10mg／kg.d溶入生理盐水2ml，灌喂。MSCs移植组：将已标记的MSCs移植到梗死部位4个点，50μl／点（细胞数量2×10～6个）。MSCs移植合并阿托伐他汀应用组：将已标记的MSCs移植到梗死部位4个点，50μl／点；术后阿托伐他汀10mg／kg.d，灌喂。4周后，分别进行超声学检测，了解心功能情况，计算左室射血分数（EF％）和短轴缩短率（FS％）；经颈部腹侧偏右切口，分离右侧颈总动脉，通过压力换能器连接多道电生理记录仪，记录血流动力学指标左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室压力变化最大速率(±dp／dtmax)；应用免疫组织化学法检测心肌组织中细胞和组织

关键词： 骨髓间充质干细胞   细胞移植   心肌梗死   冠心病  

摘要： 目的：随着冠心病治疗的迅速发展，大部分冠心病病人可以得到及时有效的治疗。然而，对于心梗后病人及长期慢性心肌缺血病人即使受损心肌恢复血流灌注，但仍有一部分病人因心肌细胞大量丧失导致心功能不全，心腔扩大，心室重塑，最终走向心衰、死亡。针对这一部分病人曾经尝试多种治疗方式，如心室折叠重建、基因治疗等，但临床效果均不满意。近年来研究表明，细胞移植治疗有望为这一部分病人提供一种新型的很有前途的治疗手段。目前已有很多关于细胞移植的实验研究及部分Ⅰ期临床试验报告。在临床试验中，大多采用自身骨髓单个核细胞，对于更加纯化的人骨髓间充质干细胞(MSCs)的动物及临床试验还鲜有报道。本实验从人的骨髓中提取问充质干细胞，在体外扩增后移植入大鼠梗死心肌，观察移植细胞的存活、分化情况，评估移植细胞对大鼠心梗后心功能的改善程度，探讨细胞移植心功能改善的作用机制，为人骨髓间充质干细胞应用于临床奠定实验基础。 方法：抽取冠心病病人胸骨骨髓液，用Percoll液梯度离心后提取骨髓单个核细胞。将提取细胞接种于具有骨髓间充质干细胞专用培养液的培养瓶中。更换培养液后只保留骨髓问充质干细胞，并进一步体外扩增。培养的人骨髓MSCs进行流式细胞鉴定，体外BrdU细胞标记。制作大鼠心梗模型，取SD大鼠侧开胸后结扎前降支。模型制作后两周进行超声评价，心梗模型评价标准为：①客观指标，心脏FS值＜30％入选。②主观指标，超声科医师判断至少有一个层面的前壁室壁收缩运动明显异常。将同时符合上述两个指标者入选下一步实验，并随机分成细胞治疗组14只和培养液注射对照组13只。分组后立即对心梗大鼠行二次手术，正中开胸，在心梗区内注射已标记的人骨髓MSCs(2×106/100μl)或等体积的细胞培养液。注射后四周再行超声评价，与治疗前超声评价指标进行对比。检测指标包括：左室收缩功能、心室壁厚度、室腔大小、室壁增厚率、左室舒张功能。超声评估后处死动物，固定心脏后取材。沿左室短轴切片，进行HE染色、体内组织BrdU染色、肌细胞结合蛋白、肌动蛋白、心肌肌钙蛋白-Ⅰ免疫组化染色。进行Ⅷ因子免疫组化染色，并在光镜下进行微血管计数。另有8只心梗大鼠，4只2周后进行细胞治疗、4只注射培养液，再于1周后处死取材进行RT-PCR检测。检测的目的基因包括：Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-1、问质细胞源因子、血管内皮生长因子、Bcl-2。 结果： 1、细胞培养结果。经提取的冠心病病人骨髓问充质干细胞体外培养容易生长，可传代15代以上，细胞形态均一。对不同代细胞进行流式细胞学鉴定，均一性表达CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性。体外BrdU标记染色，细胞核染成棕红色。 2、超声评价结果。细胞治疗组和对照组在细胞移植前超声检测无显著差异。细胞移植后四周，细胞治疗组较对照组射血分数值和短轴缩短率显著改善，局部前壁室壁增厚率明显提高，室腔扩大小于对照组。大鼠心脏舒张功能两组无显著差异。 3、组织学检查结果。心梗部位HE染色心肌正常组织结构消失，被纤维瘢痕组织取代。体内组织BrdU染色显示移植细胞存在于心梗及心梗边缘区，散在或成簇排列，部分移植细胞构成微血管的组成部分。连续切片法观察移植细胞体内分化情况，可见desmin、actin染色阳性，而TroponinⅠ染色阴性。Ⅷ因子染色显示细胞治疗组较对照组有更多的微血管生成。 4、RT-PCR检测结果。细胞治疗组梗死区心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因表达水平明显高于对照组，而在非梗死区低于对照组。细胞治疗组梗死区间质细胞源因子、血管内皮生长因子、Bcl-2基因表达水平均明显高于对照组。细胞治疗组和对照组的基质金属蛋白酶-1表达水平无显著性差异。 结论：人骨髓间充质干细胞易于提取和体外扩增，表型稳定。移植到大鼠心梗模型后，可以存活并部分经局部环境诱导后呈现肌样细胞分化。超声评估显示细胞移植可明显改善心梗后心功能，减轻左室重塑。作用机制可能为新血管生成增加、细胞外基质、旁分泌、抗凋亡、心肌再生等共同作用的结果。本实验证明，在动物体内移植冠心病病人骨髓问充质干细胞可行、有效，为其在临床应用提供了实验理论基础。