关键词： 骨髓间充质干细胞   多发性硬化   免疫调节  

摘要： 20例多发性硬化患者按照入院顺序随机分为两组,各10例。观察组给予骨髓间充质干细胞进行治疗,MSCs10×106/次,静脉或鞘内注射,1次/w。对照组给予地塞米松针0.3mg/kg,静脉滴注,1次/d,应用7d后逐渐减量。两组均治疗一个月。对比治疗效果、神经功能,并观察CD4+CD25+T细胞频数秩次的变化。结果观察组治疗总有效率90.0%,对照组70.0%,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,两组患者CD4+CD25+T细胞频数秩次较治疗前有不同程度上升,且观察组显著优于对照组(P<0.01);观察组神经功能评分、EDSS评分显著优于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。骨髓间充质干细胞治疗多发性硬化效果较好,能够有效提升CD4+CD25+T细胞频数,帮助机体免疫机制恢复,改善患者神经功能,有利于疾病的痊愈。

关键词： 脊髓损伤   神经样细胞   神经营养作用   轴突再生   免疫源性   间充质干细胞   激活态雪旺细胞   胶质瘢痕   种子细胞   诱导分化  

摘要： 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）因具有取材方便、能够自体移植、无免疫源性、不受伦理学限制等特征成为治疗脊髓损伤的种子细胞之一[1、2],BMSCs治疗脊髓损伤的机制主要有分化为神经样细胞、抑制炎症反应、神经营养作用及促进轴突再生[3、4]。早期临床实验表明BMSCs移植治疗脊髓损伤安全、有一定疗效[5]。

关键词： 皮肤光老化   二氧化碳点阵激光   骨髓间充质干细胞   疗效评价  

摘要： 皮肤光老化(skin photoaging)是指皮肤长期暴露于紫外线下而发生的形态学和生理学的改变。临床表现为:皮肤粗糙、松弛、皱纹、不规则色斑和毛细血管扩张。组织病理学表现为:胶原成分的减少和弹性纤维变性沉积等皮肤基质构成成分的改变。研究表明，紫外线刺激可以诱导皮肤组织中基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)的表达增高，致使皮肤组织中的胶原发生降解，从而导致皮肤光老化。　　目前有多种方法可以治疗光老化皮肤，常见的有抗氧化剂、微量营养元素、激光治疗等。新技术、新疗法的开发和应用一直以来都是皮肤光老化临床治疗的研究热点。超脉冲CO2点阵激光(ukrapulsed fractional carbon dioxide laser，FPCO2)被公认为是治疗面部皮肤光老化的“金标准”，它通过局灶性光热作用原理达到治疗目的。但是术后有误工期，也可能带来如红斑、红肿、炎症后色素沉着(PIH)等副作用。　　骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向多种组织分化的能力。研究表明BMSCs能在体内外被诱导分化为表皮和真皮细胞并能参与真皮组织的重建。目前，关于联合应用点阵CO2激光和BMSCs治疗皮肤光老化的研究尚未见报道。　　目的：　　本研究通过H&E染色、Masson染色，MMPs家族免疫组化、荧光实时定量PCR、真皮厚度的测量等验证BMSCs与CO2点阵激光联合治疗皮肤光老化的治疗效果。　　方法：　　一、研究对象　　C57BL/6小鼠。　　二、实验步骤　　（一）光老化模型的建立　　将小鼠随机分为对照组和试验组，对照组6只，试验组24只，备皮后给予紫外线照射:将试验组小鼠置于固定器中，放在紫外光疗仪灯具正下方的30cm处，每天1次，连续照射8周。每次照射后都应使小鼠皮肤表面微微泛红，而且在下次照射前退去。　　(二)治疗方法　　皮肤光老化小鼠随机分为4组，每组6只，A组为对照组，即不给予任何治疗;B组为点阵激光治疗组，使用超脉冲点阵CO2激光(Lumenis One TM，Lumenis Ltd，Santa Clara，CA，USA) Deep FXTM治疗头进行治疗;D为干细胞治疗组:骨髓间充质干细胞1ml，分3-5个点皮内注射;C组为超脉冲点阵CO2激光治疗后给予骨髓间充质干细胞皮内注射。　　三、评价方法　　（一）皮肤光老化模型的评估　　通过观察小鼠皮肤外观改变、HE染色和Masson染色进行鉴定。　　（二）治疗后评估　　1、治疗后1周、4周对小鼠外观进行评分并取材。　　2、石蜡切片HE染色分别测定各组真皮厚度变化;Masson染色观察各组胶原纤维含量。　　3、免疫组织化学染色方法(SP)法检测MMP3和MMP9蛋白的表达情况。石蜡切片染色后显微镜下进行拍照，之后Image-pro-plus6.0软件测定面积密度(percentage density，PD)值及积分光密度平均值(optical density，OD)值。　　4、采用荧光实时定量PCR方法检测MMP3和MMP9 mRNA的表达。按照***(@) Mini Kit50试剂盒说明书提取冰冻组织总RNA;按照*** Reverse Transcription System试剂盒说明书反转录合成cDNA;采用*** qPCR Master Mix试剂盒(北京Promega)进行荧光定量PCR扩增，实验结束后导出每个样本的目的基因和内参基因的CT值，通过公式计算F值得出试验组目的基因表达相对于对照组的变化倍数。　　四、统计学分析　　应用SPSS20.0软件进行统计分析，所有数据均以(x)±s表示。两样本比较采用t检验;多样本比较采用单因素方差分析检验。若方差齐，采取LSD检验;若方差不齐，则进行Dunnett'3检验。p＜0.05为有统计学意义。　　结果：　　一、皮肤光老化模型的建立　　紫外线照射8周后，小鼠皮肤外观表现为:皮肤弹性丧失，皱纹变粗变深，有皮革样表现，皮肤表面可见皮屑、色素沉着等。皮肤组织病理学表现为:与对照组比较，试验组出现角化过度，表皮增厚，表皮和真皮交界处平坦。真皮厚度变薄，胶原纤维减少、嗜碱性变，有异常物质沉积。Masson染色结果显示:与对照组相比，试验组真皮层胶原纤维排列紊乱、断裂，数量明显减少;胶原纤维OD值和PD值明显降低，有统计学差异(p＜0.05)。　　二、治疗后外观评分、真皮厚度和胶原纤维的变化　　1、外观评价　　通过外观观察可见:治疗1周时，与对照组相比，干细胞治疗组和联合治疗组皮肤表面皱纹减少，粗糙度减轻。激光治疗组变化不明显。治疗4周时，与对照组相比，3组治疗组小鼠外观皱纹明显减少，皮肤变得

关键词： 基质金属蛋白酶抑制剂-1   骨髓间充质干细胞   肝纤维化   RNA干扰  

摘要： 【研究背景及目的】慢性肝病发展恶化变成肝硬化,需经共同路径-肝纤维化(hepatic fibrosis),在此过程中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)不正常沉积是主要的病理特征。肝纤维化的病理改变具有可逆性和动态性,但是肝硬化不能够发生逆转。所以对于慢性肝病的防治,重点在于明确肝纤维化的发病机制,阻断、抑制及逆转肝纤维化。干细胞在一定的内环境下能够定向分化为类肝细胞,分泌相关细胞因子,促进受损肝脏的修复和再生。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是干细胞家族的重要成员,具有低免疫原性和多向分化潜能等特性,是目前研究范围最为广泛的一种成体干细胞。最近几年,骨髓间充质干细胞移植在逆转肝纤维化方面的作用已经得到证实,有望成为肝纤维化治疗的新方法。虽然目前存在研究结果显示,出现组织损伤时多种干细胞会受骨髓的作用移动到发病部位,然后进行自然性、代偿性地修复;但是干细胞移植治疗肝纤维化的疗效仍不确切,其中重要的原因之一是干细胞静脉途径移植后,干细胞很难得到出色的归巢或移行效果,从而影响干细胞的移植治疗,导致疗效较差。因此,要提升干细胞移植的治疗效果,需要进一步提升移植干细胞的“质量”。越来越多的研究把基因治疗的方法和干细胞移植结合起来以提高治疗的精准度。基因治疗是一种新型的治疗手段,它的特点是在靶细胞的染色质基因组内导入正常与野生型的基因,将致病基因置换,或者将缺失基因补偿,最终得到新的表型。RNA干扰(RNA interference,RNAi)的特点是通过内、外源性双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)进行诱导,使基因沉默在mRNA的水平上产生,它的特异性较强。小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)具有特异性与高效性,现阶段在基因组功能实验的过程中,它被应用的频率较高。siRNA和以前常用的基因抑制工具的不同点在于,sirna对基因表达的抑制水平与效果更好、更持久,稳定性更出色,得到的基因序列具有更高的特异性。rnai这项新型技术可用于特定基因功能的抑制过程中,在生物体特征改善、药品研究、基因治疗及基因组功能研究等方面均可发挥重要的作用。rnai可由慢病毒载体、质粒介导,前者可以感染类型更多样的细胞,获得更出色的沉默效果,得到更高的转染率,并且利用染色体整合使沉默效果更加稳定与持久,所以在基因治疗与基因表达调控等方面,它的应用频率更高。小发卡或短发卡rna(asmallhairpinrnaorshorthairpinrna,shrna)是一段具有紧密发卡环(tighthairpinturn)的rna序列,常被用于rna干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shrna导入细胞,载体中的u6启动子确保shrna总是表达;这种装载了shrna载体可被传递到子代细胞中去,从而使基因的沉默可被遗传。shrna的发卡结构可被细胞机制切割成sirna,然后sirna结合到rna诱导沉默复合物上(rna-inducedsilencingcomplex,risc),该复合物能够结合到目的mrnas并将其降解,起到基因沉默的作用。干细胞之所以能够在循环后在内皮细胞表面黏附,是病变处表达的粘附因子起到了介导作用,接着趋化因子发挥作用,使干细胞通过内皮细胞转移至相关组织内,最后到达病变部位开始分化与增殖过程。各种自然障碍会在干细胞归巢时相遇,例如基底膜与间质结缔组织之间的ecm。干细胞想要通过emc,必须借助于某些酶的作用,这些酶可以对ecm的构成成分进行降解。所以干细胞生成与分泌的蛋白酶类型与机理是干细胞研究的关键。对于ecm的特异性降解,可以发挥作用的酶包括基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶。最近几年的研究结果显示基质金属酶(matrixmetalloproteinase,mmps)能够降解ecm,而体内天然存在的基质金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorofmatrixmetalprotease,timps)则可对mmps的活性进行抑制。相关结果显示干细胞穿过基底膜的能力可以通过timp-2、mti-mmp、mmp-2的稳定表达而得到加强,mmp-9不会被干细胞表达,即便被表达,表达量也很低,但是在干细胞的转移与归巢过程中mmp-9发挥了一定的作用。timp-1与timp-2的作用有着显著差异,如果timp-1的表达时间长、表达量高,那么干细胞穿过基底膜的能力会受到抑制,这是因为mmp-9的活性受到了抑制。因此,我们设想通过沉默timp-1,上调mmps的表达增强干细胞穿过基底膜的能力,促进干细胞归巢到纤维化肝脏组织,提高肝纤维化的治疗疗效。本实验在大鼠骨髓间充质干细胞中转染了携带有ti

摘要： We investigated changes in PA levels by the treatment of human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) in ischemic stroke in rat brain model and in cultured neuronal SH-SY5Y cells exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD). In ischemic rat model, transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) was performed for 2 h, followed by intravenous transplantation of hBM-MSCs or phosphate-buffered saline (PBS) the day following MCAo. Metabolic profiling analysis of PAs was examined in brains from three groups: control rats, PBS-treated MCAo rats (MCAo), and hBM-MSCs-treated MCAo rats (MCAo + hBM-MSCs). In ischemic cell model, SH-SY5Y cells were exposed to OGD for 24 h, treated with hBM-MSCs (OGD + hBM-MSCs) prior to continued aerobic incubation, and then samples were collected after coculture for 72 h. In the in vivo MCAo ischemic model, levels of some PAs in brain samples of the MCAo and MCAo + hBM-MSCs groups were significantly different from those of the control group. In particular, putrescine, cadaverine, and spermidine in brain tissues of the MCAo + hBM-MSCs group were significantly reduced in comparison to those in the MCAo group. In the in vitro OGD system, N-1-acetylspermidine, spermidine, N-1-acetylspermine, and spermine in cells of the OGD + hBM-MSCs group were significantly reduced compared to those of OGD group.

关键词： 急性肾损伤   骨髓间充质干细胞   麝香酮   凋亡   炎症反应   细胞迁移  

摘要： 急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一类常见的临床肾脏疾病,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)对AKI的治疗作用已被多个研究组证实,但是,近年来研究发现,BMSCs通过静脉注射体内移植后,只有很少部分细胞可以迁移到受损肾脏组织中,这在很大程度上影响了细胞的治疗效果,因此,如何开发新的治疗模式,优化BMSCs向损伤区域的迁移效率,进而提高BMSCs对AKI的治疗效果,是本研究领域亟待解决的科学问题。麝香酮具有抗凋亡、抗氧化应激作用,而且对BMSCs的增殖、分泌以及向损伤部位的迁移均存在正调控作用。那么,麝香酮是否可以与BMSCs联合应用治疗AKI,从而优化单一干细胞的治疗效果?这一问题在国内外尚未见相关报道,所以,本研究通过体内外实验,对这一科学问题进行分析和探索。本研究首先从大鼠骨髓和肾脏组织中分离获得大鼠BMSCs和肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs),并对细胞的表型及功能进行鉴定,从而建立大鼠BMSCs和RTECs的分离和鉴定平台,然后以不同浓度(对照组:0.0mg/L,低剂量组:0.3 mg/L,中剂量组:1.0 mg/L,高剂量组:3.0 mg/L)的麝香酮分别作用于大鼠BMSCs和RTECs,初步评价麝香酮对大鼠BMSCs和RTECs增殖和分泌功能的影响。其次,通过高剂量庆大霉素腹腔注射的方法制备大鼠AKI模型,利用麝香酮和BMSCs对AKI模型进行治疗。实验组分为正常组、模型组、阳性药组(以地塞米松作为阳性药)、麝香酮治疗组、BMSCs治疗组和联合治疗组(同时给与麝香酮和BMSCs进行治疗)。1周后,从肾脏重量系数、肾功能相关的生理生化指标、组织病理变化等角度,评价各实验组的治疗效果,同时,从抗凋亡、抗炎症和促进细胞迁移等方面,分析麝香酮辅助BMSCs治疗大鼠AKI的作用机制。实验结果表明:本研究分离获得的大鼠BMSCs和RTECs具有正常的细胞表型,且BMSCs具有成骨分化和成脂分化的能力;麝香酮可以显著促进大鼠BMSCs的增殖(P﹤0.05),并提高BMSCs的BMP-7分泌水平(P﹤0.05),但是,麝香酮对RTECs的增殖和分泌能力并无显著影响。采用庆大霉素制备的AKI模型大鼠的肾脏重量系数显著增加,同时血肌酐、尿素氮等肾功能相关的生理生化指标均发生紊乱,肾脏组织中的肾小管和集合管结构肿胀变性,出现管腔积液等病理特征。经过地塞米松、麝香酮和BMSCs的治疗,上述症状均在不同程度上得到了缓解,特别是在肾脏重量系数和某些肾功能相关的生理生化指标方面,与单一BMSCs治疗组和麝香酮治疗组相比,联合治疗组的肾脏重量系数显著降低(P﹤0.05),且血液中肌酐和尿液中的尿素氮含量也更为接近正常组。在抗凋亡分析方面,Tunel染色结果表明:与单一治疗模式相比,联合治疗可以更好的缓解细胞凋亡,同时,也可以显著的抑制肾脏组织中凋亡基因Caspase和Bax的表达(P﹤0.05);在抗炎症分析方面,各个治疗方法对肾脏组织中炎症相关因子MCP-1、IL-10、RANTES和MIP-2的表达均具有显著的抑制能力,联合治疗组与单一BMSCs治疗组和麝香酮治疗组相比,其肾脏组中RANTES和MIP-2的表达显著降低(P﹤0.05);此外,体外trans-well实验表明:经过麝香酮作用处理后,BMSCs的迁移能力显著提升(P﹤0.05),同时,联合治疗组中的BMSCs也具有更强的向肾脏组织中迁移的能力,后续的初步机制分析表明:这种迁移能力的提升,可能与麝香酮作用后细胞中CXCR4和CXCR7的上调相关。总之,本研究以AKI的治疗为核心,以BMSCs的生物疗法为基础,以麝香酮优化BMSCs在AKI治疗方面的作用效果,研究结果初步表明:针对AKI,与单一BMSCs治疗或麝香酮治疗方法相比,二者联合治疗模式具有更好的治疗效果。这一联合治疗模式避免了在传统AKI治疗中化学药物毒副作用偏大、单一BMSCs治疗效果受限等问题,所以,BMSCs联合麝香酮的技术方法为AKI的治疗开发了一种新型生物治疗模式。特别是基于麝香酮在临床实践中的可应用性,以及BMSCs在培养扩增方面的可操作性,从实际临床应用的角度来讲,该方法在AKI的治疗方面,具有着巨大的应用意义。

关键词： 骨髓间充质干细胞   重组质粒   干扰素-α2b   基因治疗   基因转染   骨髓间充质干细胞   肝癌   干扰素-α2b   基因治疗   Notch信号通路  

摘要： 第一分部人IFN-α2b基因真核表达质粒的构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达[目的]构建并鉴定人干扰素-α2b (IFN-α2b)基因真核表达质粒pcDNA3.1-IFN-α2b,观察重组质粒pcDNA3.1-IFN-α2b转染人骨髓间充质干细胞(BMSC)后IFN-α2b基因在BMSC中的表达,研究IFN-α2b基因转染对BMSC增殖能力和间充质干细胞特性的影响。[方法]根据基因数据库中人IFN-α2b基因的序列,应用premier 5.0软件设计人IFN-α2b基因的特异性引物。从第三代人BMSC中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从总RNA中扩增IFN-α2b基因全长cDNA片断,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收IFN-α2b基因,cDNA和空质粒进行限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切,用T4DNA连接酶连接构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-IFN-α2b。重组质粒经RT-PCR鉴定及基因测序鉴定,将基因测序结果进行基因同源性比对。培养人BMSC,采用脂质体转染方法将重组质粒pcDNA3.1-IFN-α2b转染至人BMSC,qPCR检测转染后的BMSC细胞中IFN-α2b基因mRNA的表达,ELISA检测培养液中IFN-α2b蛋白的表达。倒置相差显微镜观察转染后的BMSC细胞形态；MTT法检测BMSC-IFN-α2b细胞的增殖能力。流式细胞仪检测BMSC-IFN-α2b细胞表面分子CD44、CD90、CD34和CD45分子的表达变化。转染的BMSC-IFN-α2b细胞进行成骨细胞、脂肪细胞分化诱导培养。[结果]重组质粒pcDNA3.1-IFN-α2b经PCR扩增后凝胶电泳,扩增基因片段为IFN-α2b基因片段,基因测序证实与基因数据库中公布的人IFN-α2b基因序列完全一致。qPCR检测证实人IFN-α2b基因成功转染入人BMSC细胞中。ELISA检测显示IFN-α2b蛋白可被BMSC表达并分泌至细胞外,IFN-α2b表达高峰出现于转染后第3d,转染后12h、Id、2d、3d、4d、5d、6d和7d各时间点的表达量均显著高于未转染和空质粒转染的BMSC (P<0.05)。pcDNA3.1-IFN-α2b质粒转染的BMSC细胞形态、细胞表面分子CD44、CD90、CD34和CD45的表达均无变化,转染后BMSC细胞增殖能力无显著性改变,并可继续分化诱导成骨细胞和脂肪细胞。[结论]利用RT-PCR技术成功构建了人IFN-α2b基因真核重组表达质粒pcDNA3.1-IFN-α2b。人BMSC可被重组质粒pcDNA3.1-IFN-α2b转染,并表达基因产物。人IFN-α2b基因转染的BMSC仍然保持间充质干细胞的特性。第二部分人IFN-α2b基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗肝癌的实验研究[目的]研究表达人IFN-α2b基因的人骨髓间充质干细胞(BMSC-IFN-α)对体外培养的人HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖抑制作用；观察BMSC-IFN-α2b移植对裸鼠皮下种植性HepG2肝癌的抑制作用,并探讨可能的分子机制。[方法]1.体外实验1.1 BMSC-IFN-αb及其条件培养基对肝癌细胞活力影响的比较构建人IFN-α2b基因真核重组表达质粒pcDNA3.1-IFN-α2b,利用脂质体介导pcDNA3.1-IFN-α2b重组质粒转染人BMSC,收集BMSC-IFN-α2b及空质粒转染的BMSC的细胞及条件培养基(Conditioned Media, CM)。HepG2和Huh7肝癌细胞分别分为5组：对照组、BMSC共培养组、BMSC-IFN-α2b共培养组、BMSC-CM组和BMSC-IFN-α2b-CM组。对照组HepG2和Huh7肝癌细胞用H-DEME培养；BMSC-CM组HepG2和Huh7肝癌细胞用空质粒转染的BMSC条件培养基培养；BMSC-IFN-α2b-CM组HepG2和Huh7肝癌细胞用BMSC-IFN-αb的条件培养基培养。肝癌细胞培养干预48h,MTT法检测肝癌细胞活力,进行各组间HepG2和Huh7肝癌细胞活力的比较,评价BMSC-IFN-α2b及BMSC-IFN-α-CM对肝癌细胞活力的影响是否具有等效性。1.2 BMSC-IFN-α2b抑制肝癌的体外研究人HepG2和Huh7肝癌细胞分别分为4组：对照组、BMSC-CM组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b-CM组。对照组肝癌细胞用H-DEME培养；BMSC-CM组肝癌细胞用空质粒转染的BMSC的条件培养基培养；IFN-α2b组在肝癌细胞培养基中加入重组人IFN-α2b (500IU/ml); BMSC-IFN-α2b-CM组肝癌细胞用BMSC-IFN-a2b的条件培养基培养。各组肝癌细胞分别培养

关键词： 骨髓间充质干细胞   培养   鉴定   分化   CXCR4   骨髓间充质干细胞   慢病毒载体   间充质干细胞   CXCR4   椎间盘   治疗   纤维环穿刺   椎间盘退变   动物模型   兔   CXCR4   干细胞   椎间盘   趋化   移植  

摘要： 第一部分：兔骨髓间充质干细胞的培养及鉴定目的：体外分离、培养和扩增的新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs).对培养细胞进行鉴定,为后续实验提供细胞来源。方法：麻醉后无菌获取2周龄新西兰大白兔股骨及胫骨,剪开髓腔,获取骨髓液,用贴壁培养法培养,通过传代纯化筛选得到MSCs,应用MTT法绘制细胞生长曲线,从细胞形态、流式细胞仪分析表面标记物以及成骨、成脂、成软骨分化等方面鉴定MSCS。结果：贴壁培养获取的兔骨髓间充质干细胞经过三代的培养逐渐得到纯化,成熟的干细胞在显微镜下表现为短梭形,轮廓清楚,胞核明显,呈圆形,核质比大。细胞融合后传代培养生长迅速,生长力旺盛,数日即能再次融合,流式细胞仪结果显示MSCs细胞均一性好,97%以上细胞表达干细胞表型CD29、CD90,不表达造血细胞表型CD45及CD34。经过诱导分化培养后MSCs向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,具有干细胞多能横向分化潜能。结论：利用贴壁法培养获得的兔MSCs,经过传代纯化后可以得到纯度较高的MSCs,所得细胞具有干细胞特性,能多向分化,可作为再生医学的种子细胞。第二部分：CXCR4基因转染兔骨髓间充质干细胞目的：探讨运用慢病毒介导CXCR4基因转染兔骨髓间充质干细胞的方法及其提高细胞体外迁移能力的可行性。方法：用慢病毒表达载体Rabbit CXCR4-pIRES2-EGFP(前期构建)和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度,慢病毒感染MSCs。转染后用台盼蓝染色观察其细胞活力。通过QPCR的方法从mRNA水平检测CXCR4基因在MSCs中表达,用Western blot法检测CXCR4蛋白的含量。通过Transwell趋化实验来检测经过CXCR4转染后的MSCs向SDF-1趋化能力的变化。结果：CXCR4基因转染后的兔MSCs能成功表达CXCR4,转染后干细胞的CXCR4的基因水平和蛋白水平均显著升高。台盼蓝染色显示转染前后细胞活力无明显改变。Transwell趋化实验表明转染CXCR4基因后的MSCs对SDF-1的趋化能力,比未转染的MSCs明显升高(P<0.05)。加入CXCR4阻断型抗体AMD3100可有效抑制基因修饰细胞向SDF-1的迁移。结论：通过慢病毒载体能成功将CXCR4基因转染至兔MSCs,转染后对干细胞活力无明显影响,转染后干细胞高表达CXCR4,并能明显提高MSCs向SDF-1趋化的能力。第三部分高表达CXCR4的间充质干细胞对正常椎间盘退变的影响目的：初步探讨高表达CXCR4的骨髓间充质干细胞对正常椎间盘退变的延缓作用,为CXCR4-MSCs治疗椎间盘退变提供方法及理论基础。方法：通过慢病毒载体介导CXCR4基因转染兔骨髓间充质干细胞,使后者高表达CXCR4。取15只新西兰大白兔,全身麻醉后经腹膜后入路暴露椎间盘,用21G针头对L3/4、L4/5、L5/6椎间盘穿刺抽吸髓核后,随即向椎间盘注入20μl PBS或106个/mlCXCR4-MSCs或106个/ml MSCs,从而将实验分为：PBS组(对照组)、CXCR4-MSCs组和MSCs组。术后4周、8周从椎间盘高度指数、组织学、C012及Aggrecan mRNA含量改变等方面观察椎间盘改变,评估干细胞治疗椎间盘退变的疗效。结果：基因转染后荧光观察及Western Blot证实干细胞高表达CXCR4。移植术后4周,三组的椎间盘高度指数均较移植前明显下降,但三组之间差异无统计学意义；术后8周,CXCR4-MSCs组椎间盘高度指数降低较少,与PBS组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。移植后4周及8周,组织学可见CXCR4-MSCs组和MSCs组移植后椎间盘退变相对PBS组显著减慢,表现出一定的延缓退变作用。RT-PCR结果表明,术后8周,CXCR4-MSCs组和MSCs组Aggrecan mRNA相对表达量较PBS组多,差异具有统计学意义(P<0.05)；术后8周三组间Col2 mRNA表达无显著性差别。结论：CXCR4基因转染MSCs能移植椎间盘明显提高髓核Aggrecan mRNA表达,提高椎间盘高度指数,延缓椎间盘退变。第四部分：兔椎间盘退变模型的制作与评价目的：建立一种简单、有效、可重复的新西兰大白兔椎间盘退变模型。方法：取健康成年新西兰大白兔18只,体重在4.4±0.27kg,雌雄不限,排除脊柱畸形。1%戊巴比妥钠麻醉后经腹膜后入路暴露L3/4、L4/5、L5/6三个椎间盘,采用21号针头从椎间盘侧前方刺入,采用自制的限制器将穿刺深度控制在5mm,穿刺针在椎间盘内停留5秒,负压抽出髓核组织,反复穿刺三次。以L2/3,L6/7为对照。术后2、4、8周随机选取6只兔子

关键词： 间充质干细胞   急性肺损伤   糖原合成激酶-3β   Wnt/β-catenin信号通路   氯化锂  

摘要： 背景:急性肺损伤(ALI)是一种严重的疾病,也是造成危重患者出现并发症与死亡的主要因素之一。目前最常用于治疗ALI的方法是机械通气,机械通气能够为危重患者提供必要的生命支持,但是会导致肺功能和结构的改变。间充质干细胞(MSCs)疗法是一种很有前景的新疗法,被认为能够治疗急性肺损,但是其治疗机制尚不明确。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)与多种疾病的发生有关,因此假设GSK-3β能够作为急性肺损伤的治疗靶点。目前的研究中,我们侧重于探究可能增强干细胞疗效的因素,哪些能够改善干细胞治疗的疗效。本研究旨在探索在体内间充质干细胞用于治疗急性肺损伤中,联合使用GSK-3β选择性抑制剂LiCl的作用。方法:实验选用40只成年SD大鼠,随机分为4组:1.对照组(5mg/kg生理盐水),n = 10.2.急性肺损伤组(ALI)(15 mg/kg 脂多糖(LPS)),n=***+MSCs组(LPS作用2 h后,尾静脉注射MSCs治疗),n = ***+MSCs+LiCl 组(LPS 作用 2 h 后,MSCs 和 20 mg/kg LiCl治疗).实验中,每隔24 h注射一次LiCl以保持血药浓度。在第12 h收集血清,用ELSA方法检测炎症细胞因子的浓度变化。实验第7天采集肺组织,RT-PCR方法检测肺泡上皮细胞膜蛋白A,C(SP-A,C)的基因表达以确定肺泡上皮Ⅱ型细胞的变化,以及Wnt/β-catenin信号通路上的β-catenin和GSK-3β基因表达情况。分别在第7、14天利用WB、苏木素和马松染色方法分别检测β-catenin蛋白的表达情况和肺组织变化。最后,用形态学分析表示胶原纤维的面积百分比。结果:结果显示,在LPS模型中,用GSK-3β抑制剂(LiCl)辅助MSCs治疗组可更有效的抑制血清中的炎症因子的表达,且SP-C的mRNA的表达显著升高。此外,实验第7天,与MSCs组相比,MSCs联合LiCl组的炎症细胞浸润程度,肺水肿,病理损伤和胶原沉积均显著下降。第14天与第7天相比,肺组织中β-catenin的蛋白表达,不规则细胞和胶原沉积均显著增多。结论:本研究可以看出GSK-3β抑制剂在体内急性肺损伤早期治疗中(<7天)可明显提高MSCs的治疗作用。但过多的使用GSK-3β的抑制剂则可引起β-catenin的异常表达,即导致纤维化阶段(>14天),同时引起不规则的细胞增殖。

关键词： 骨髓间充质干细胞   CXCL13   质粒   股骨头坏死   趋化   髋关节   股骨头坏死   关节置换   髋关节表面置换   股骨头坏死   直接前入路   髋关节置换   学习曲线   病例对照  

摘要： 第一部分CXCL13转染的骨髓间充质干细胞治疗激素性大鼠股骨头坏死的初步实验研究目的 初步探讨CXCL13转染的骨髓间充质干细胞治疗大鼠激素性股骨头坏死的实验疗效。方法 首先构建CXCL13的质粒,经慢病毒包装后转染大鼠骨髓间充质干细胞。利用脂多糖联合大剂量甲强龙建立大鼠激素性股骨头坏死模型,观察转染了 CXCL13的骨髓间充质干细胞是否增强MSCs的迁移能力。结果 成功构建CXCL13慢病毒质粒。运用LPS联合大剂量甲强龙注射成功建立了早期激素性股骨头缺血性坏死模型。Boyden小室法发现CXCL13转染的骨髓间充质干细胞体外能明显增强正常MSCs迁移率。结论 1 cxc113慢病毒质粒具有感染细胞的能力,兼具CXCL13基因表达的能力。2利用脂多糖联合大剂量甲强龙可以成功建立股骨头坏死模型,造模时间短,效果好。3 CXCL13转染的骨髓间充质干细胞体外可以增强MSCs的迁移率,需要进一步在体内动物实验研究其具体效应及分子机制。第二部分人工髋关节表面置换术治疗股骨头坏死疗效观察目的 探讨人工髋关节表面置换术(hip resurfacing arthroplasty,HRA)治疗年龄<55岁中青年股骨头坏死患者的临床疗效。方法 2008年1月一2009年4月采用HRA治疗Ficat Ⅲ期或Ⅳ期股骨头坏死患者34例,其中男19例,女15例;左髋16例,右髋18例;年龄平均54岁(33～59岁)。病因:酒精性9例,激素性8例,创伤性7例,不明原因10例。病程2～11年,平均5年。股骨头坏死改良Ficat分期为Ⅲ期26例,Ⅳ期8例。采用Harris髋关节评分系统(Harris hip score,HHS)和改良加州大学洛杉矶分校(UCLA)活动评分评估患者临床效果;术后摄X线片评估假体位置是否松动,并测量臼杯外展角、颈干角和股骨假体-股骨外侧皮质长度比判断术后有无股骨头假体塌陷。结果 术后32例患者获随访,平均随访时间78个月(70～84个月)。术后患者切口均Ⅰ期愈合,无切口感染、下肢深静脉血栓形成等术后早期并发症。随访期间均无假体松动、感染、股骨颈骨折、脱位及炎性假瘤等并发症发生。术后3天与6.5年比较患者臼杯外展角、颈干角及股骨假体长度与股骨外侧皮质长度比,差异均无统计学意义(p>0.05)。术后6.5年患者HHS评分和改良UCLA活动评分分别为(95.22±1.47)、(7.70±1.13)分,均显著优于术前的(50.1±2.27)、(3.9±0.9)分,比较差异均有统计学意义(p<0.05)。结论 严格掌握手术指征,HRA可作为治疗年龄中青年Ficat Ⅲ期或Ⅳ期股骨头坏死患者的有效方法。第三部分学习曲线阶段的微创直接前入路与传统后外侧入路THA临床疗效的对比研究目的 对比在学习曲线阶段的微创直接前入路(direct anterior approach,DAA)与传统后外侧入路全髋关节置换术治疗股骨头坏死患者的临床疗效。.方法 回顾性分析2008年1月至2009年12月收治并获随访的48例股骨头坏死FicatⅢ或Ⅳ期并行全髋关节置换手术治疗的患者资料,其中DAA组21例,男11例,女10例,平均年龄(65.2±4.3)岁;后外侧入路组27例,男16例,女11例,平均年龄(63.6±4.0)岁。比较两组患者的手术时间、术中出血量、术后卧床时间及术后并发症,术后一个月时测量髋臼杯外展角及股骨柄假体颈干角。术后1个月、6个月和5年时分别采用Harris髋关节功能评分(HHS)和视觉模拟评分法(VAS)评定髋关节功能及患髋疼痛情况。结果 所有患者术后获随访,时间48～73个月,平均60.4个月。DAA组手术时间[(78.30±5.08)min]较后外侧入路组[(75.61±10.60)min]长,术中出血量[(351.30±21.46)ml]少于后外侧入路组[(362.20±26.15)ml],但差别无统计学意义。术后卧床时间DAA组为(2.05±1.10)天,后外侧组(3.30±1.35)天,两者有统计学差异。术后一月时髋臼杯外展角和股骨柄假体颈干角无统计学差异。术后1个月、6月及5年,两组HHS与髋关节疼痛VAS评分差异均无统计学意义。DAA组有1例术中损伤旋股外侧动脉升支,1例大转子骨折,1例表浅伤口感染。后外侧组发生1例髋关节后脱位。两组末次随访时均无假体松动。结论 采用微创DAA与传统后外侧入路全髋关节置换术治疗股骨头坏死Ficat Ⅲ或者Ⅳ期均可以获得较好疗效,但在学习曲线阶段,针对复杂病例微创DAA较传统的后外侧入路其优势可能并不明显。