关键词： 脑梗死   骨髓间充质干细胞   脑神经源性神经营养因子  

摘要： 脑梗死为临床常见疾病,是由于神经细胞的缺血耐受性和再生能力差,其致残率和死亡率高,多年来其临床治疗方法法无根本性的进展,给家庭和社会造成了沉重的负担。干细胞治疗近年来发展迅速,已涉及多种不同领域,为多种难治性疾病,如帕金森、阿尔兹海默症、糖尿病等带来了新的希望。近年来随着干细胞研究和组织工程的发展,特别是成体干细胞具有自我复制和多向分化潜能的发现,同时其具有取材方便和符合伦理学等特点,使其成为进展最迅速的一个领域。许多动物实验表明应用干细胞移植治疗脑梗死能够促进神经细胞再生和修复,明显改善实验动物的预后,已经开始进行的少量临床试验也证实了其可行性和安全性。然而,随着越来越多的研究证实移植的干细胞到达损伤脑组织的数量很少,存活的时间较短而且长期存活的比例极低,也没有充分的证据表明干细胞转化为自体神经细胞及建立神经突触联系。实验研究发现在应用干细胞治疗心肌、肝及肾脏疾病时,单纯移植干细组植干细基同样有较样的治疗效果,并且避免了细胞移植造成的一些并发症,从而提出了旁分泌假说。本研究第一部分,通过分离、培养和鉴定犬骨髓来源成体干细胞,建立稳定的犬骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)系,并鉴定它们的干细胞特性。通过缺氧预处理BMSCs与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)共培养,增强其增殖、迁移及神经分化能力。本研究第二部分,通过慢病毒转染BMSCs,使其过表达目的基因,并研究其在超顺磁氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)标记后细胞功能及级神经分化能力。在研究的第三部分,通过血栓弹力图及体外磁共振检测不同比例血液成分构成血栓,明确不同血栓成分其血栓强度与磁共振信号变化对应关系。在研究的第四部分,通过改良犬自体血栓构建犬脑梗列模型,并由颈内动脉途径注射基因修饰干细胞并对其进行影像学评估,研究基因修饰后BMSCs对脑梗死的修复作用并探讨其可能的作用机制。本研究为BMSCs在神经修复领域积累了实验研究资料,揭示了其对脑梗死治疗的可能性。―、缺氧预处理联合粒细胞集落刺激因子对犬骨髓间充质干细胞的作用研究1分离、培养和鉴定犬骨髓间充质干细胞穿刺抽取犬肱骨上段骨髓液,采用密度梯度离心法分离犬骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过贴壁法纯化培养至P2,流式细胞分析BMSCs不表达CD34,CD45,表达CD44,CD90等间充质干细胞表面抗原。BMSCs具有多向分化潜能,经一定诱导,可在体外向中胚层细胞系,如成骨、成脂胞分化。BMSCs在体外易于扩展培养且可在不同代次冷冻保存,在液氮中冷冻12个月后复苏,对干细胞增殖能力基本无影响,可继续培养或用于进一步研究。2缺氧预处理BMSCs与粒细胞集落测激因子共培养细胞功能与神经分化能力检测取P3 BMSCs于低氧培养箱,以1%氧浓度作为缺氧处理氧浓度,以6h、12h及24h作为缺氧处理时间,通过CCK-8检测缺氧处理后细胞增殖能力,Transwell试验检测缺氧处理后细胞迁移能力,结果表明缺氧预处理12h组干细胞增殖、迁移能力高于其他组别(P<0.05)。其后以12h作为缺氧预处理时间,以常氧组作为对照组,对BMSCs进行体外神经定向诱导分化,结果表明缺氧组神经分化率高于常氧组(68.5%±5.3%v.s.54.3%±7.4%,P<0.05),real-time PCR 检测相关神经 marker MAP-2、NF-L 明显高于常氧组,细胞迁移能力HH相关细胞因子CXCR-4表达量亦明显高于常氧组(P<0.05)。粒细胞集落刺激因子可进一步促进缺氧预处理后BMSCs的增殖迁移能力。二、基因修饰、SPIO标记犬骨髓间充质干细胞后的神经分化能力检测1 慢病毒转染BMSCs构建稳定高表达目的基因细胞系采用逐孔稀释法复核病毒滴度,以不同稀释倍数稀释病毒液并转染P3BMSCs,转染后通过Guava Express analysis软件分析绿色荧光表达量,并通过cell counting kit-8(CCK-8)检测细胞活力,以明确慢病毒对犬BSMCs的亲嗜性,并确定最佳复感染指数(multiplicity of infection,MOI值),本研究明确了MOI=10时,BMSCs具有佳绿色荧光蛋白表达率及细胞活力值。通过real-time PCR检测目的基因BDNF(brain-derived neurotrophic factor)表达含量明显增高。慢病毒对BMSCs具有较优秀的亲嗜性,可构建稳定的高表达BDNF细胞系。2 BDNF-BMSCs体外SPIO标记及神经诱导分化分别以不同浓度SPIO体外标记犬BMSCs,通过结合标记效率指标普鲁士蓝染色及台盼蓝检测细胞毒性,明确SPIO浓度于20μg/mL时,BMSCs具有良好

关键词： 乳腺癌   解聚素-金属蛋白酶17   骨髓间充质干细胞   RNA干扰  

摘要： 目的利用裸鼠乳腺癌荷瘤模型,探讨慢病毒介导转染ADAM17-sh RNA的骨髓间充质干细胞裸鼠荷瘤体内的抑瘤效果及其作用机制。方法采用贴壁筛选法分离、培养、扩增3w龄雄性SD大鼠的BMSCs,传至第3代可获得高纯度、增殖能力强、数量足的BMSCs。设计和合成针对ADAM17基因的特异性ADAM17-sh RNA载体,采用慢病毒介导将ADAM17-sh RNA转染第3代培养的BMSCs。利用激光共聚焦显微镜观察慢病毒介导ADAM17-sh RNA在BMSCs中的转染率。裸鼠皮下接种MCF-7细胞,0.2 ml/只(5×107/ml)种植在裸鼠右侧鼷部皮下,构建裸鼠乳腺癌动物模型。实验随机分为:对照组(空白PBS)、小剂量BMSCs组(1×106/ml BMSCs)、大剂量BMSCs组(5×106/ml BMSCs)、小剂量转染组(1×106/ml转染ADAM17-sh RNA的BMSCs)和大剂量转染组(5×106/ml转染ADAM17-sh RNA的BMSCs),通过尾静脉注射ADAM17-sh RNA转染的BMSCs(0.1ml/次),每3d重复给药一次,共5次。观察各组荷瘤裸鼠的一般情况及肿瘤生长状况,实验结束时计算肿瘤体积和抑瘤率,HE染色法观察各组瘤体的形态结构,免疫组化法检测各组瘤体ADAM17、EGFR和Ki-67的表达。结果1倒置相差显微镜下观察分离、培养、扩增的第3代BMSCs,细胞形态较一致,以梭形、长角形居多,呈漩祸状集落分布,杂质细胞少,可获取高纯度,增殖能力强、数量足的BMSCs。2激光共聚焦显微镜观察可见慢病毒介导ADAM17-sh RNA可成功转入BMSCs,转染率高达85%以上。3裸小鼠在MCF-7细胞皮下种植第14d左右,肿瘤隆起于皮肤表面,呈分叶结节状,说明裸鼠乳腺癌荷瘤模型构建成功。4转染ADAM17-sh RNA的BMSCs行靶向治疗后,大体观察可见大剂量转染组和小剂量转染组裸鼠精神佳,一般状况良好;大剂量BMSCs组裸鼠精神一般,进食有所减少,未出现消瘦;而对照组和小剂量BMSCs组裸鼠精神差,一般状况差、消瘦严重,并出现恶病质。治疗16d后,裸鼠皮肤肿瘤表面少数出现坏死、破溃,呈多个结节状,触之较硬。大体观察大剂量转染组、小剂量转染组、大剂量BMSCs组的瘤体明显小于对照组,而小剂量BMSCs组与对照组瘤体基本无差别。5通过测量裸鼠瘤体的体积大小变化情况,随着饲养时间的延长,大剂量转染组、小剂量转染组和大剂量BMSCs组裸鼠瘤体增长缓慢,抑瘤效果显著,而对照组和小剂量BMSCs组裸鼠瘤体增长相对较快;实验结束时(第30d),比较各组裸鼠瘤体体积大小,大剂量转染组,小剂量转染组和大剂量BMSCs组相较于对照组裸鼠瘤体体积变小,差异有统计学意义(P<0.05),而对照组和小剂量BMSCs组之间裸鼠瘤体体积变化不大,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,大剂量转染组、小剂量转染组、大剂量BMSCs组、小剂量BMSCs组的抑瘤率分别为66.33%、52.13%、37.4%、2.31%。6 HE染色镜下可见,各组瘤体组织呈典型的人乳腺浸润性导管癌特征,癌细胞呈典型的腺体样排列,浸润间质,形成大量典型的乳腺癌癌巢,大剂量转染组可见瘤体组织大片坏死区域,坏死区域细胞崩解,细胞结构消失。7免疫组织化学染色结果得出,5组瘤体ADAM17、EGFR、Ki-67蛋白相比较差异均有统计学意义(F=93.970,P=0.000;F=84.684,P=0.000;F=58.024,P=0.000),相较于对照组,大剂量转染组、小剂量转染组和大剂量BMSCs组ADAM17、EGFR、Ki-67蛋白表达均降低(P均<0.05),其中均以大剂量转染组和小剂量转染组三者蛋白表达降低程度最显著;对照组和小剂量BMSCs组之间ADAM17、EGFR、Ki-67蛋白表达均无显著变化(P=0.323>0.05;P=0.240>0.05;P=0.484>0.05)。结论慢病毒介导ADAM17-sh RNA转染BMSCs具有抑制裸鼠乳腺癌ADAM17、EGFR和Ki-67的表达,发挥裸鼠体内乳腺癌抑瘤效果。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脑出血   移植   疗效  

摘要： 目的观察自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑出血的近期疗效并探讨其在脑出血神经损伤修复中的作用机制。方法本课题研究共分为二部分:第一部分以2012年01月至2015年11月期间在聊城市人民医院(脑科医院)神经外科治疗的脑出血患者35例作为治疗组。根据患者出血量多少和具体病情,分别开颅血肿清除术或行钻孔引流术,并血肿腔留置引流管一根。术后通过引流管向血肿腔边缘注入3.5m L的自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)悬液。另外选择同期在院治疗的脑出血患者(未行干细胞移植术)40例作为对照组。采用NIHSS评分(神经功能评价)和Barthel评分(日常生活能力评价)对两组患者在移植前及移植后6、12个月时进行评定。同期行头部核磁、生化全项、血常规及肿瘤标记物等检查,以此来监测BMSCs移植的临床有效性和可行性。第二部分:本实验通过胶原酶诱导法制造大鼠脑出血模型,并通过立体定位仪向脑出血大鼠纹状体内注入干细胞悬液。进行骨髓间充质干细胞移植组和模型组两者之间比较,观察术后神经功能评分及两组血肿周围TrkA和P75NTR蛋白的表达。通过此探讨骨髓间充质干细胞移植是否可改变血肿周围的TrkA和P75NTR蛋白表达,而对细胞凋亡起到抑制的效果。结果1.术前治疗组和对照组患者的NIHSS评分和Barthel评分基本相近。移植6个月后与对照组相比,治疗组患者的NIHSS评分显着降低(P<0.01),而Barthel的评分显着增高(P<0.01)。干细胞治疗术后6、12个月与移植前相比,治疗组患者NIHSS的评分有显着降低(P<0.01),而Barthel评分有显着增高(P<0.01)。术后并发症:治疗组中有2例患者在BMSCs移植后出现发热反应,及时给予物理降温及药物治疗后症状缓解,余患者未出现其它不良反应及并发症。对治疗组术6、12个月观察,只有1例肺癌病人的肿瘤标记物CA-153有所升高。其余患者血常规、生化全项和头部核磁等检查均未发现不正常。2.通过胶原酶制造脑出血模型后,wistar大鼠出现相应的神经系统功能障碍。症状1天内达到高峰,持续约5天,7天后神经功能逐渐恢复。第7天及第14天时与模型组相比,BMSCs组大鼠的mNSS评分有显着降低(P<0.05)。而第14天时与模型组相比,BMSCs组大鼠血肿周围的P75NTR表达显着降低(P<0.05);TrkA表达显着升高(P<0.05)。结论:1.自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑出血患者的治疗是安全的、可行的,且其近期疗效明显。***通过立体定位注射脑出血模型大鼠内,能够存活并恢复神经功能。***移植能使脑出血模型大鼠其血肿周围P75NTR的表达减少,TrkA的表达增加,从而拮抗血肿周围细胞的凋亡,并且通过此途径来促进神经功能恢复。

关键词： 再生障碍性贫血   阵发性睡眠性血红蛋白尿综合征   治疗   骨髓间充质干细胞  

摘要： 再生障碍性贫血-阵发性睡眠性血红蛋白尿综合征（AA-PNH综合征）是一种多能造血干细胞疾病,既有一系或多系血细胞减少,又有溶血表现,病情较为凶险。目前,骨髓间充质干细胞（BMSCs）已广泛用于血液病的治疗,对于耐药且近期无法行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）的难治性患者是有效的治疗手段之一。

关键词： 骨髓间充质干细胞   干细胞移植   胰腺疾病  

摘要： 胰腺疾病的发病率逐年增加,目前针对胰腺疾病治疗以控制临床症状为主,但胰腺细胞损伤修复及功能恢复研究进展缓慢.目前干细胞因其多向分化增殖和对损伤与疾病导致的细胞损伤有修复功能,近年在疾病治疗方面应用广泛.已有大量实验证实,胰腺干细胞在移植后能分化胰腺功能细胞,在胰腺内外分泌功能恢复及胰腺细胞损伤修复中扮演重要作用.尤其是骨髓间充质干细胞,在治疗胰腺疾病方面的体内外研究成果显著,为干细胞治疗应用于胰腺疾病的临床治疗奠定了理论和实践基础.本文概述该细胞在急慢性胰腺炎及胰腺癌的研究进展及不足,证实了干细胞有望成为治疗胰腺疾病新方法之一.

关键词： 充血性心力衰竭   骨髓间充质干细胞   心肌再生   细胞移植  

摘要： 充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)是心肌梗死的并发症,严重影响人类的健康,尽管目前药物治疗CHF的效果已经有很大提高,但如何彻底使由心肌梗死所导致的损伤心肌复原仍然是个世界性问题。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植已被证实能够修复梗死的心肌,大量证据表明MSCs可以在人和动物体内产生新的心肌细胞。本篇综述将探讨MSCs移植治疗CHF这一问题。

关键词： 慢性移植物肾病   自身骨髓间充质干细胞   安全性   可行性  

摘要： 目的分析自身骨髓间充质干细胞治疗慢性移植物肾病的安全性与可行性。方法选取26例慢性移植物肾病患者,患者均自愿接受自身骨髓间充质干细胞治疗。观察治疗后不良反应,对比治疗前、治疗后1周、4周、8周、12周时血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、内生肌酐清除率(Ccr)、24 h尿蛋白等指标的变化。结果治疗后患者不良反应发生率为30.77%。治疗后1、4、8周时患者Scr、BUN、24 h尿蛋白明显下降,Ccr明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后12周时Scr、BUN、Ccr、24 h尿蛋白与治疗前比较差异无统计学意义,其中,治疗前Scr、BUN、Ccr、24 h尿蛋白分别为(211.37±48.22)μmol/L、(14.48±4.12)mmol/L、(38.65±9.26)m L/min、(885.69±212.34)mg,治疗后12周分别为(215.45±51.62)μmol/L、(14.52±4.20)mmol/L、(38.34±8.93)m L/min、(891.24±205.58)mg。结论采用自身骨髓间充质干细胞治疗慢性移植物肾病可获得肾功能的改善,不良反应以发热、瘙痒为主,未见出血、动脉栓塞、假性动脉瘤等严重并发症。

关键词： 肝硬化   间质干细胞移植   小鼠,近交BALB   C  

摘要： 目的评价经不同途径移植骨髓间充质干细胞(BMSC)治疗小鼠肝硬化的效果差异。方法 46只BALB/c小鼠随机分为正常对照组5只和肝硬化模型组41只。用CCl4橄榄油皮下注射构建小鼠肝硬化模型,选取肝硬化小鼠36只,随机分为对照组、尾静脉移植组、脾内移植组,每组各12只。以全骨髓贴壁法获得第3代BMSC,通过流式细胞分析术行细胞表面鉴定,选取尾静脉及脾脏注射至肝硬化小鼠体内。移植后4周分别取血检测肝功能,取肝组织切片进行HE、Masson染色及α平滑肌肌动蛋白(αSMA)免疫组化检查,检测小鼠肝细胞组织损伤和纤维化情况。组间比较采用单因素方差分析。结果造模8周后,模型组小鼠毛发变稀,色泽暗黄,摄食减少,活动减少,体质量下降。细胞移植后,脾内移植和尾静脉移植组小鼠Alb较对照组明显升高[(29.05±3.41)g/L vs(21.03±2.18)g/L,(29.46±3.25)g/L vs(21.03±2.18)g/L],ALT、AST明显降低[(170.67±32.72)U/L vs(254.58±47.93)U/L,(166.58±28.24)U/L vs(254.58±41.93)U/L;(202.17±31.58)U/L vs(293.08±35.23)U/L,(186.50±33.13)U/L vs(293.08±35.23)U/L],差异均有统计学意义(P值均<0.01);两移植途径间比较差异均无统计学意义(P值均>0.05);组织病理改变显著,两移植组小鼠肝硬化程度减轻,胶原纤维及坏死面积减少,组织结构好,与对照组比较,肝脏胶原面积比值显著降低[(14.36±2.21)%vs(26.38±0.82)%,(10.88±1.27)%vs(26.38±0.82)%](P值均<0.01)。免疫组化染色提示两移植组的αSMA阳性表达细胞数较对照组均明显下降(14.40±1.69)%vs(25.6±0.73)%,(9.97±1.46)%vs(25.60±0.73)%](P值均<0.01)。结论经两种途径移植BMSC对肝硬化小鼠肝功能、病理组织学等方面均有改善,二者效果相似。

关键词： 高血压,肺性   间质干细胞   野百合碱  

摘要： 目的:探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植治疗野百合碱(MCT)诱导的肺动脉高压(PAH)大鼠肥大细胞的效果。方法:雄性SD大鼠24只,随机均分为空白对照组、PAH组和BM-MSCs移植组。PAH组和BMMSCs移植组大鼠一次性腹腔注射MCT(60mg/kg)诱导PAH。采用SD大鼠的骨髓,经贴壁筛选法体外培养并纯化BM-MSCs。3周后,BM-MSCs移植组大鼠经右侧颈外静脉注射5×10~6个MSCs细胞悬液1ml,PAH组和空白对照组大鼠予等量L-DMEM液。移植后14d,观察比较三组大鼠的肺动脉收缩压(PASP)、右室肥厚指数(RVHI)、肺动脉的结构及肥大细胞数量的改变。结果:与空白对照组比较,PAH组和BM-MSCs组PASP[(23.75±0.83)mmHg比(46.73±1.28)mmHg比(35.54±1.20)mmHg]、RVHI[(0.2387±0.0048)比(0.4764±0.0155)比(0.3729±0.0087)]显著升高,肥大细胞计数[(0.63±0.26)个/10mm^2比(12.50±1.41)个/10mm^2比(7.13±0.64)个/10mm^2]显著增多,P均<0.01;但与PAH组比较,BM-MSCs组上述三项指标有显著降低,P均<0.01。肺组织病理切片显示PAH组肺血管重构明显,而BM-MSCs移植组肺血管重构明显减轻。结论:肥大细胞参与了肺动脉高压的形成,揭示了肺动脉高压发生的相关机制。

关键词： 多发性硬化   间充质干细胞   CD8^+CD28^-调节性T细胞  

摘要： 目的探讨CD8^＋CD28^-T淋巴细胞在骨髓间充质干细胞（MSCs）治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中的免疫调节作用。 方法采用6~8周、体重16~20g的C57 BL/6雌性小鼠28只，MOG35-55作为免疫诱导剂，构建实验性自身免疫性小鼠模型（EAE）。将28只EAE小鼠随机分成4组：PBS治疗组、MSC低剂量治疗组（2×105个/只）、MSC中剂量治疗组（1×106个/只）、MSC高剂量治疗组（5×106个/只），每组7只。各治疗组均于建模后第15天经尾静脉注射健康人来源的MSCs，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。 随后每日进行神经功能评分及测量体重，于治疗30d后处理动物，取材进行相关神经病理学及细胞免疫学分析。 结果不同剂量的MSCs均较PBS能有效地促进EAE小鼠神经功能的恢复（P〈0.05），且MSCs中剂量治疗更能显著促进EAE小鼠神经功能的恢复。各MSCs治疗组小鼠脾脏细胞中CD8^＋CD28^-调节性T细胞的数量均较PBS治疗组的表达有所增加，但其分泌的IL-10水平较PBS治疗组差异无统计学意义（P〉0.05）。 结论CD8^＋CD28^-调节性T细胞可能不是MSCs促进EAE小鼠神经功能恢复的主要效应细胞，可能只是起到协同治疗作用。