关键词： 解聚素-金属蛋白酶17   乳腺癌   移植瘤   RNA干扰   骨髓间充质干细胞  

摘要： 目的利用人MCF-7乳腺癌裸小鼠模型,探讨转染ADAM17-sh RNA的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)对乳腺癌移植瘤的抑制效果。方法常规培养人乳腺癌细胞MCF-7。全骨髓贴壁法分离3w雄性SD大鼠的BMSCs,通过传代纯化BMSCs,慢病毒(表达红色荧光蛋白)介导的ADAM17-sh RNA转染BMSCs,利用激光共聚焦显微镜观察红色荧光在BMSCs中的表达情况。40只3w雌性裸小鼠右侧鼷部皮下注射0.2 ml(5×107/ml)MCF-7细胞悬液/只。细胞种植14d后,40只裸小鼠随机分成对照组(等量PBS)、小剂量BMSCs组(1×106/ml BMSCs)、大剂量BMSCs组(5×106/ml BMSCs)、小剂量转染组(1×106/ml转染ADAM17-sh RNA的BMSCs)和大剂量转染组(5×106/ml转染ADAM17-sh RNA的BMSCs)。转染48h后,消化提取BMSCs,按动物分组制成相应浓度的细胞悬液,通过裸小鼠尾静脉注射0.1 m L/只,每3d重复给药一次,共计5次。自种植第10d起测量肿瘤体积大小,每4d测量一次,并观察裸小鼠的一般情况,细胞种植30d(治疗16d)后处死所有动物,留取肿瘤组织。利用realtime PCR检测ADAM17m RNA表达;Western blot检测ADAM17蛋白表达。结果1成功从SD大鼠提取BMSCs,经过传代纯化BMSCs。2激光共聚焦显微镜观察红色荧光蛋白在大部BMSCs细胞内表达,其转染率高达80%,可用于后续实验。3裸小鼠造模成功,所有裸小鼠种植MCF-7细胞14d后在接种部位均出现结节,成瘤率达到100%(40/40)。4实验结束时,对照组、小剂量BMSCs组、大剂量BMSCs组、小剂量转染组、大剂量转染组的移植瘤体积分别为786.75±26.20mm3、766.63±29.51mm3、485.06±20.65mm3、362.12±19.70mm3和251.56±21.77mm3,五组之间差异有统计学意义(F=806.70、P=0.00)。与对照组比较,大剂量BMSCs组、小剂量转染组、大剂量转染组的最大抑瘤率分别为38.35%、53.97%和68.02%,小剂量BMSCs组基本无抑制。5 Real-time PCR检测结果显示,ADAM17m RNA在对照组、小剂量BMSCs组、大剂量BMSCs组、小剂量转染组、大剂量转染组的表达量分别为1.00±0.00、0.98±0.02、0.81±0.05、0.31±0.04、0.22±0.03。与对照组相比,大剂量BMSCs组、小剂量转染组、大剂量转染组可见显著下调(P<0.01),但小剂量BMSCs组没有显著改变(P>0.05)。6Western blot检测结果显示,对照组、小剂量BMSCs组、大剂量BMSCs组、小剂量转染组、大剂量转染组的ADAM17蛋白表达量分别为0.71±0.05、0.67±0.02、0.59±0.04、0.45±0.05、0.28±0.06。大剂量BMSCs组、小剂量转染组、大剂量转染组ADAM17的蛋白表达量均明显低于对照组(P<0.01),但与对照组相比,小剂量BMSCs组没有显著改变(P>0.05)。结论转染ADAM17-sh RNA的BMSCs及大剂量BMSCs能抑制乳腺癌在裸小鼠体内的生长。

关键词： 载脂蛋白J(ApoJ)   脑出血   治疗   转染率   改良神经功能评分   脑含水量  

摘要： 目的:探讨携带ApoJ基因的骨髓间充质干细胞对大鼠实验性脑出血的治疗作用。方法:采取脂质体介导用重组质粒pEGFP-N1-apoJ转染体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs),分别于转染后24,48,72,96h在荧光显微镜下观察相同体积脂质体介导不同重组质粒量的转染效果,筛选出转染率最高的转染组。将102只雄性SD大鼠随机分为转染组、BMSCs组和NaCl组。每组再分为24h,48h,72h,96h四个亚组。利用脑立体定位仪建立大鼠脑出血模型,三组分别于造模24h后颅内注射等体积的转染细胞悬液、BMSCs悬液和生理盐水,分别于处理后24h,48h,72h,96h处死各对应亚组大鼠。进行各时间点改良神经功能评分(mNSS);用干湿质量法测量脑组织含水量;用蛋白免疫印迹法检测载脂蛋白-J在各时间点的表达。结果:1.等体积脂质体条件下,四个细胞转染组(重组质粒量分别为0.8、1.2、1.6、2.0)在72h时转染率高于同组在24h,48h,96h的转染率(P均<0.05);且与另外三个细胞转染组(重组质粒量分别为0.8、1.2、2.0)比较,重组质粒量为1.6的细胞转染组在72h时荧光表达最强,转染效率高于同时间点的其他三组(P均<0.05);***结果显示,转染组在实验干预后1,3,5,7d得分显著低于同时间点的BMSCs组与NaCl组(P均<0.05);3.脑组织含水量测定结果显示,转染组在1,3,5,7d脑组织含水量低于同时间点的BMSCs组与NaCl组(P均<0.05);*** blot结果显示,与BMSCs组与NaCl组比较,转染组脑组织内ApoJ表达水平均高于同时间点的两组(P均<0.05)。结论:携带ApoJ基因的骨髓间充质干细胞能够在ICH大鼠脑组织内表达载脂蛋白J,外源性ApoJ对脑出血具有治疗作用,可以促进脑出血大鼠的神经功能的恢复,减轻脑水肿,改善脑出血大鼠预后。

关键词： CXC趋化因子受体4   间充质干细胞   细胞培养   糖尿病视网膜病变   动物实验  

摘要： 目的:应用经慢病毒转染后过表达CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）通过玻璃体腔注射移植到糖尿病大鼠体内后,观察过表达CXCR4的BMSCs是否具有更好的治疗作用,并探讨其治疗糖尿病大鼠视网膜病变可能的机制。方法:1.原代分离、培养BMSCs,并对其细胞免疫表型进行鉴定。2.利用基因重组方法构建慢病毒载体,将CXCR4目的基因转染至第3代BMSCs,并进行免疫荧光、Western-Blot、q-PCR检测目的基因转染后CXCR4基因在BMSCs中表达的情况;通过MTS细胞增殖实验检测BMSCs的增殖能力,观察转染CXCR4基因后BMSCs增殖能力是否有变化。通过transwell小室进行BMSCs的趋化实验检测,观察在SDF-1的诱导下转染CXCR4基因后BMSCs迁移能力是否增强。通过流式细胞仪对BMSCs凋亡程度检查,观察转染CXCR4基因后BMSCs凋亡程度是否有变化。3.将过表达CXCR4的第3代BMSCs移植到STZ诱导4w的糖尿病大鼠玻璃体腔体内,检测各组移植前及移植后1w、2w、3w大鼠血糖、体重等大体情况。实验动物分组:正常对照组（正常组）、糖尿病大鼠对照组（Blank组）、磷酸盐缓冲液治疗组（PBS组）、注射未经处理BMSCs治疗组（native组）、注射GFP病毒感染BMSCs治疗组（GFP组）、注射CXCR4-GFP病毒感染BMSCs治疗组（CXCR4组）。造模成功后进行干预治疗,其中PBS组、native组、GFP组、CXCR4组分别给予PBS、BMSCs、GFP-BMSCs、CXCR4-GFP-BMSCs玻璃体腔注射治疗,正常对照组和Blank组不予特殊治疗。注射后1w、2w、3w观察各组视网膜石蜡切片HE染色病理组织学变化,western-blotting和免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜组织中Rhodopsin、NSE及炎症因子IL-6、TNF-α蛋白表达变化,统计对比后得出结论。结果:1.从大鼠骨髓中易分离培养出BMSCs,细胞纯度高、形态均一且具有典型MSC形态特征,表达MSC特异抗原标志,体外扩增能力强且能保持其低分化状态和多向分化潜能;2.通过慢病毒转染后,可过表达CXCR4基因。同时在MTS增殖能力检测试验中发现,过表达CXCR4的BMSCs较正常的BMSCs和未转染目的基因的GFP-BMSCs细胞增殖能力没有明显差异（p>0.05）。在transwell趋化实验中,在SDF-1诱导下过表达CXCR4的BMSCs较正常的BMSCs和未转染目的基因的GFP-BMSCs细胞迁移能力有明显提高（p<0.05）。通过流式细胞仪对细胞凋亡程度的检查,发现过表达CXCR4的BMSCs较正常的BMSCs和未转染目的基因的GFP-BMSCs细胞凋亡程度没有明显差异（p>0.05）。3.和对照组相比,玻璃体腔移植CXCR4-BMSCs后视网膜炎症程度明显减轻;并且视网膜组织中Rhodopsin、NSE蛋白表达明显升高,炎症因子IL-6、TNF-α蛋白表达明显降低（P<0.05）。结论:1、本研究在国内外首次采用过表达CXCR4基因的BMSCs治疗糖尿病大鼠模型,发现通过慢病毒转染过表达CXCR4的BMSCs其趋化、归巢能力明显增强,从而达到最大化的发挥外源性MSCs的治疗作用。2、过表达CXCR4的BMSCs较普通BMSCs能更好的减轻糖尿病大鼠视网膜病变炎症反应,而且推断其可以诱导视网膜出现相关蛋白的表达,从而更好的发挥对视网膜损伤的修复作用。

关键词： 肝硬化   骨髓间充质干细胞   碱性成纤维细胞生长因子  

摘要： 背景:干细胞移植治疗肝硬化在动物实验、临床研究已被广泛研究,碱性成纤维细胞生长因子体外条件下可以促进干细胞增殖,利用bFGF培养后的干细胞治疗肝硬化的体内疗效目前尚不确定。目的:探索bFGF对BMSC生长和增殖的影响。加入0.1%bFGF培养后的骨髓间充质干细胞通过小鼠尾静脉注射后肝功能ALT、AST、ALB水平、组织病理学改变及胶原沉积变化情况。方法:全骨髓贴壁法提取雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞检测BMSC。雌性昆明小鼠46只随机分为分为5组:A组(CCl4+PBS)、B组(CCl4+bFGF)、C组(CCl4+bFGF-BMSC)、D组(CCl4+bFGF+BMSC)、E组(CCl4+bFGF+BMSC3次移植)。小鼠CCl4造模10周后分别尾静脉注射bFGF+或bFGF-培养的BMSC,酶联免疫法检测肝功能,HE染色检测组织病理学改变情况;Masson三色染色法检测肝组织胶原沉积情况。结果:(1)BMSC生长情况:观察各组传代细胞的生长情况,bFGF-、bFGF+组细胞24h完全贴壁,贴壁细胞初期呈梭形或不规则形,细胞形态无明显异常,主要以梭形为主,bFGF+组细胞增殖较快,于第4天铺满瓶底。bFGF-组较bFGF+细胞生长相对缓慢,第6-7天时基本完全铺满细胞培养瓶。(2)细胞生长:10ng/ml bFGF体外培养条件下,BMSC生长速率显著高于无bFGF培养。(3)流式检测:CD29、CD44阳性表达,CD45呈阴性表达。(4)化学法检测肝脏功能:ALT水平在模型对照组(A组)与B组比较无显著性差异(P>0.05),C组、D组、E组ALT水平与A组、B组比较均有下降(两两比较具有显著性差异,P<0.05);ALT水平在D组、E组均较C组下降(P<0.05);E组较D组下降(P<0.05)。AST水平在A组与B组间无显著性差异(P>0.05);C组、D组、E组两两之间无显著性差异(P>0.05);而C组、D组、E组较A组或B组具有明显下降(P<0.05)。(5)HE染色结果:A组、B组HE染色见肝细胞明显水肿、脂肪变性、桥接坏死,肝索排列紊乱,假小叶广泛形成。C组肝细胞水肿、脂肪变性,炎性细胞浸润,但程度较模型组有所减轻,汇管区纤维沉积,可见假小叶结构;D组、E组肝细胞水肿情况、炎性细胞浸润程度较BMSC组明显改善,假小叶结构可见,汇管区可见纤维沉积。(6)Masson结果显示,A组、B组肝门脉区大量绿染纤维沉积,肝实质内绿色纤维浸润,纤细的纤维间隔从汇管区延伸至肝实质,分隔肝小叶形成假小叶。A组纤维面积较B组无显著性差异(P>0.05);与A组、B组相比,C组、D组、E组纤维量减少,较A组、B组明显改善,差异有统计学意义(p值均<0.05);C组、D组汇管区、肝实质有可见纤维沉积,但两组纤维面积无显著性差异(P>0.05);E组较C组、D组面积均有显著降低(P>0.05)。结论:体外培养加入bFGF后BMSC生长速度较无bFGF时显著提高,细胞形态大致相同,流式检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD45表达与无bFGF时相同。BMSC移植能够改善肝硬化小鼠肝功能、肝硬化程度、胶原纤维沉积,培养中加入bFGF的BMSC更为显著地改善肝损伤程度和纤维化程度,重复细胞移植后肝纤维化程度改善更为显著。

关键词： 脓毒症   凝血紊乱   巨噬细胞   骨髓移植  

摘要： 目的：　　⑴探究骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植后是否能够改善脓毒症小鼠生存情况。⑵探究BMSCs移植后是否能够改善脓毒症小鼠相关脏器的损伤，同时检测相关炎症及凝血指标，观察BMSCs能否缓解脓毒症小鼠炎症反应及凝血紊乱情况。⑶通过体外细胞实验，构建人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与BMSCs、小鼠巨噬细胞与BMSCs共培养模型，研究BMSCs能否缓解脂多糖（LPS）造成的内皮细胞及巨噬细胞损伤，并探究BMSCs可能参与到的调节通路和机制。　　方法：　　①将8-12周雄性C57BL/6小鼠随机分为三组：假手术组（Sham组）、脓毒症模型组（CLP组）、BMSCs治疗组（CLP+BMSCs组）。应用盲肠结扎穿孔术（CLP）制造脓毒症模型，造模6小时后，经尾静脉注射给予CLP+BMSCs组小鼠含1*106/0.3ml的BMSCs悬液，CLP组小鼠经尾静脉给予0.3ml生理盐水，每12小时观察一次各组小鼠的生存情况，截止至96小时并作生存曲线。②造模24小时后，测定各组断尾出血时间;小鼠经麻醉眼球取血并留取所需脏器样品。所取血液样品通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测相关指标的变化，同时做蛋白芯片检测血管生成相关指标变化情况;留取的肺脏、肝脏做组织切片;应用免疫印迹技术和实时荧光定量PCR技术检测肝、肺组织相关炎症及凝血指标的蛋白和基因表达情况。③将HUVEC分为四组：空白组（HUVEC+PBS组）、LPS刺激组（HUVEC+LPS组）、BMSCs对照组(HUVEC+PBS+BMSCs)、BMSCs治疗组（HUVEC+LPS+BMSCs组）。LPS模型组给予1μg/ml的LPS，BMSCs治疗组在给予1μg/ml的LPS的基础上在Transwell中放入等数的BMSCs，空白组仅给予等量的PBS。6小时后，观察HUVEC迁移和通透性情况;提取共培养细胞培养上清、HUVEC蛋白质分别应用酶联免疫吸附试验、蛋白免疫印迹技术观察其相关炎症及凝血指标的变化。④将巨噬细胞分为三组：空白组（巨噬细胞+PBS组）、LPS刺激组（巨噬细胞+LPS组）、BMSCs治疗组（巨噬细胞+LPS+BMSCs组）。LPS模型组给予1μg/ml的LPS，BMSCs治疗组在给予1μg/ml的LPS的基础上在Transwell中放入等数的BMSCs，空白组仅给予等量的PBS。6小时后，通过免疫细胞荧光对巨噬细胞相关指标进行检测;提取巨噬细胞蛋白质及mRNA分别应用蛋白免疫印迹技术和实时荧光定量PCR技术观察其相关指标的变化情况。　　结果：　　⑴对比于Sham组小鼠96小时生存率100％，CLP组仅为15%（P＜0.01），而BMSCs移植治疗后脓毒症小鼠生存率近50%，生存情况明显改善（P＜0.01）。⑵造模24小时后，CLP组较Sham组小鼠断尾出血时间明显缩短（P＜0.01），而BMSCs治疗组较CLP组出血时间有所延长（P＜0.01）。⑶与Sham组相比，CLP组小鼠肺组织严重水肿，可见大量炎性细胞、血细胞浸润，肺泡腔变窄、肺泡结构破坏模糊;而BMSCs治疗组小鼠肺损伤情况明显有所缓解，炎性细胞、血细胞浸润情况有所减轻，肺泡结构有明显改善。CLP组与Sham组相比，肺脏免疫组织化学NE染色阳性表达明显增多，经BMSCs移植后，NE阳性表达显著减少。⑷Sham组肝脏未见明显异常，CLP组小鼠肝细胞明显水肿，有肝索排列紊乱、肝窦挤压变窄等变化，而BMSCs治疗组干细胞水肿有所缓解，肝索排列紊乱及肝窦挤压变窄等情况较CLP组也有所改善;肝脏PAS糖原染色可见，相较于Sham组， CLP组肝脏几乎无糖原染色，而BMSCs治疗后肝脏可见染色。⑸较于Sham组，CLP组小鼠血浆中TNF-α、IL-1β、NE、ALT、AST等指标明显升高（P＜0.01），而在BMSCs治疗后血浆中的上述指标均有所下降且均具有统计学意义（P＜0.01）。⑹血管生成相关蛋白芯片结果表明，较之Sham组， CLP组血浆中CXCL1/CXCL10/CXCL16/MCP-1/CCL3/IL-10等多种细胞因子表达量明显升高，表皮生长因子（EGF）、组织因子（TF）、MMP-3/MMP-8/MMP-9等基质金属蛋白酶表达也有所升高;BMSCs治疗组上诉指标均有所下降。⑺对比Sham组，CLP组小鼠肺脏和肝脏蛋白免疫印迹结果可见蛋白酶活化受体1（PAR1）、TF、NE表达均明显增加，而BMSCs移植后PAR1、TF、NE水平有所下降;CLP组肺脏Cleaved caspase-3、LCⅢB蛋白表达较Sham组也明显增多，经BMSCs治疗后有所改善。⑻各组小鼠肺组织中CXCL1、CXCL10、MCP-1、IL-6、IL-10、细胞间粘附分子-1(ICAM1)、TF、PAR1、MMP-1、Toll样受体4

关键词： 骨髓间充质干细胞   肝硬化   肝纤维化   小鼠  

摘要： 目的肝硬化是全球范围内常见的消化系统疾病,通过选择不同路径输注小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)治疗小鼠肝硬化模型来评价疗效的差异。方法选用四氯化碳橄榄油皮下注射构建小鼠肝硬化模型,选取肝硬化小鼠36只,采用随机数字表法分为对照组、尾静脉BMSCs输注组、脾脏BMSCs输注组,共3组,每组各12只;通过全骨髓贴壁法培养并获得第3代小鼠骨髓间充质干细胞,并用流式细胞分析术进行干细胞表面鉴定;选取尾静脉及脾脏途径注射骨髓间充质干细胞至实验组小鼠体内。移植后4周分别取血检测肝功能,取肝脏组织切片进行HE、Masson染色及α-平滑肌动蛋白(α-SMA)免疫组织化学检查,检测小鼠肝细胞组织损伤和纤维化程度的改善情况。结果实验组小鼠肝功能、病理组织改变显著,与对照组比较,具有统计学学意义(P<0.05),但两输注途径间比较无显著统计学差异。结论经尾静脉及脾脏移植路径输注BMSCs对肝硬化小鼠肝功能、病理组织学等方面均有改善,效果相似。

关键词： NMO   自体骨髓间充质干细胞   护理  

摘要： 目的讨论对应用自体骨髓间充质干细胞治疗视神经脊髓炎的病人的护理。方法对我院2015年1月至2017年1月收治的12例应用自体骨髓间充质干细胞治疗视神经脊髓炎的病人的护理过程和护理经验进行总结。结果经过临床治疗与细心护理,12例患者的病情都有所好转并出院,其中有2例患者完全康复。结论视神经脊髓炎累及系统多,病情变化快,护理难度大,护理人员应全面细致观察病情,做到细心有效护理,帮助病人恢复。

关键词： 自身免疫性甲状腺炎   前体细胞   骨髓间充质干细胞治疗   细胞分化  

摘要： 目的:桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyro iditis，HT)是Th1型自身免疫性疾病，其主要的特点是甲状腺内淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润，聚集在生发中心引起甲状腺组织肿大、甲状腺细胞的进行性破坏及引起抗甲状腺球蛋白(Thymglobulin，TG)抗体和抗甲状腺过氧化物酶(Thyroid、peroxidase，TPO)抗体水平的升高，最终导致甲状腺功能减退。桥本氏甲状腺炎已经成为最常见的自身免疫疾病，于40-60岁女性群体中高发，人群总的发病率可高达5％，因其渐进性的甲状腺功能损害和与甲状腺乳头状癌的发生的密切关系、以及日益上升的发病率越来越受到人们的重视。桥本氏甲状腺炎的致病因素有很多，包括易感基因因素、环境因素和个人生理状态等;1996年我国全民食盐碘化后，桥本氏甲状腺炎的发病率逐渐增加，因而在我国碘摄入是桥本氏甲状腺炎发病的重要环境因素。而目前，对于桥本氏甲状腺炎仍然没有有效治疗的方法。间充质干细胞(Mesenchyrnal stem cell，MSC)来源于胚胎中胚层，是一种具有自我再生和多向分化潜能的细胞，在一定的环境下它可以分化成为脂肪细胞，成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、胰岛细胞、神经细胞等。据报道间充质干细胞具有显著的免疫调节和组织修复作用，MSC发挥免疫调节和抗炎作用的机制主要是MSC通过分泌调节性细胞因子和细胞间接触作用，抑制T、B细胞的增殖、提高Treg细胞的数量和功能，抑制抗原呈递细胞的成熟、活化和抗原呈递、抑制NK细胞增殖及细胞杀伤效应而实现的，其分泌的调节性细胞因子主要有:TGF-β、PGE2、IDO、IL-10等。成体干细胞(Adult stem cell，ASC)是指存在于一种少量的已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞，成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。成体干细胞几乎存在于各个组织器官。目前还国内鲜有关于甲状腺组织中的前体/成体干细胞的检测及在疾病中所发挥作用的相关报道。同时在间充质干细胞治疗时，间充质干细胞是否分化成为组织细胞发挥替代作用，目前相关的研究和报道仍较少。本研究通过应用骨髓间充质干细胞注射移植治疗碘致NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎，探讨骨髓间充质干细胞对自身免疫性甲状腺的治疗作用和相关机制。　　研究方法:本研究第一部分回顾性分析2014-2016年的甲状腺微小乳头癌469例病例，采集性别、年龄、单多发、单双侧、侵及包膜、桥本氏甲状腺炎、癌组织纤维化等临床资料，分析桥本氏甲状腺炎对甲状腺微小乳头状癌颈部淋巴结转移的关系。建立自身免疫性炎甲状腺炎的动物模型，选择6-8周龄SPF级饲养NOD.H-2h4小鼠40只，按喂养碘水的周数随机分为健康对照组（正常饮水12周），碘8周组、碘12周组、碘16周组，每组10只，建立自身免疫性甲状腺炎模型，HE染色观察每组小鼠甲状腺炎症浸润程度，ELISA检测血清TgAb水平及甲功水平，评估不同碘摄入时间对炎症程度、TgAb水平和甲功的影响。第二部分选择6-8周龄NOD.H-2h4小鼠36只，随机分为健康对照组(n=12)，PBS注射组(n=12），BMSC移植组(n=12);PBS注射组及BMSC移植组予0.05％NaI无菌水喂养12周建立自身免疫性甲状腺炎模型，健康对照组予正常饮水饲养12周;12周后，健康对照组及PBS注射组予无菌PBS原位注射在小鼠甲状腺内，BMSC移植组予同种异体骨髓间充质干细胞原位注射移植在小鼠甲状腺内，3组小鼠注射后正常饲养10天处死，留取各组NOD.H-2h4小鼠甲状腺、血清及脾脏分别进行HE染色、免疫组化、EHSA、流式细胞术、Real time-PCR等检测，对比观察BMSC移植后小鼠甲状腺炎症的缓解情况。第三部分应用免疫组化染色及免疫荧光双重染色检测甲状腺内前体或干细胞相关指标的表达情况，对比观察BMSC移植后甲状腺内前体/干细胞的变化情况，观察注射后间充质干细胞的分化情况。应用Image proplus6.0统计分析免疫组化结果;应用SPSS20.0软件进行数据处理和分析。　　结果:桥本氏甲状腺炎是甲状腺微小乳头状癌颈部淋巴结转移的危险因素之一，但不是独立危险因素，受到年龄、生长位置、纤维化等因素影响。随着碘水喂养时间的延长，小鼠模型的炎性细胞浸润程度增强，血清TgAb抗体水平升高(P＜0.05)，小鼠的甲状腺炎炎症程度和碘摄入持续时间呈正相关，各组间甲状腺功能无明显差异。　　经过BMSC移植干预治疗后，小鼠炎症浸润程度评分在PBS注射组与BMSC移植组间无明显差异;免疫组化染色凋亡质保Caspase3结果提示，BMSC移植组较PBS注射组Caspa

关键词： 骨癌痛   前强啡肽基因   脊髓鞘内注射   骨髓间充质干细胞   镇痛效应  

摘要： 研究目的：　　1、强啡肽镇痛效应强、安全性好、无呼吸抑制和成瘾性等优势，是目前生物镇痛研究的重点。探讨慢病毒介导的大鼠前强啡肽(PDYN)基因在骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)中的表达，为后续研究大鼠癌痛模型的生物镇痛提供条件。　　2、探讨脊髓鞘内注射前强啡肽基因（PDYN）修饰骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)治疗骨癌痛大鼠的镇痛效应。　　研究方法：　　1、采用贴壁筛选法分离和扩增BM-MSCs，流式细胞学和体外成脂、成骨细胞诱导分化实验鉴定。构建大鼠PDYN慢病毒载体并感染BM-MSCs，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达和 Western blot法筛选最适感染复数(MOI);实验分为空白组(BM-MSCs)、实验组（PCDH-CMV-PDYN-EF1-copGFP）、空载体(PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP)，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blot检测PDYN表达变化，采用免疫细胞化学染色法检测强啡肽(DYN)蛋白表达。　　2、将含5×106/ml MADB-106大鼠乳腺癌细胞注射到SD大鼠胫骨靠近干骺端骨髓腔，制作骨癌痛模型（B组），同时设对照组（C组，n=8）。所有大鼠于术前1天、术后3、5、7、10、14天测定热刺激缩足潜伏期（paw withdrawal thermal latency,PWL）、自由行走痛评分、机械刺激缩足阈值（paw withdrawal mechanical threshold,PWT）疼痛行为学指标。骨癌痛模型制备成功的B组（n=24）采用随机数字法均分为3组，分别鞘内注射无菌生理盐水20μl(B1组)、鞘内注射BMSCs-VESTOR细胞悬液20μl(B2组)、注射BMSCs-PDYN细胞悬液20μl(B3组)。鞘内注射后3、5、7、10、14天检测疼痛行为学指标，最后一次行为学检测后处死大鼠并取L4-6节段脊髓组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)测定PDYN mRNA 表达，Western Blot和石蜡切片免疫组化测定脊髓背角强啡肽(DYN)蛋白表达。另采用裸鼠致瘤实验检验该细胞系的安全性。　　研究结果：　　1、BM-MSCs呈长梭形纤维细胞样贴壁生长，多数表达CD29、CD44、CD90，少数表达CD45。成脂诱导培养后油红O染色为阳性;成骨诱导培养后出现矿化结节，经茜素红染色呈橘红色。流式细胞仪检测示BM-MSCs细胞中CD29、CD90、CD44、CD45阳性率分别为（99.80±0.19）％、（99.62±0.24）%、（96.86±1.27）%、（0.82±0.06）%，转染PDYN基因后BM-MSCs表面标记CD29、CD90、CD44、CD45阳性率分别为（99.59±0.34）%、（98.06±1.51）%、（95.23±0.71）%、（10.23±0.59）%。转染前后BM-MSCs干细胞特性差异无统计学意义（P>0.05）。经PCR扩增克隆测序鉴定慢病毒载体PCDH-CMV-PDYN-EF1-copGFP构建成功，重组慢病毒滴度为5×106IU/mL。绿色荧光蛋白的表达和Western blot结果示慢病毒MOI=100为最佳病毒感染复数。qPCR、Western blot检测到经慢病毒载体感染后的BM-MSCs中PDYN基因表达均上调（P<0.05），免疫细胞化学染色检测显示DYN蛋白表达显著增强。　　2、与C组和术前基础值相比，B组大鼠在造模术后5天PWL逐渐缩短（P<0.05），PWT显著降低(P<0.05)，自由行走痛评分逐渐升高（P<0.05），术后14天差异尤为明显（P<0.05）;B组间经鞘内注射处理后，B3组PWL逐渐延长（P<0.05），自由行走痛评分降低（P<0.05），PWT逐渐升高(P<0.05)，而B1组和B2组在鞘内注射前后无显著变化(P>0.05)。B组大鼠脊髓组织的PDYN mRNA表达均高于C组(P<0.05)，且B3组较B1组、B2组PDYN mRNA表达显著上调(P<0.05)。Western Blot和石蜡切片免疫组化结果显示B组与C组比较DYN蛋白表达显著增强(P<0.05)，B3组较B1组、B2组DYN蛋白表达显著增强(P<0.05)，B1组和B2组比较无统计学差异(P>0.05)。裸鼠致瘤实验表明注入BMSCs-PDYN细胞系未发现致瘤性。　　研究结论：　　1、成功培养BM-MSCs和构建大鼠PDYN基因过表达慢病毒载体，在BM-MSCs中能高效稳定表达PDYN基因和分泌DYN蛋白。　　2、鞘内注射前强啡肽基因修饰骨髓间充质干细胞能上调骨癌痛大鼠脊髓PDYN mRNA表达，脊髓背角强啡肽蛋白表达显著增加，从而有效改善骨癌痛大鼠的

关键词： 猕猴   间充质干细胞   肝纤维化   骨关节炎   细胞标记   细胞移植   玻璃化冻存  

摘要： 肝脏疾病是对人类健康和社会经济造成巨大危害的重大疾病之一。目前,该病在基础研究和临床应用上面临着亟待关注和解决的问题,一是缺乏能真实重现人类肝病病理和代谢特征的动物模型,二是严重肝病所需肝脏移植供体的紧缺和免疫排斥。因此,选择与人类在进化上高度近缘、在遗传上高度相似的高等灵长类动物作为人类肝病的动物实验模型,进行在再生医学领域有广阔应用前景、可以规避移植供体紧缺和免疫排斥问题的干细胞移植研究,成为生物医学领域的发展趋势和技术急需。猕猴隶属灵长目猴科猕猴属动物,又称恒河猴。作为高等非人灵长类,猕猴与人类在进化上高度近缘、在遗传上高度相似,因此较其他物种,猕猴在临床前研究的有效性倍受认可,也因此成为生物医药研究的重要实验动物。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类存在于中胚层和外胚层组织中的成体结缔组织干细胞,可从包括骨髓在内的多种组织中分离得到,易分离、易体外扩大培养,可向肝细胞等多种细胞类型分化并促进组织再生,且在临床应用上不存在伦理问题,被认为是临床细胞治疗和再生医学领域最具前景的“种子细胞”。针对肝病基础研究和临床应用中的上述两个亟待解决的问题,本研究以猕猴的MSCs作为研究对象,系统开展了以下研究:猕猴骨髓MSCs的分离鉴定,骨髓和脂肪来源MSCs的肝向分化潜能比较,绿色荧光蛋白(GFP)和新型超顺磁纳米铁(MIRB)标记对MSCs特性影响的分析,猕猴骨髓MSCs对肝纤维化模型猕猴和小鼠的移植治疗研究,猕猴骨髓MSCs对自发性骨关节炎猕猴的移植治疗研究,及玻璃化冻存对猕猴骨髓MSCs的生物学特性影响研究。希望通过上述研究工作为进一步探讨猕猴MSCs在患肝脏等疾病的动物体内的分化、定植、跟踪及相应的临床研究提供重要的理论、技术和应用参考,同时也为MSCs冻存条件的优化提供有益信息。具体研究内容如下:1、从猕猴骨髓中通过差速贴壁的方法分离得到的梭状或纤维状的细胞,通过对其表面蛋白分子及成脂、成骨和成软骨细胞分化潜能的综合鉴定,并对照国际细胞治疗协会(ISCT)对MSCs的鉴定标准,证实分离得到可靠的MSCs,为以下的MSCs一系列进一步研究奠定了细胞材料基础。2、通过形态观察、糖原染色、尿素检测、肝特异性基因表达等比较分析证明了骨髓MSCs的肝向分化潜能大于大网膜脂肪MSCs。3、分别采用绿色荧光蛋白(GFP)和新型超顺磁纳米铁(MIRB)标记猕猴骨髓MSCs,通过对标记率、增殖力和分化能力方面检测发现,标记率均可达到98%以上,而且标记后并没有影响MSCs的增殖活力和功能。MSCs的两种标记方法不仅能满足体外组织切片的荧光检测,同时可通过核磁共振跟踪输注在体内的MSCs,对了解进入体内的MSCs的迁移、归巢、定植和MSCs的命运归宿具有重要意义。4、成功建立了二甲基亚硝按(DMNA)诱导的猕猴肝纤维化模型和四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化模型。5、用稳定GFP标记的MSCs静脉移植至DMNA诱导的肝纤维化猕猴和CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型上,进行猕猴MSCs移植治疗应用研究。通过血清学、病理学、影像学等指标对MSCs移植治疗肝纤维化的有效性进行综合评价,结果显示,MSCs移植1个月后,无论猕猴还是小鼠,相关指标均有一定改善,提示猕猴骨髓MSCs对同种异体抑或异物种的肝纤维化的治疗均有一定疗效。6、作为MSCs治疗的有效性对照,我们还进行了猕猴骨髓MSCs对自发性骨关节炎猕猴的移植治疗的初步研究。将猕猴骨髓MSCs移植至自发性骨关节的猕猴关节腔内,通过3次移植后发现,关节大小、腿部伸直度、血清指标、X-ray、MRI和运动行为等指标均有一定改善,提示同种异体的骨髓MSCs对猕猴骨关节炎治疗也有一定疗效。7、为筛选和建立猕猴MSCs长期冻存的最佳条件,我们分析了两种渗透性冷冻保护剂DMSO和EG玻璃化冻存对猕猴骨髓MSCs的生物学特性的影响,结果显示:两种冷冻剂对细胞形态、表面分子和分化能力的影响没有明显差异,但是在细胞存活率和增殖活力上,EG冻存剂具有更明显的优势。进一步的转录组测序结果显示,EG冻存组与未冻存组相比有6987个差异表达基因,DMSO冻存组与未冻存组比较存在2524个差异表达基因,两组的交集基因有1886个,显示不同的玻璃化冻存剂对MSCs基因表达存在着一定程度的不同影响。改变的基因包括8个干细胞多能性相关基因、28个分化能力相关基因、44个MSCs特异性相关基因、4个MSCs免疫抑制和免疫调节基因、26个调控甲基化相关基因、21个氧化应激和脂质过氧化相关基因、6414个糖代谢、脂代谢、核酸代谢及ATP合成相关基因和88个细胞凋亡、坏死和自噬相关的基因。GO功能富集分析显示,差异表达基因主要富集在免疫反应功能、免疫系统进程和水解酶以及细胞因子的活性上。进一步的统计