关键词： 骨髓间充质干细胞   缺血性脑卒中  

摘要： 骨髓间充质干细胞（BMSCs）治疗缺血性脑卒中已得到动物实验和临床研究的证实,但其复杂的作用机制尚待进一步研究。本文就BMSCs治疗缺血性脑卒中的移植途径,向脑缺血区域的定向迁移、免疫调制功能、抑制细胞凋亡、增强脑缺血区的血管发生、神经营养因子的分泌、分化替代及重建神经环路等多个方面进行文献综述。1 BMSCs移植途径BMSCs可通过颅内和血管内两种移植途径接种〔1〕。

关键词： 心肌病,扩张型   干细胞   细胞移植   Meta分析   组织工程   骨髓干细胞   扩张型心肌病   安全性   有效性  

摘要： 背景:自体骨髓间充质干细胞已被用于扩张性心肌病的临床治疗,但其安全性和有效性存在争议。目的:运用Meta分析方法评价自体骨髓间充质干细胞移植治疗扩张性心肌病的安全性和有效性。方法:系统检索Pub Med、Cochrane Library(2016年第2期)、Embase、CNKI、CBM、维普、万方数据库中,有关自体骨髓间充质干细胞移植与常规药物治疗扩张性心肌病的临床随机对照试验。运用R3.1.0软件对两种治疗后的左室射血分数、左室舒张末期内径、6 min步行距离、心肌灌注缺损面积百分比、治疗及随访过程中患者死亡率、恶性心律失常发生率及心脏移植率进行Meta分析。结果与结论:纳入7个随机对照试验,合计341例扩张性心肌病患者。Meta分析结果显示:与常规药物疗法相比,自体骨髓间充质干细胞移植能增加扩张性心肌病患者左心室射血分数[1个月:MD=3.02,95%CI(1.55,4.49);3个月:MD=4.38,95%CI(3.55,5.52);6个月:MD=6.47,95%CI(4.78,8.15);≥12个月:MD=8.23,95%CI(5.15,9.19)],降低治疗3个月后的左室舒张末期内径[3个月:MD=-0.65,95%CI(-0.72,-0.59);6个月:MD=-0.12,95%CI(-0.21,-0.03);≥12个月:MD=-0.19,95%CI(-0.24,-0.13)],增加治疗6个月后6 min步行距离[6个月:MD=87.70,95%CI(51.55,123.85);≥12个月:MD=143.83,95%CI(122.73,164.93)],降低治疗3个月的心肌灌注缺血面积百分比[MD=-3.56,95%CI(-5.57,-1.55)],降低治疗及随访期间死亡率[RR=0.46,95%CI(0.24,0.89)];两种治疗在降低恶性心律失常及心脏移植率上无明显差异。研究结果提示,自体骨髓间充质干细胞移植治疗扩张性心肌病疗效优于常规药物疗法,且安全性良好。

关键词： 骨不连   骨髓间充质干细胞   细胞移植   治疗机制  

摘要： 骨髓间充质干细胞(BMSC)不仅具有成骨分化潜能,而且可以分泌多种生物活性分子及细胞外膜泡以调节损伤区域的微环境,从而促进骨组织再生,为治疗骨不连的研究热点。该文结合BMSC应用于骨不连治疗的研究,分析了其在骨不连治疗中的可行性,主要从BMSC募集、迁徙到损伤区域及成骨分化等直接作用和由分泌作用介导的血管生成、抗纤维化、抗凋亡及成骨分化调节等间接作用方面对BMSC治疗骨不连机制研究进展作一综述。

关键词： 骨髓间充质干细胞   ALF   Bcl-2基因   细胞示踪  

摘要： 目的构建Bcl-2基因修饰慢病毒质粒,建立稳定表达Bcl-2基因的骨髓间充质干细胞系,探讨Bcl-2基因修饰的骨髓闸充质干细胞治疗ALF的可行性。方法 PCR合成Bcl-2基因片段并插入GV287空载体后扩增进行慢病毒包装,使用Bcl-2慢病毒液转染大鼠骨髓间充质干细胞,使用单纯未处理骨髓间充质干细胞,移植急性肝损伤模型大鼠,观察移植后大鼠存活情况及其肝脏病理改变。结果得到纯化的骨髓间充质干细胞细胞株;成功分离Bcl-2基因DNA片段并构建Bcl-2基因重组慢病毒质粒,并成功转染到骨髓间充质干细胞中,经荧光显微镜检测GFP荧光及免疫印迹蛋白检测,转染后细胞可高表达Bcl-2基因,转染后细胞状态较好,可进行移植实验;模型鼠经过尾静脉移植骨髓间充质于细胞后,共聚焦显微镜下观察肝脏冰冻切片病理,骨髓间充质干细胞,可以定植到损伤肝脏组织。结论初步证实,骨髓间充质干细胞能够在急性肝损伤大鼠肝脏归巢,并且能发挥一定程度治疗作用。

关键词： 大鼠   类风湿性关节炎   IL-1β   SiRNA   BMSCs   基因联合细胞治疗  

摘要： 类风湿性关节炎(RA)是一种系统性的自身免疫性疾病,关节炎发病在家禽家畜中均有存在,尤其对鸡、猪、牛的危害较为严重。该病虽然致死率不高,但其一旦发病便难以痊愈,导致畜禽行动不便,出现发育迟缓,经济价值降低甚至淘汰,由此给养殖场带来严重损失。已有研究发现将白细胞介素1受体(IL-1R)基因转染进大鼠,抑制了白细胞介素β(IL-1β)的作用,大鼠RA症状可得到明显改善。骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学特性独特并且参与多环节的免疫调节,具有促进损伤的修复的作用,因而被广泛应用于免疫性疾病的细胞治疗。本实验利用Ⅱ型胶原蛋白诱导方法制备RA模型大鼠,初步探讨RA发病的免疫机制。研究RA的发病与IL-1β表达量变化的关系,并用IL-1β小干扰RNA(SiRNA)体内转染结合BMSCs移植治疗RA模型大鼠,研究BMSCs联合基因治疗对RA的治疗效果。1关节炎大鼠模型的制备及部分机制的研究采用尾根部散点注射鸡Ⅱ型胶原和完全复氏佐剂乳化液的方法制备类风湿性关节炎大鼠模型,实验组分为CIA、AA和正常组,造模后以大鼠足趾肿胀、强迫游泳、DR-X线成像、脏器指数、关节病理切片等进行检测,筛选出成功RA大鼠模型。通过对成功大鼠模型的血清中IL-1β、脾脏组织Treg的特异性标志物Foxp3及Treg细胞表面的TGF-β1以及凋亡相关分子PD-1的研究,探讨调节性T细胞在RA发生发展中的意义。结果显示,AA模型组和CIA模型组的大鼠体重增长速度下降,CIA模型鼠减缓更明显,CIA造模组14天内关节肿胀明显,21天后大鼠左右关节肿胀达到病程的最高峰,30天后部分大鼠关节僵直、畸形、表面出现皮肤出现结节。CIA组和AA组大鼠脾脏、胸腺占体重指数极显著高于正常对照组(p<0.01);两模型组大鼠强迫游泳不动时间从造模后1周、2周、3周、4周均极显著高于正常组(p<0.01),挣扎时间均极显著低于正常对照组(p<0.01);关节滑膜组织切片显示,大鼠模型关节软骨有明显的糜烂或溃疡,滑膜、关节软骨及关节腔内有重度的混合型炎性细胞浸润,另外还可见有多核巨细胞即肉芽肿的形成。AA模型组和CIA模型组大鼠造模后2周血清中IL-1β含量极显著高于正常对照组(18.49±1.70pg/mL、36.98±0.97pg/mLvs16.23±0.44pg/mL;p<0.01),两模型大鼠 PD-1、TGF-β1、Foxp3的相对表达量极显著低于对照组(p<0.01),同时CIA模型大鼠脾脏中PD-1、TGF-β1、Foxp3的表达量极显著低于AA模型大鼠(p<0.01)。提示采用尾根部散点注射鸡Ⅱ型胶原和完全复氏佐剂乳化液成功建立RA大鼠模型,且模型大鼠血清内IL-1β的表达量随RA病程而上升。RA的发生可能与调节性T细胞数量的减少或者功能缺陷有关。2 IL-1β-siRNA干扰BMSCs中IL-1β表达的实验研究针对RA模型大鼠血清中IL-1β的含量显著高于正常大鼠的实验结果,利用降低动物机体IL-1β分泌技术,阻止炎症反应进程,本实验利用LPS体外刺激BMSCs高表达IL-1β,模拟RA体内炎症反应,采用siRNA干扰技术体外干扰BMSCs表达IL-1β,通过ELISA法和Westernblot对IL-1β蛋白水平表达变化进行检测,Q-PCR对IL-1β基因水平的表达变化进行检测,筛选出最佳IL-1β SiRNA抑制基因。LPS刺激后,LPS-BMSCs组与BMSCs组细胞上清以和裂解物中的IL-1β量存在极显著差异(p<0.01),通过荧光强度筛选siRNA的最佳转染条件为1OOnMsiRNA与0.5ul转染试剂的组合;siRNA干扰后,BMSCs培养上清中LPS-BMSCs组的IL-1β表达量极显著高于对照组(347.84±6.17pg/mL vs 119.38±2.92pg/mL;p<0.01);LPS+SiRNA157、LPS+SiRNA238、LPS+SiRNA788 的表达量分别为 126.21±2.25pg/mL、52.66±1.72pg/mL、101.83±3.65 pg/mL均极显著低于LPS-BMSCs组(p<0.01)。三条siRNA序列均可沉默IL-1β的蛋白表达,其中SiRNA238组的IL-1β表达极显著低于对照组(P<0.01)。LPS+BMSCs+siRNA157、LPS+BMSCs+siRNA238、LPS+BMSCs+siRNA788 的 mRNA 相对表达量极显著低于 LPS+BMSCs(0.92±0.079、0.28±0.015、0.97±0.174vs2.74±0.15;p<0.01),LPS+BMSCs+siRNA238同时也极显著低于正常对照组(p<0.01)。提示LPS刺激BMSCs后成功模拟了体内炎性反应促进了 IL-β

关键词： 矽肺   正电子发射计算机断层显像   计算机体层扫描   骨髓间充质干细胞   肺纤维化  

摘要： 目的:探讨小动物PET-CT和CT动态观察活体大鼠矽肺模型的可行性及骨髓间充质干细胞（BMMSCs）对染矽尘大鼠肺纤维化的作用。方法:1、无特定病原体级健康SD大鼠分为模型组和对照组,模型组一次性气管内注入质量浓度为30 g/L的矽尘混悬液建立大鼠矽肺模型,对照组与等体积的0.9%氯化钠溶液。2组大鼠均于于造模后第1、2、3、4、6、8和12周分别随机选取6只,以小动物正电子发射计算机断层显像（PET）/计算机体层扫描（CT）进行肺部CT扫描并检测CT值,同时进行PET-CT扫描并检测18F-氟代脱氧葡萄糖标准化摄取值（SUV）。扫描后处死大鼠,检测肺脏脏器系数,进行肺脏病理组织学观察,检测血清转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素1（IL-1）和肺组织羟脯氨酸（HYP）水平。2、将SPF级SD大鼠随机分为2周组、4周组、模型组、正常组,每组6只,雌雄各半。前三组每只大鼠均通过气管注射0.5ml质量浓度为40mg/ml的无菌二氧化硅（SiO2）悬液,正常组注射无菌生理氯化钠溶液0.5ml,同时用全骨髓贴壁法分离培养供体大鼠BMMSCs,再分别在染尘第2周和第4周,对2周组和4周组每只大鼠经尾静脉输注0.5ml浓度为5×10～6/ml的BMMSCs悬液。在第12周对大鼠进行肺部CT扫描,测肺系数,观察大鼠肺部病理切片,检测肺组织羟脯氨酸（HYP）含量及血清转化生长因子β1（TGF-β1）浓度,比较不同组大鼠上述检测指标。结果:1、模型组大鼠肺脏病理组织学改变在早期表现为肺组织炎症性渗出,随着时间延长,炎症反应逐渐减轻,而肺间质纤维化逐渐明显;PET-CT和CT影像学表现与病理组织学改变基本一致。模型组大鼠肺部SUV在第1～4周4个时间点均高于同时间点对照组（P<0.05）,且呈现随染尘时间的增加而下降（P<0.05）。模型组大鼠肺部CT值在7个时间点均高于同时间点对照组（P<0.05）,且在第1～6周呈现随染尘时间的增加而下降（P<0.05）,在第6～12周呈现随染尘时间的增加而升高（P<0.05）。模型组大鼠肺脏脏器系数在7个时间点均高于同时间点对照组（P<0.05）,且在第1～4周呈现随染尘时间的增加而下降（P<0.05）。除第3和4周外,模型组大鼠血清TGF-β1水平在其余5个时间点均高于同时间点对照组（P<0.05）,且在第1～4周随染尘时间的增加而下降（P<0.05）,在第4～8周随染尘时间的增加而升高（P<0.05）。模型组大鼠血清IL-1水平在第1～4周4个时间点均高于同时间点对照组（P<0.05）,且随染尘时间的增加而下降（P<0.05）。模型组大鼠肺组织HYP水平在7个时间点均高于同时间点对照组（P<0.05）,且在第6～12周随染尘时间的增加而升高（P<0.05）。2、肺部CT显示正常组大鼠肺野清透,肺纹理清晰,模型组大鼠肺部见弥漫分布、大小不一的颗粒状高密度影,及条索状或网状纤维影,4周组肺部可见散在的颗粒状高密度影及网状阴影,颗粒大小及分布面积均小于模型组,2周组大鼠肺部可见散在分布的细小颗粒状阴影。模型组、4周组、2周组、正常组肺部平均CT值依次递减,模型组高于正常组,4周组高于2周组[（-177.883±7.610）vs（-210.217±6.406）vs（-259.400±7.599）vs（-367.233±9.887）,P<0.05]。模型组、2周组、正常组肺系数依次递减,模型组高于正常组,4周组高于2周组[（0.544±0.020）vs（0.451±0.022）vs（0.311±0.010）,P<0.05],而4周组和模型组无显著性差异（P>0.05）。肺组织病理切片显示正常对照组大鼠肺泡结构完整,无炎症细胞浸润、渗出及纤维增生;模型组可见大片矽结节融合成片,血管壁增厚,肺泡结构明显减少;4周组矽结节范围较模型组小,肺泡间隔明显增厚;2周组大鼠肺部矽结节又明显少于4周组,部分肺泡间隔增厚。模型组、4周组、2周组、正常组肺组织HYP含量依次递减,模型组高于正常组,4周组高于2周组[（0.923±0.039）vs（1.811±0.115）vs（2.681±0.433）μg/mg肺湿重,P<0.05];血清TGF-β1浓度也按照模型组、4周组、2周组、正常组的顺序依次递减,模型组高于正常组,4周组高于2周组[（41.664±1.207）vs（46.807±1.645）vs（49.947±1.840）μg/L,P<0.05]。结论:小动物PET-CT/CT可有效观察活体矽肺模型大鼠早期炎症和晚期纤维化,可作为动态追踪矽肺大鼠模型肺部损伤的检测方法,并在进一步研究中用小动物CT观察到BMMSCs可减轻矽尘引起的肺纤维化,在早期应用效果更佳。

关键词： 间充质干细胞   缺血再灌注损伤   HO-1   自噬   中性粒细胞  

摘要： 研究目的:缺血再灌注是部分肝切除或肝移植术后肝脏损伤的主要原因。因此,寻找治疗缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤的有效方法是亟待解决的临床问题。目前,有研究结果显示间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可能具有治疗肝脏I/R损伤的作用。本研究旨在探究MSCs对肝脏I/R损伤的治疗作用及机制,为临床使用MSCs治疗肝脏I/R损伤提供理论依据。研究方法:研究第一部分:实验大鼠随机分为Sham组:麻醉后开腹,不行肝脏血流阻断;I/R组:采用70%肝脏I/R损伤模型;I/R+MSCs组:经阴茎背静脉输注1ml含1 × 1 06/ml个MSCs悬液,其余操作同I/R组;ZnPP组:腹腔注射ZnPP(10mg/kg),其余操作同I/R+MSCs组。再灌注6小时后收集大鼠外周血及肝脏组织。通过观察谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平及肝组织病理切片判断MSCs移植对I/R损伤的治疗效果。通过蛋白质免疫印迹及免疫组化法检测肝内HO-1在此治疗过程中的变化,探究HO-1在MSCs减轻肝脏I/R损伤中的作用。研究第二部分:(1)实验大鼠随机分为Sham组:麻醉后开腹,不行肝脏血流阻断;I/R组:采用70%肝脏I/R损伤模型;I/R+MSCs组:经阴茎背静脉输注1ml含1×106/ml个MSCs悬液,其余操作同I/R组;ZnPP组:腹腔注射ZnPP(10mg/kg),其余操作同 I/R+MSCs 组;3-MA 组:腹腔注射 3-MA(30mg/kg),其余操作同I/R+MSCs组。通过蛋白质免疫印迹检测不同组别肝内LC3B(自噬特异性指标)表达水平,阐释自噬在MSCs减轻肝脏I/R损伤中的作用。(2)实验大鼠随机分为Sham组:麻醉后开腹,不行血流阻断;I/R组:采用70%肝脏I/R损伤模型;I/R+MSCs组:经阴茎背静脉输注lml含1 ×106/ml个MSCs悬液,其余操作同I/R组;ZnPP组:腹腔注射ZnPP(10mg/kg),其余操作同I/R+MSCs组;anti-PMN组:经阴茎背静脉输注0.8 ml抗中性粒细胞血清,其余操作同I/R组。通过观察肝组织MPO及MDA的变化,探究中性粒细胞在MSCs减轻肝脏I/R损伤中的作用。研究结果:研究第一部分:MSCs移植可以减轻肝脏I/R损伤,表现为ALT、AST水平的显著下降(p<0.05);肝脏病理切片上肝小叶结构紊乱范围缩小,肝细胞空泡化、点状坏死数目减少;损伤评分的降低(p<0.05)。蛋白质免疫印迹及免疫组化结果显示MSCs移植可以上调肝内HO-1的表达水平(p<0.05)。通过使用HO-1特异性抑制剂ZnPP处理大鼠可以抑制MSCs减轻肝脏I/R损伤的作用。研究第二部分:(1)蛋白质免疫印迹结果显示MSCs移植可以在HO-1介导下促进肝内自噬水平的上调(p<0.05);应用自噬特异性抑制剂3-MA发现MSCs移植治疗肝脏I/R损伤的作用依赖于肝内自噬水平的上调(p<0.05)。(2)通过使用抗中性粒细胞血清发现中性粒细胞参与肝脏I/R损伤过程;免疫组化及MDA结果显示MSCs在HO-1介导下通过抑制肝内中性粒细胞的募集及氧化应激水平减轻肝脏I/R损伤(p<0.05)。研究结论:(1)MSCs移植可在HO-1的介导下减轻肝脏I/R损伤;(2)MSCs移植减轻肝脏I/R损伤的作用依赖于肝内自噬的水平的上调;(3)MSCs移植通过抑制肝内中性粒细胞的募集及氧化应激水平减轻肝脏I/R损伤。

关键词： 溃疡性结肠炎   石榴皮   骨髓间充质干细胞   黏膜损伤   动物模型  

摘要： 目的:探讨石榴皮水煎剂诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)在溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠体内迁移的影响，阐释中药石榴皮归经的部分现代科学内涵。方法:全骨髓贴壁法体外分离、培养BMSCs，用荧光染料CM-DiI标记第三代细胞观察并检测其存活率及平均荧光强度;建立大鼠UC模型，随机分为模型组、石榴皮组、BMSCs组、BMSCs+石榴皮组，外加正常组。尾静脉细胞移植，给药。观察大鼠一般情况，疾病活动指数评分(DAI)、结肠黏膜损伤指数评分(CMDI)、组织病理学评分(HS)，荧光显微镜下观察模型组、BMSCs组及BMSCs+石榴皮组肺、肝、脾、胃、小肠、心、肾、脑组织和结肠内溃疡灶与非溃疡灶BMSCs的分布，免疫组化检测BMSCs在结肠内的定植及基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的表达。结果:体外培养的BMSCs呈均一的长梭形漩涡状盘旋排列、贴壁生长，标记的BMSCs呈橙红色荧光，10d后仍有约95％可镜下观察到。从标记培养开始，存活的细胞数逐渐减少，细胞平均荧光强度在1d开始逐渐增强，4d时最明显，随着培养时间延长，荧光强度逐渐下降，与1d比较，10d下降显著(P＜0.01)。大鼠UC造模后，与正常组相比，一般情况较差，CMDI、DAI、HS评分明显升高，表明造模成功。移植BMSCs、石榴皮灌胃治疗后，与模型组相比，BMSCs及BMSCs+石榴皮组DAI评分显著降低(P＜0.01);与BMSCs组相比，CMDI、HS评分中，BMSCs+石榴皮组评分结果均明显下降(P＜0.01，P＜0.05)。荧光显微镜下，除心、脑内几乎不含BMSCs外，其他组织中均有，在含血丰富的肺、肝、脾中细胞滞留明显，肺＞脾＞肝，结肠溃疡灶细胞数目多于非溃疡灶，BMSCs+石榴皮组结肠溃疡处细胞数明显增多(P＜0.01)。与模型组相比，各治疗组结肠组织内SDF-1蛋白表达平均光密度值均有不同程度增高，其中BMSCs+石榴皮组更显著(P＜0.01)。结论:表明石榴皮与骨髓间充质干细胞联用，能减轻UC病损处细胞浸润程度，修复黏膜损伤，提高UC疗效。其作用机制可能与上调SDF-1的表达，促进BMSCs归巢于受损肠道进行增殖分化有关。同时多脏器归巢结果中对结肠组织的倾向性在一定程度上阐释了“石榴皮归大肠经”的现代科学内涵。

关键词： 胰岛   骨髓间充质干细胞   共培养   联合移植   PET-CT  

摘要： 以标准的糖尿病大鼠为模型,探索同种异体的SD大鼠胰岛联合骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Cells,BMSCs)能否提高治疗糖尿病的远期疗效,为临床开展胰岛联合BMSCs移植治疗糖尿病的提供实验依据,并观察同种异体大鼠联合BMSCs移植后细胞在体内的分布、归巢情况,为临床细胞移植后细胞的定植、归巢提供理论依据。链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建大鼠糖尿病模型;贴壁法分离、培养BMSCs,免疫荧光法和流式细胞鉴定BMSCs的表面抗原(CD44、CD34、CD90、CD45、CD29);胶原酶法分离大鼠胰岛,双硫腙法(Dithizone,DTZ)鉴定胰岛细胞;将细胞分为对照组;BMSCs培养组;单独胰岛组;胰岛与BMSCs共培养组,于培养后的第1、3、7天取其上清液进行ELISA法检测各组的胰岛素与C-肽的分泌;18F-FDG体外标记胰岛与BMSCs,随机将糖尿病大鼠分成:对照(n=15)、单独胰岛移植组(n=15)、单独BMSCs移植组(n=15)、胰岛与BMSCs联合移植(n=15),经门静脉移植分别移植(对照组0.2ml生理盐水;胰岛组0.2ml胰岛500IEQ/100g;干细胞组0.2ml的3*10^5/100g个BMSCs;联合组0.1ml胰岛500IEQ/100g+0.1ml 3*10^5/100g个BMSCs)。移植后的第1、3、7、14、30天每组每次均随机处死3只大鼠,取肝脏、血液,ELISA测量移植后各组大鼠血清的胰岛素与C-肽的含量及检测大鼠的血清的肝功能,免疫荧光法了解肝组织内胰岛素的表达情况,HE检测肝脏的病理情况,PET-CT示踪移植入体内的细胞分布情况。经STZ法诱导糖尿病大鼠期间有95%的大鼠血糖浓度在一周内有3天连续高于16.8mmol/L的,伴随体重下降,总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶均升高;经全贴壁法培养的BMSCs大多是呈长梭形生长,免疫荧光法的检测结果显示BMSCs为CD44阳性,CD34阴性,流式细胞仪测量结果表明BMSCs是高表达CD90、CD29,低表达CD45的;胶原酶法能够很有效的分离出胰岛细胞,且被DTZ染成猩红色的就是胰岛细胞,未被染成猩红色的就是外分泌腺;体外共培养中的胰岛形态与单独胰岛的形态相比保存的更好,存活的时间也更长,胰岛素与C-肽的分泌也较单独胰岛的高;移植后联合组的血糖在正常血糖内波动一个月,单独胰岛组的血糖水平只能在正常血糖范围波动3天,单独BMSCs组、对照组的大鼠在移植后的血糖水平未明显降低。联合组在移植后的第1、7、14、21、30天的血糖明显低于单独胰岛组,差异有统计学意义(P<0.05);联合组比胰岛组能有效的修复肝脏的功能;联合组的胰岛素与C-肽的分泌也比单独胰岛组高;联合组和单独胰岛组的炎细胞侵润都不明显。PET-CT结果显示,BMSCs主要均匀分布在肝脏的右肝,胰岛主要聚集在肝门静脉末端分支,且BMSCs围绕在胰岛的周围,对照组的肝脏无明显的显影。同种异体的胰岛联合BMSCs治疗大鼠糖尿病的效果优于单独胰岛移植。PET-CT能直观的揭示胰岛与BMSCs经门静脉移植入后在肝内的分布。

关键词： 骨髓间充质干细胞   骨缺损   绿色荧光蛋白   超顺磁性氧化铁  

摘要： 目的:骨缺损的治疗一直是研究的热点，以往使用自体骨、异体骨、人工骨替代品等，然而大的骨缺损其利用率有限并受许多条件限制。随着组织工程学的发展，组织工程骨备受青睐，而种子细胞是组织工程骨的首要条件，以骨髓来源的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)尤为突出，因其低的免疫原性和不受伦理学的限制，且具有能在需要成骨的地方分化为成骨细胞的能力，所以成为近来研究的焦点。然而需要采用一种非侵袭性方法对标记的干细胞进行活体示踪，更好的了解干细胞在体内的生存、迁徙、分化等。常用的活体示踪方法有可见光成像、核磁共振、放射性核素成像等。　　本研究使用绿色荧光蛋白(Green fluoreseent protein，GFP)、超顺磁性氧化铁（Superparamagnetic iron oxide，SPIO）双重标记骨髓间充质干细胞，并在体外培养，接种于羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)支架，移植到SD大鼠颅骨缺损模型中，并用小动物可见光成像对移植的干细胞进行荧光成像，最后用免疫组化的方法进一步证实干细胞的转归，同时也弥补了单一SPIO标记易出现假阳性的可能，为骨缺损的治疗提供了依据。　　研究方法:本实验对GFP、SPIO标记的骨髓间充质干细胞进行体外培养，接种于HA支架，并在特定时间点2d、4w、8w、12w对细胞-支架共培养的复合物进行荧光检测。SD大鼠分成两组，细胞接种HA支架组10只、细胞未接种组10只，将细胞接种的HA支架体外培养1w后移植到SD大鼠颅骨缺损模型中，随后用小动物可见光成像对其进行荧光检测。在4w、8w、12w用小动物可见光成像分别对两组大鼠进行X线拍照，在X线片上进行骨密度测量，做出统计。12w后取材，使用免疫组化、普鲁士蓝、苏木精-伊红(Hemotoxylin-Eosin，HE)方法对组织切片进行观察。　　结果:体外条件下，干细胞与HA支架结合良好，到达12w时间点，荧光显微镜观察显示，支架上仍然有大量的干细胞存在，且干细胞显示出很强的绿色荧光。体内条件下，小动物可见光成像显示，在移植后的第二天，可以观察到微弱的绿色荧光，之后的时间点荧光信号消失。骨密度测量显示，差异有统计学意义，接种细胞组好于未接种细胞组。免疫组化观察显示，移植的干细胞最终分化为成骨细胞，普鲁士蓝染色法观察到组织上有被染成蓝色的SPIO颗粒，HE染色显示出接种细胞组有大量的新骨生成。　　结论:免疫组化的结果显示移植的干细胞最终分化为成骨细胞，且细胞接种支架组有大量的新骨生成，证实了组织工程骨在治疗骨缺损上是一个很好的方法。然而小动物可见光成像系统仅在干细胞移植后的第2d观察到了细胞的绿色荧光，而且很微弱，说明用GFP标记的干细胞用于活体示踪大鼠骨缺损治疗的方法不可靠。