关键词： 炎症性肠病   溃疡性结肠炎   骨髓间充质干细胞  

摘要： 炎症性肠病(IBD)是一种免疫性疾病,目前尚无特殊治疗方法。近年来随着干细胞研究的深入,用其治疗IBD也取得了一定的成果。从当前应用干细胞的最佳移植数量、移植途径、移植应用及治疗机制等方面综述应用干细胞移植治疗IBD的相关研究。

关键词： 骨髓间充质干细胞   放射性骨坏死   人工骨  

摘要： 背景放射性治疗后下颌骨放射性骨坏死疾病发生率较高。目的人体自身来源干细胞治疗放射性骨坏死疾病的可行性。方法髂骨抽取骨髓行离心分离,取干细胞层,一部分与球状人工骨混合回植患者骨坏死区域,另一部分体外分离培养并行干细胞鉴定,定期行术后检查。结果与结论术后1个月口腔内原创口区组织愈合良好,无异常分泌物渗出,黏膜表面无充血红肿,无排异反应。术后3个月大体观察,瘘管消失。自体干细胞回植下颌骨坏死部位,对骨创恢复起到一定的作用。

关键词： 类风湿性关节炎   间充质干细胞   关节   免疫功能  

摘要： 目的:评价骨髓间充质干细胞治疗类风险性关节炎的机制。方法:回顾性分析本院收治的70例类风湿性关节炎患者作为研究对象,按照1:1分配原则分成试验组和对照组,试验组静脉输注间充质干细胞,对照组联合甲氨蝶呤和来氟米特治疗,比较两组晨僵时间、血沉(ESR)、类风湿因子(RF)及C反应蛋白(CRP)等指标,评价临床效果及并发症情况。结果:试验组治疗后关节疼痛、晨僵时间、RF等症状指标改善效果优于对照组(P<0.05),试验组治疗后的IL-6、TNF-α和CRP水平均显著低于对照组(P<0.05)。试验组治疗总有效率88.57%,明显高于对照组的68.57%(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞能显著改善类风湿性关节炎患者关节功能,调节免疫功能,具有一定的治疗优势。

关键词： 骨髓间充质干细胞   凋亡   自噬   OGD  

摘要： 目的:探索骨髓间充质干细胞对大鼠原代髓核细胞凋亡、自噬的影响。方法:体外分离培养大鼠髓核细胞以及骨髓间充质干细胞,进行共培养实验。通过血清剥夺实验模拟体内椎间盘的低血供的病理状态。通过凋亡染色试剂盒以及流式细胞仪方法检测骨髓间充质干细胞对大鼠髓核细胞凋亡率的影响,并进一步通过Western blot实验方法检测凋亡蛋白active-caspase3、active-casepase 9、促凋亡蛋白Bax以及凋亡抑制蛋白Bcl2蛋白表达状况。随后通过Western blot实验验方法检测自噬标志蛋白LC3、Beclin 1的表达。结果:体外培养的大鼠原代髓核细胞在正常的条件下,自噬、凋亡水平均较低。骨髓间充质干细胞共培养大鼠髓核细胞可以显著提高细胞的自噬水平。OGD造模后,大鼠原代髓核细胞的细胞活性显著降低、凋亡水平、自噬水平均显著上调。在相同的造模时间下,使用骨髓间充质干细胞共培养大鼠髓核细胞的细胞活力提高,而自噬水平显著上升并且凋亡水平显著下降。然而,当骨髓间充质干细胞诱导的自噬被Wortmannin抑制后,细胞凋亡率显著提高。结论:在OGD模型中,骨髓间充质干细胞能够显著提高大鼠髓核细胞的细胞活力,自噬水平,并降低大鼠髓核细胞的凋亡水平。使用Wortmannin抑制骨髓间充质干细胞诱导的自噬后,大鼠髓核细胞的细胞活力显著降低,并且凋亡水平显著升高。这些结果指出,BMSC细胞对NPC细胞的保护作用部分是通过自噬机制进行的。目的:探索骨髓间充质干细胞诱导大鼠原代髓核细胞自噬的机制。方法:通过基因表达谱芯片的方法筛选差异表达以以fold change大于2.5,并且FDR值小于0.01为阈值,筛选差异表达mi RNA。使用q RT-PCR方法检测不同处理方法对mi R155表达含量的影响。使用流式细胞仪器以及透射电镜方法检测anti-mi R-155对细胞自噬的影响。使用Targetscan软件以及荧光素酶报告实验检测mi R-155与BACH1 m RNA之间的直接作用关系,并使用Western blot实验方法进行更进一步的验证。结果:通过基因表达谱芯片的方法我们总共挖掘到了15个差异表达mi RNA,其中与NPC+OGD组相比,mi R-155的表达含量差异最大,因此选择mi R-155作为研究对象进行更近一步的研究。OGD+NPC组相比,OGD+NPC+BMSC组细胞中mi R-155的表达含量显著上升。将成功转染anti-mi R155的BMSC细胞与NPC细胞共培养,结果显示与OGD+NPC+BMSC组细胞相比,转染anti-mi R155的共培养细胞组的mi R-155表达水显著降低。此外我们还使用GW4869(10μM)阻断BMSC细胞的外泌体分泌,结果显示共培养细胞组的mi R-155表达水显著降低。透射电镜与流式细胞术的研究结果显示anti-mi R155显著降低了BMSC诱导的NPC细胞自噬。通过生物信息软件Targetscan预测发现,BACH1可能为mi R-155的潜在作用靶点,如图5A所示。为了更进一步的证实mi R-155与BACH1基因的相互作用关系,我们利用荧光酶素报告实验方法检测NPC细胞中野生型BACH1基因以及突变型BACH1基因对mi R-155及mi R-con的响应,结果指出转染mi R-155的具有野生型BACH1基因的大鼠脊髓原代神经元细胞系的荧光响应强度显著降低,而突变型BACH1基因的NPC细胞,荧光响应强度没有发生显著改变。指出mi R-155通过结合在BACH1m RNA的3′UTR区域从而负向调控BACH1的表达。结论:(1)BMSC细胞通过外外泌体途径使NPC细胞中的mi R155表达含量上升。(2)mi R155在BMSC诱导的NPC细胞自噬扮演着促进细胞自噬的角色。(3)mi R-155通过结合在BACH1 m RNA的3′UTR区域从而负向调控BACH1的表达mi R-155可能通过BACH1影响细胞自噬。

关键词： 缺血缺氧性脑损伤   超顺磁性氧化铁   骨髓间充质干细胞   扩散峰度成像   磁性靶向导引  

摘要： 目的探讨DKI(diffusion kurtosis imaging,磁共振扩散峰度成像)对HIBD(hypoxic ischemic brain damage,缺血缺氧性脑损伤)大鼠病变区域损害程度及细胞凋亡程度的评价价值,并通过建立MRI体外活体监测程序,对一种新型的SD大鼠缺血缺氧性脑损伤治疗方法—侧脑室注射SPIO标记BMSCs磁性靶向导引法,进行监测示踪及疗效评估。材料与方法***-PLL标记BMSCs的制备取用6～8周健康的SD(sprague-Dawle)雄性大鼠,手术得到骨髓细胞悬液后,将细胞接种、培养,收集3～5代细胞。用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。流式细胞法检测细胞表面抗原CD29+、CD90+、CD45-、CDllb-的表达。取适量的SPIO和PLL加入DMEM培养基中制得SPIO-PLL混合液。将BMSCs接种于DMEM培养基中孵育12～24h。采用普鲁士蓝染色试剂盒检测SPIO-PLL标记BMSCs的有效率,台盼蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测标记细胞增殖能力。***模型制作各组模型均采用SD大鼠,日龄:7d;体重11.5g～15.6g;性别:雄性。假手术组取7d龄新生SD大鼠,分离出左侧颈总动脉,然后缝合皮肤,碘伏消毒,放入饲养环境中恢复;HIBD组取7d龄新生SD大鼠,分离出左侧颈总动脉,并用手术线双重结扎左侧颈总动脉,缝合伤口,整个手术过程需在5 min内完成;置于原饲养环境中恢复30 min,然后转移至37℃乏氧箱内,控制氧浓度为8%(7%～9%),氧浓度全程由测氧仪监测,湿度为70%±5%,持续缺氧2h;HIBD组在建立HIBD模型24h后,将SD大鼠用手钻破开颅骨,用注射器针头扎破硬脑膜;用微量注射器抽取5 μ 1DMEM培养液,注射器进针深度3mm,按照lW/min速度缓慢匀速注入,注射完成后留针5min,缓慢退出针头,骨蜡封闭骨孔,缝合皮肤。侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组在建立HIBD模型24h后,将SD大鼠用手钻破开颅骨,用注射器针头扎破硬脑膜;用微量注射器抽取5μl细胞悬液,细胞数约为1X 105个,注射器进针深度3mm,按照1μl/min速度缓慢匀速注入,注射完成后留针5min,缓慢退出针头,骨蜡封闭骨孔,缝合皮肤。侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组在侧脑室注入后24h,在大鼠左侧头部固定磁铁2h。鼠尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组在建立HIBD模型24h后,用微量注射器抽取5μl细胞悬液,细胞数约为IX 105个,穿刺鼠尾两侧的鼠尾静脉,将细胞悬液注射入鼠尾静脉内,并用lml生理盐水冲管。3.动物分组将实验动物分为假手术组、HIBD组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组和鼠尾静脉注入SPIO-PLL标记BMSCs组;假手术组8只,HIBD组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs导引组和鼠尾静脉注入SPIO-PLL标记BMSCs组各16只;在实验过程中,各组均未发生大鼠死亡事件;假手术组按照各时间点取脑分别为1W2只,2W2只,3W2只,4W2只,其余各组按照各时间点取脑分别为1W4只,2W4只,3W4 只,4W4 只。***检查技术对大鼠进行MRI检查,时间点分别为各实验组HIBD模型制作后1W、2W、3W、4W;对照组为假手术后1W、2W、3W、4W。扫描序列包括T1WI、T2WI、T2-FLAIR、SWI、DKI。磁共振扫描仪:SIEMENS ***磁共振扫描仪,型号:VERIO,厂家:德国西门子医疗集团。线圈:3.0T 5cm动物专用线圈,4通道,型号:CG-MUC18-H300-AS,生产厂家:上海晨光医疗科技有限公司。DKI 分别扫描三组数据:DKIO、DKI1、DKI2;DKIO b 值为 0,DKI1、DKI2 参数相同,b值分别为1250、2500,弥散方向30个;使用Diffusion Kurtosis Estimator(DKE)将DKI中原始DICOM格式图像转换成nii格式文件;其中参数设置为 B-values:0,1250,2500;FWHM:4.21875,4.21875,4.21875(1.25*voxel size);Gradient Vectors:simens VB13-17 30-direction;转换生成 ***、***、***、***、***、*** 文件,用于数据测量。运用image J软件打开nii文件,分别测量侧脑室后角旁脑白质测量,大鼠脑内ROI(r

关键词： 阿尔茨海默病   骨髓间充质干细胞   TREM2基因   TREM2   DAP12   骨髓间充质干细胞   阿尔茨海默病  

摘要： 研究背景:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一1种以记忆障碍为核心的认知功能下降,并可伴有各种行为障碍及神经精神障碍的神经系统退行性疾病,其严重地降低了患者的生活质量,缩短了患者的生存年限。胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂和脑代谢药物等是目前常用的治疗AD的方法。但药物只能控制早期AD患者的临床表现,无法从病理生理学上逆转AD的进展。因此寻求安全有效的治疗方法迫在眉睫。β淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的沉积是贯穿于AD患者发病全过程的核心环节。脑内的小胶质细胞通过有效去除神经元外和老年斑内的Aβ,以保持Aβ的生成和清除之间的均衡,激活小胶质细胞可以更好地清除Aβ。而小胶质细胞活化过程中的一个关键蛋白是髓样细胞2触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2),它是TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白(TYRO Protein Tyrosine Kinase Binding Protein,DAP12)的受体。我们的研究旨在以APP/PS1双转基因小鼠为模型,通过基因工程技术将携带TREM2基因真核表达的质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),并将转染后的MSCs立体定向移植到小鼠侧脑室,并采用辐射状六臂水迷宫检测小鼠的行为学特征;以硫磺素S染色的方法,检测小鼠脑石蜡切片Aβ沉积的数量及面积,以酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)来检测脑内Aβ40及Aβ42含量;并以实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative Real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot),观察经侧脑室移植MSCs、空质粒修饰MSCs、TREM2修饰MSCs对转基因小鼠海马区TREM2、DAP12表达的影响,为治疗AD提供更多的实验依据及手段。第一部分 小鼠MSCs的分离及TREM2过表达质粒的构建、转染目的:分离MSCs,并构建TREM2过表达质粒转染MSCs,为下一步实验做好准备。方法:1.本实验采用SPF级出生后1-3 d的C57BL/6N小鼠,取其股骨与胫骨,分离MSCs,并传代培养鉴定。2.依据NCBI查找TREM2基因的CDS序列,构建TREM2过表达质粒,并酶切鉴定。然后将TREM2过表达质粒转染MSCs,qRT-PCR验证pEGFP-TREM2过表达质粒转染后的细胞。结果:1.小鼠MSCs原代分离3d,细胞呈小圆性,形态规整。小鼠MSCs原代分离5 d,细胞呈多梭形,形态较一致。小鼠MSCs传代培养,可见细胞形态良好,多呈梭形。小鼠MSCs鉴定结果显示CD105为阳性,CD34和CD45是阴性;并且该细胞CD105的阳性率达到95%以上,说明该细胞成功分离。2.质粒pEGFP-TREM2经EcoRI/HindⅢ双酶切后,理论上应有4731bp和698bp的条带,我们实验获得条带符合理论值,证明质粒pEGFP-TREM2为正确质粒。3.相比于对照组细胞,TREM2过表达组细胞的TREM2基因表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明pEGFP-TREM2过表达质粒转染MSCs能够上调TREM2的表达。结论:1.全骨髓贴壁筛选法能有效地分离MSCs;***-TREM2过表达质粒成功转染MSCs。第二部分 TREM2过表达质粒转染MSCs对APP/PS1双转基因小鼠的组织学及功能学研究目的:明确TREM2过表达质粒转染MSCs对APP/PS1双转基因小鼠的影响。方法:本实验采用6月龄APP/PS1双转基因小鼠,qRT-PCR法对APP/PS1双转基因小鼠进行鉴定。24只APP/PS1双转基因小鼠随机分为4组:1)APP/PS1+MSCs组;;2)APP/PS1+MSCs+空载质粒组;;3)APP/PS1+MSCs+pEGFP-TREM2组;4)空白对照组(即APP/PS 1组);每组6只。采用立体定向注射的方式,APP/PS1+MSCs组给予2 μl的MSCs悬液;APP/PS1+MSCs+空载质粒组给予2 μl的空载质粒转染的MSCs悬液;APP/PS1+MSCs+pEGFP-TREM2组给予2 μl的pEGFP-TREM2过表达质粒转染的MSCs悬液;空白对照组(即APP/PS1组)给予2 μl的生理盐水。饲养4周后,采用辐射状六臂水迷宫检测四组小鼠的行为;对四组小鼠的脑组织进行硫磺素S染色,检测Aβ沉积的数量及面积;ELISA定量检测四组小鼠脑组织Aβ40及Aβ42的含量;qRT-PCR法检测

关键词： 骨髓间充质干细胞   脊髓损伤   SDF-1α   迁移  

摘要： 目的在课题组前期的BMSCs体外迁移研究基础上,通过建立SCI大鼠模型,观察过表达SDF-1α的BMSCs向脊髓受损区域的迁移情况,同时观察SCI后大鼠的双后肢运动功能的恢复情况及对受损脊髓组织病理结构的修复作用,进一步探讨过表达SDF-1α的BMSCs的体内迁移作用及其对SCI的疗效。方法1、密度梯度离心法提取原代BMSCs,培养至第二代采用流式检测其细胞表型;构建稳定过表达SDF-1α的BMSCs系(SDF-1α-BMSCs),同时建立空载体的BMSCs(null-BMSCs)和SDF-1α沉默的BMSCs(siRNA-BMSCs)两种细胞系作为对照。2、改良Allen方法构建SCI大鼠模型,将实验动物分为六组:Control组、Sham组、PBS组、null-BMSCs移植组、SDF-1α-BMSCs移植组和siRNA-BMSCs移植组,造模成功后,使用BBB评分表评估大鼠的双后肢运动功能恢复情况。3、(1)组织病理切片HE染色观察分析移植过表达SDF-1α的BMSCs对大鼠受损脊髓组织形态的影响。(2)Western blot方法检测各组大鼠脊髓组织内的SDF-1α和CXCR4蛋白含量。(3)荧光显微镜下观察BMSCs迁移至脊髓受损区域情况。(4)激光共聚焦显微镜下观察SCI前后SDF-1α和CXCR4阳性细胞在脊髓内的空间分布。结果1、成功构建稳定过表达SDF-1α的BMSCs系(SDF-1α-BMSCs)。2、成功构建SCI大鼠模型;在SCI后第28天,null-BMSCs移植组和SDF-1α-BMSCs移植组的BBB分值均高于PBS组和siRNA-BMSCs移植组,同时SDF-1α-BMSCs移植组的分值高于null-BMSCs移植组。3、(1)在SDF-1α-BMSCs移植组,脊髓灰白质结构改善情况最佳。(2)与Control组和Sham组相比,SDF-1α和CXCR4蛋白含量在PBS组、null-BMSCs移植组和siRNA-BMSCs移植组中较低,但在SDF-1α-BMSCs移植组中增多,同时SDF-1α-BMSCs移植组较null-BMSCs移植组多。(3)SDF-1α-BMSCs移植组的GFP(+)的细胞数量相对null-BMSCs移植组和siRNA-BMSCs移植组多。(4)共聚焦显微镜下观察到:1)SDF-1α蛋白主要表达在细胞质中,在正常脊髓组织中,SDF-1α阳性细胞主要分布在灰质前角;SCI后,移植过表达SDF-1α的BMSCs,SDF-1α阳性细胞在受损脊髓白质内分布居多,同时,在灰质内重新可见其分布;2)CXCR4蛋白主要表达在细胞膜上,在正常脊髓组织中,CXCR4阳性细胞集中分布在脊髓中央管周围的室管膜层;SCI后,移植过表达SDF-1α的BMSCs,CXCR4阳性细胞在受损脊髓灰白质内均有分布。结论1、过表达SDF-1α的BMSCs移植治疗SCI大鼠双后肢功能恢复速度最快,效果最好以及对受损脊髓组织结构的修复更好。2、结合SDF-1α-BMSCs移植组在脊髓受损区域内SDF-1α和CXCR4的高表达量以及荧光显微镜下GFP(+)的细胞数量最多,提示过表达SDF-1α的BMSCs可能通过SDF-1α/CXCR4生物轴增加BMSCs的归巢率。3、通过激光共聚焦显微镜观察到SDF-1α和CXCR4在SCI前后的空间分布情况,提示过表达SDF-1α可能促进BMSCs在体内的多向分化能力,但移植的BMSCs在脊髓受损区域内是否分化为神经元和神经胶质细胞等需要进一步验证。

关键词： 2型糖尿病   间充质干细胞治疗   磁共振频谱   骨髓间充质干细胞   糖尿病周围神经病变  

摘要： 目的　　利用7T1H-MRS技术检测糖尿病周围神经病变（DPN）大鼠右后肢小腿骨骼肌代谢物细胞内脂质（IMCL）的绝对浓度变化，研究其能否作为评估DPN的神经病变指标的可行性;同时观察局部骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植是否对DPN有治疗作用，1H-MRS检测IMCL浓度能否作为一项客观、可靠的观察指标来监测骨髓间充质干细胞对DPN的疗效评估。　　方法　　分离、培养SD大鼠的BMSCs。用剂量为45mg／kg的链脲佐菌素（STZ）溶液腹腔注射联合高糖高脂喂养制备糖尿病（DM）大鼠，待DM成模后继续喂养8周后制成DPN模型。将雄性SD大鼠分为正常组、DPN组、DPN+BMSCs组和DPN+生理盐水组，每组各6只。DM成模后第4周、第8周及其与之年龄匹配的正常大鼠第4周、第8周和DPN+BMSCs组和DPN+生理盐水组第一次干预后的第2、4、6周进行大鼠右后肢骨骼肌的1H-MRS扫描，原始数据导入LCModel软件拟合后得到代谢物IMCL浓度值;在整个实验期间每周监测血糖和体重;测定4组坐骨神经的运动神经传导速度（MNCV）、感觉神经传导速度（SNCV）;HE染色观察其坐骨神经病理学改变。　　结果　　成功获得第三代BMSCs。腹腔注射STZ溶液的SD大鼠72小时后的血糖及实验期间动态监测血糖均≥16.7mmol/L，成功制作DM模型。MRS：DM成模后第4、8周的IMCL浓度均高于对应时间点的正常组大鼠（P<0.05）;正常组大鼠IMCL浓度第8周高于第4周（P<0.05）;DM成模后第8周的IMCL浓度高于其第4周（P<0.05）;干预后，DPN+BMSCs组的IMCL浓度在移植后的第2、4、6周均低于对应时间DPN+生理盐水组（P<0.05）;DPN+BMSCs组的IMCL在移植后的第2、4、6周与移植前相比均降低（P<0.05）;而DPN+生理盐水组IMCL浓度在干预后的第2、4、6周与干预前相比无统计学意义（P>0.05）。与正常组相比，DPN组、DPN+BMSCs组和DPN+生理盐水组大鼠的坐骨神经MNCV、SNCV均减慢（P<0.05），DPN+BMSCs组的MNCV、SNCV较DPN+生理盐水组改善（P<0.05），HE染色：DPN+BMSCs组和DPN+生理盐水组坐骨神经纤维排列稀疏紊乱、部分见脱失，髓鞘厚薄不均、着色浅，轴索变细等病理改变;与DPN+生理盐水组相比，DPN+BMSCs组的病变程度减轻。　　结论　　糖尿病大鼠在成模8周时能够成功构建DPN大鼠模型。BMSCs对大鼠DPN神经功能修复具有积极的促进意义，但其具体机制以及在临床中使用的可行性仍有待进一步探索。应用7.0T高场强磁共振的单体素1H-MRS技术能定量分析骨骼肌IMCL代谢物浓度变化。1H-MRS可应用于检测DPN骨骼肌IMCL浓度变化，对DPN的临床评估提供一定的参考价值;通过1H-MRS检测肌肉组织的代谢变化可作为间接评估DPN局部细胞疗效的可行技术手段。

关键词： 急性肝功能衰竭   胶原凝胶   MSCs   干细胞移植  

摘要： 研究背景:急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是由多因素所引发的迅速和严重的肝损伤,临床上如何治疗ALF一直是难以解决的问题。现阶段治疗ALF最有效的方法是肝脏移植,但其受到供体短缺和手术费用高昂等因素的限制,无法常规应用。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植作为一种新兴细胞移植疗法,成为了治疗ALF的研究热点,然而,研究表明移植的MSCs仅有少量细胞募集到受损组织,其治疗效果受到移植后的低细胞利用率和存活率的限制。胶原凝胶具有良好的生物相容性和特有的拓扑三维结构,既可以为细胞的靶向递送提供载体,同时也可以提供细胞生长所需的三维环境,进而维持并提高MSCs的存活能力与功能。然而,目前移植胶原凝胶复合MSCs是否对ALF具有更好的治疗效果缺乏研究。本研究建立以D-氨基半乳糖苷(D-Galactosamine,D-Gal)诱导的小鼠ALF模型,通过检测胶原凝胶复合MSCs移植在治疗小鼠ALF中取得的疗效,为胶原凝胶复合MSCs移植应用于临床治疗ALF提供实验基础和依据。研究目的:本研究主要探讨移植胶原凝胶复合MSCs对ALF小鼠的治疗作用及相关作用机制。研究方法:分离C57BL/6小鼠的骨髓MSCs,体外贴壁培养,每3天换液,用传至3-6代的MSCs进行实验。将MSCs与胶原凝胶混合制备,通过扫描电子显微镜检测胶原凝胶与MSCs的生物相容性。将经荧光预处理的MSCs、胶原凝胶复合MSCs分别肝脏多点注入ALF小鼠的肝脏,进行小动物活体成像检测,探究MSCs在肝脏中定植情况。将105只C57BL/6小鼠随机分为5组:(1)对照组(生理盐水);(2)D-Gal+PBS组;(3)D-Gal+胶原凝胶组;(4)D-Gal+MSCs组;(5)D-Gal+胶原凝胶-MSCs组。组(1)中的小鼠腹腔注射生理盐水,另外4组小鼠腹腔注射D-Gal,建立小鼠ALF模型。于造模12小时后,4组ALF小鼠分别肝脏多点注射200μLPBS、200μL胶原凝胶、1×10～6MSCs、包含1×10～6MSCs的胶原凝胶-MSCs,统计各组小鼠的生存率。检测各组小鼠的ALT、AST和炎症因子水平,Western bloting、组织病理学染色检测各组小鼠肝脏组织中肝细胞的增殖和凋亡水平。结果:扫描电镜发现胶原凝胶与MSCs具有较好的相容性,小动物活体成像检测发现几乎所有信号均集中于肝脏,脾脏位置无信号,胶原凝胶复合MSCs移植的信号强于单独MSCs移植的ALF小鼠。经D-Gal处理后,小鼠血清中AST和ALT水平显著增高,并且在给药后第3天达到峰值。肝功能指标在D-Gal+胶原凝胶-MSCs组和D-Gal+MSCs组的小鼠明显优于D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组(P<0.05),D-Gal+胶原凝胶-MSCs组比较D-Gal+MSCs组有明显改善(P<0.05)。HE染色提示D-Gal+胶原凝胶-MSCs组和D-Gal+MSCs组的肝脏损伤程度轻于D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组,D-Gal+胶原凝胶-MSCs组轻于D-Gal+MSCs组。D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组小鼠3天生存率不足15%,两组之间无显著差异,MSCs治疗组小鼠7天生存率为44%,而胶原凝胶复合MSCs治疗组小鼠生存率相比较单纯MSCs治疗组显著提高(7天生存率76%)。Western Bloting和免疫组化均显示D-Gal+胶原凝胶-MSCs组肝细胞增殖率明显优于D-Gal+MSCs组、D-Gal+PBS组及D-Gal+胶原凝胶组,同时,肝细胞凋亡明显低于D-Gal+MSCs组,相应的肝脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、i NOS和CCL2等炎性因子水平D-Gal+胶原凝胶-MSCs也低于D-Gal+MSCs组。进一步的研究发现,D-Gal+胶原凝胶-MSCs通过激活PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用。实验表明,尽管胶原凝胶本身对ALF无治疗作用,但胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,并能对小鼠ALF产生更好的治疗效果,本研究的顺利进行,为解决MSCs移植治疗ALF提供了新的思路。结论:(1)胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,从而更有效的减轻小鼠ALF;(2)胶原凝胶复合MSCs可通过抑制细胞凋亡,促进细胞增殖来减轻肝损伤;(3)移植胶原凝胶复合MSCs调控PI3K/AKT信号通路改善肝细胞功能。

关键词： 股骨头坏死   髓芯减压   骨髓间充质干细胞   病理学变化  

摘要： 目的研究髓芯减压联合骨髓间充质干细胞对兔早期股骨头坏死的治疗作用。方法将48只新西兰白兔分为4组:空白组、模型组、髓芯减压组、髓芯减压联合骨髓间充质干细胞组。用液氮法构建兔股骨头坏死模型。运用病理学检测各组治疗情况,检测空骨陷窝率、骨小梁面积比、脂肪细胞平均直径。结果成功获得骨髓间充质干细胞,兔股骨头坏死模型构建成功。髓芯减压联合骨髓间充质干细胞治疗效果优于髓芯减压组,其治疗效果接近空白组。与模型组相比,治疗组(髓芯减压组和髓芯减压联合骨髓间充质干细胞组)的骨小梁面积比、脂肪细胞平均直径和空骨陷窝率差异有统计学意义(P<0.05),治疗有明显效果。其中髓芯减压联合骨髓间充质干细胞组的骨小梁面积比、脂肪细胞平均直径和空骨陷窝率分别是52.3%±3.5%、(35.1±3.6)μm和12.8%±2.5%。结论髓芯减压联合骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死具有显著疗效。