关键词： 椎间盘   腺病毒   胰岛素样生长因子-I   基因治疗  

摘要： 下腰痛(1ow back pain,LBP)是脊柱外科的常见病、多发病.资料表明:美国人一生中发生下腰疼的概率为60％~80%,在成人丧失劳动能力的原因中,下腰痛位居第三位.椎间盘退变(intervertebral disk degeneration,IVDD)为LBP的主要病因.现今临床上对于IVDD引起的LBP多先采用保守治疗,对于通过正规保守治疗症状不能缓解的患者,采用手术治疗.应用最广泛的手术是椎间盘切除或/和脊柱融合术,可经各种手术入路(前路、后路、侧方入路及联合手术入路)及使用多种方法(自体骨、异体骨移植术、各种Cage和多种内固定器械的应用)手术治疗.近年来,这两类手术技术取得了长足的进步,微创外科技术的应用使创伤越来越小且确实、有效地缓解了症状.但是,减压术后必然导致椎间关节结构、形态、功能异常和不稳定,融合术后亦加速邻近节段的退变,远期优良率在70%左右,疗效并不理想.原因在于减压和融合的治疗方法不能恢复和保持椎间关节的正常结构与生理功能,不能减缓IVDD的进程.它们是一种IVDD发展到后期引起严重LBP的对证治疗方法.为了寻找一种IVDD的理想治疗方法,近年来,学者们提出了椎间关节成形术.椎间关节成形术包括椎间盘置换术和椎间盘再生.椎间盘置换术已进入临床试用阶段,近期效果尚可,远期效果尚需要进一步随访.采用导入生长因子基因和/或炎症因子拮抗剂基因逆转或延缓IVDD的椎间盘再生成为近年实验研究的热点.人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor,hIGF-Ⅰ)是一种由70个氨基酸组成的多肽,Mr=7.6×10<'3>,其结构与胰岛素同源,受生长激素调节.文献报道hIGF-Ⅰ生长因子在椎间盘中的作用有:①促进聚集蛋白多糖(aggrecan)合成,减慢aggrecan的降解,抑制基质金属蛋白酶表达.②逆转体外培养的椎间盘细胞调亡.③促进合成Ⅱ型胶原蛋白.探讨hIGF-Ⅰ基因是否能逆转或延缓IVDD,该研究制作新西兰大白兔IVDD模型,构建携带hIGF-Ⅰ目的基因的腺病毒载体(Ad/CMV-hIGF-Ⅰ),体外检测其生物学活性,体内转染IVDD退变的椎间盘细胞进行hIGF-Ⅰ基因治疗.

关键词： 椎间盘退变   生物学治疗   基因治疗   组织工程  

摘要： 椎间盘退变是脊柱疾患的常见原因之一,生物学治疗为从根本上治疗椎间盘退变性疾病带来了希望。本文综述了近年来这方面的最新研究进展。

关键词： 转化生长因子β1   椎间盘退变   基因治疗   蛋白多糖   椎间盘突出   白细胞介素-8  

摘要： 椎间盘退变是影响人类健康的常见病.研究表明,髓核内高浓度蛋白多糖所产生的膨胀压有助于保持椎间盘的高度及其负载能力[1].髓核内蛋白多糖合成减少,分解增加,导致髓核脱水,是椎间盘退变的主要原因[2].椎间盘组织再生能力非常有限,所以,一旦发生椎间盘退变,就很难阻止或逆转这一过程.

关键词： 腰椎   推间盘   兔   退变   胰岛素样生长因子-1   基因  

摘要： 研究背景：DDD是骨科医生几乎每天都要面对的临床问题，其发生与DD密切相关。DD的原因多认与椎间盘细胞的生物学特性和营养供应障碍有关。如果能调节椎间盘细胞的生物学特性，促进退变椎间盘的髓核和纤维环细胞分裂增殖，再生髓核内的蛋白多糖和纤维环内的胶原，就有可能阻止DD发展，保持或恢复椎间盘的生理机能。研究发现，生长因子在发育、成熟及退变的椎间盘组织中，对椎间盘细胞的生物学表现具有一定的调节作用。施加生长因子于椎间盘细胞，能促进细胞增殖和蛋白多糖合成，显示应用生长因子或通过促进生长因子在椎间盘内表达，诱导其细胞再生和基质合成，有可能阻止或者逆转DD。由于反复或者持续椎间盘内给入生长因子施行困难，存在感染等并发症风险，有作者以腺病毒为载体，将生长因子基因转染到成年兔髓核组织内，观察到髓核细胞合成生长因子和蛋白多糖的量均有增加，持续可达12w，显示腺病毒载体可以向椎间盘组织转移对其细胞具有治疗作用的生长因子基因，具有一次性使用效应持久、安全及副作用少的优点。因此，基因疗法很有希望成为治疗早期DDD的有效手段，改变传统治疗方法被动滞后的局面。但与正常椎间盘不同，退变椎间盘的细胞数量少，功能不活跃，二者细胞的生物学特性并不一致，而前述实验结果均来自正常椎间盘组织，退变椎间盘的细胞能否被转染，如能转染，转染的效率、生长因子的表达水平及治疗效果如何，均还是未知。如生长因子基因也能转染至退变椎间盘，促进其细胞增殖及基质合成，恢复水和蛋白多糖的含量，从而延缓DD进程，则转基因技术成为预防和早期治疗DDD方法的可行性，又前进了一步。 目的：□造成兔腰椎椎间失稳，诱导DD乃至DDD发生，以摸索运用基因治疗干预DD的具体时机，为进一步研究准备实验对象；□掌握椎间盘细胞的取材与培养技术，了解培养的椎间盘细胞的生物学特性及施加IGF-1对髓核细胞增殖和蛋白多糖合成的影响，为进一步在体内应用IGF-1修复退变椎间盘提供实验依据，并探讨髓核细胞作为髓核组织工程种子细胞的可行性；□将携带入IGF-1基因的腺病毒载体注入兔退变椎间盘，观察生长因子基因能否被转染，转染的效率及表达水平如何，能否促进细胞外基质合成，有无治疗效果，以验证基因治疗对在体退变椎间盘的作用和疗效。 材料与方法:匕选用新西兰兔27只，随机分为手术组15只、对照 组12只，手术组沿玩、棘突作后止中切口，剥离低棘肌和关节突附丽肌 肉，切除棘上、棘间韧带及关节突关协外后l龙;对照组作相同皮肤切口 即缝合，分别于术后2、4、sm对腰椎行X线、MRI、骨密度和组织学检 查，对X线、M叹l和骨密度检查结果作计量分析，组织学检查行H五、 ***、Masson染色。巴选用Zm龄新西兰兔，处死后取出腰段脊柱和 膝关节半月板，分别取髓核、纤维环和半月板软骨细胞，用含lo%FBS 的nM曰四F】2培养基培养，在倒置显微镜下观察二种细胞的生长情况， 行细胞计数，绘制生长曲线;将IGF一1以不同浓度(0 .Ingjml、1，ong/m!、 10码/ml)作川于原代培养的储核细胞，以MTr、355掺入法观察细胞增 殖及蛋白多糖合成情况:将第2代髓核细胞与脱钙骨材料复合培养48h， 用扫描电镜观察髓核细胞的生长情况。口选用新西兰兔40只，同前法造 成免腰椎椎间失稳，除外感染和恶病质4只，将其余兔随机分为腺病毒转 基因组场只、生长因子组8只、PBS对照组12只，于术后4m经前方或 侧方入路二次手术，显露L、椎间盘，各组分别拄入带人IGF一1基因的重 组腺病毒载体(1内Fu)、价卜1(2鸿)和PBs，于术后1、2、4、8周 行生化和组织学检查，生化检查按Bitl劝r法测定髓核组织中的蛋白多糖含 量，组织学检查行王正、AB于AS、M此SOn及抗人K冷 .1、抗胶原11免疫 组化SABC法染色。 结果:巴术后2至如，对照组腰椎未见异常，手术组L、节段则出 现一系列异常表现。术后2功，椎间盘健核组织几像信号强度明显减低; 术后4m，腰椎旱后凸畸形，椎体楔形样变，骨密度减低，软骨终板钙化 增多，髓核几像信号进一步减低，有后突倾向，光镜下见髓核皱缩、裂 变，细胞数最减少，酸性粘多糖减少，纤维环胶原变

关键词： 基因治疗   脊柱融合   椎间盘退变   脊髓损伤   治疗  

摘要： 分子生物学的发展使基因治疗在医学的各个领域开始了探索性的研究。应用于脊柱脊髓疾病的基础研究主要在脊柱融合、椎间盘退变和再生、小关节疾患、脊髓损伤等方面,具有广阔的发展前景。

关键词： 椎间盘退变   基因治疗   腺病毒载体   Ad/CMV-hTGF-β1   髓核细胞   体内   转染   表达   生物学效应   蛋白多糖  

摘要： 目的：1)以腺病毒做载体转染外源性hTGF-β1治疗性基因(Ad／CMV-hTGF-β1)到兔椎间盘髓核组织；2)观察外源性hTGF-β1基因在兔体内的表达并对其生物学效应进行测定。 材料和方法：1)采用本实验室构建的腺病毒为载体的Ad／CMV-hTGF-β1 20微升(6×10～6 pfu)注射于纯种成年新西兰大白兔腰椎间盘髓核内并设自身对照及磷酸盐缓冲液(PBS)实验对照组；2)手术后4天、1周、2周、4周分别取出椎间盘用免疫组织化学方法对转染的椎间盘髓核细胞及对照组进行基因表达产物测定；用VIDAS图象分析系统进行半定量观察。3)用间苯三酚分光光度法测定不同时间段椎间盘髓核组织中蛋白多糖量的变化。 结果：免疫组织化学染色显示注射Ad／CMV-hTGF-β1椎间盘，4天组可见髓核细胞内呈现阳性染色颗粒；1周组即显示强阳性染色，持续至4周组。实验对照组及自身椎间盘对照组呈阴性或极弱的阳性反应。髓核组织内蛋白多糖含量自1周组开始到4周，实验组较对照组增高，统计学显示差异有显著性。 结论：1)腺病毒为载体的Ad／CMV-hTGF-β1转染兔椎间盘髓核细胞能有效表达TGF-β1蛋白。2)腺病毒载体Ad／CMV-hTGF-β1转染兔稚间盘髓核细胞后，TGF-β1的表达能引起髓核组 织中蛋白多糖含量的增加。3）本研究显示腺病毒介导的外源性 治疗性生长因子基因转染适合子椎间盘髓核靶细胞内的导入， 因此对基困治疗用于椎间盘退变的逆转提供了一定的实验依据 及临床应用前景。

关键词： TGF-β   髓核   蛋白多糖   Ⅱ型胶原   椎间盘退变   重组腺病毒   基因治疗  

摘要： 我们通过PCR从pcDNA3.1（+）-TGFβ<,1>质粒中大量扩增了TGFβ<,1>基因片段.运用同源重组的方法构建了携带人TGFβ<,1>基因的重组腺病毒载体（Ad/CMV-h TGFβ<,1>）尝试性地培养了兔腰椎间盘髓核细胞,同时观察细胞的演变,探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素,并用脂质体将绿色荧光蛋白（EGFP）基因导入兔髓核细胞内,观察基因的表达情况.在兔髓核细胞培养成功的基础上,我们又进行了人退变椎间盘髓核细胞的原代培养,并获得了成功,希望以体外原代培养的细胞模拟在体内的退变情形.另外,我们将Ad/CMV-hTGFβ<,1>转染至人退变的髓核细胞中,用免疫组化染色观察TGFβ<,1>的表达及其对髓核细胞Ⅱ型胶原合成的调控作用.在体研究中,我们将Ad/CMV-hTGFβ<,1>,生理盐水及Ad/CMV-LacZ分别注入兔椎间盘髓核组织中,于注射后10天、20天用免疫组化定性检测TGFβ<,1>的表达,于注射后10天、20天、45天分别用ELISA定量检测TGFβ<,1>在髓核组织中的含量,称取髓核组织的重量及用放免法检测透明质酸的变化情况.在TGFβ<,1>基因调节Ⅱ型胶原含量的在体研究中,我们将Ad/CMV-hTGFβ<,1>和生理盐水分别注入兔椎间盘髓核组织中,于注射后10天、20天分别用免疫组化定性及用ELISA定量检测Ⅱ型胶原的变化.通过以上实验我们成功构建了TGFβ<,1>基因的重组腺病毒载体,在国内首次进行了人退变椎间盘细胞的原代培养并获得了成功.

关键词： TGF-β1   髓核   蛋白多糖   Ⅱ型胶原   椎间盘退变   重组腺病毒   基因治疗  

摘要： 椎间盘退变、突出的发病率相当高，这一点已是不争的事实。最新的椎间盘生理、生化及病理研究证明：椎间盘的含水量的保持主要依赖其基质中蛋白多糖的含量，Ⅱ型胶原则在椎间盘承受压力方面发挥关键作用。内因、外因及遗传方面的诸多因素导致椎间盘逐步退变后，其实质就是基质中蛋白多糖的减少，含水量降低，Ⅰ型胶原出现在基质中，Ⅰ、Ⅱ型胶原的比例明显上升，髓核呈纤维样改变，导致椎间盘的膨胀压降低，承重能力下降，椎间高度降低，椎间盘承受的重力不能平均地向各方向传递，致使纤维环疲劳、破裂、髓核突出，造成脊髓或马尾神经受压，引起严重后果。 针对椎间盘退变、突出，传统的治疗方法有两大类：一是非手术疗法；二是手术切除病灶。非手术疗法是以缓解症状为主，依靠的是患者的自我调节和修复能力，而椎间盘是一个血供十分差的组织，尤其是在髓核内，根本就没有血液供应，其营养及氧的获得主要靠被动扩散，细胞活力相当差，所以，椎间盘的自我修复能力十分有限，这就是经非手术疗法缓解的病人，常常复发的原因，其中部分病人不得不转而行手术治疗。手术疗法虽然能解除脊髓的致压物，但是，它一方面增加了病人的痛苦，另一方面又以牺牲病人脊柱的生理完整性为代价。 是否有一种方法既能从根本上阻止甚至逆转椎间盘的退变进程又能保持脊柱的生理完整性，同时将病人所承受的痛苦减到最低呢? 在体外实验中，转化生长因子β1（TGF-β1）能促进髓核细胞产生蛋白多糖，同时能对Ⅱ型胶原起调节作用。在此基础上我们进行了一些探索性的研究。我们通过PCR从pcDNA3.1（+）-TGFβ1质粒中大量扩增了TGF-β1基因片段。运用同源重组的方法构建了携带人TGF-β1基因的重组腺病毒载体（Ad／CMV-h TGFβ1）尝试性地培养了兔腰椎间盘髓核细胞，同时观察细胞的演变，探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素，并用脂质体将绿色荧光蛋白（EGFP）基因导入兔髓核细胞内，观察基因的表达情况。结果为：原代细胞生物学性状最接近体内细胞，传代后细胞呈现衰老现象。活力测定提示，随着培养时间的延长及传代，细胞活力逐渐降低。髓核细胞内细胞器的变化与其生物学活性变化相一致。在用脂质体将绿色荧光蛋白基因导入髓核细胞后，细胞在24小时后即可发出绿色荧光，并能持续发光3个月，直至细胞死亡。兔髓核细胞培养的成功，建立了体外髓核细胞培养的模型，绿色荧光蛋白在髓核细胞内的成功表达，说明髓核细胞适合表达外源性的基因，为将治疗性基因导入髓核细胞从而产生治疗效果的后续实验奠定了基础。 在兔髓核细胞培养成功的基础上，我们又进行了人退变椎间盘髓核细胞的原代 第二军医大学博士学位论文 培养，并获得了成功，希望以体外原代培养的细胞模拟在体内的退变情形。另外， 我们将Ad／Cy十TGF p；转染至人退变的髓核细胞中，用免疫组化染色观察TGF－p ；的表达及其对髓核细胞＊型胶原合成的调控作用。结果表明：TGF－P；在髓核细 胞内得到了大量的表达，实验组TGF－i；免疫组化结果呈强阳性，而对照组只显示 弱阳性。11型胶原免疫组化染色结果显示：实验组染色为强阳性，而对照组只显示 了很弱的阳性，说明人退变髓核细胞不仅能大量表达外源性的TGF－p；编码基因， 还能在基因产物的作用下增加11型胶原合成的能力。 在体研究中，我们将＊／CMV－hTGF i；，生理盐水及＊／CM’M－LaCZ分别注入兔椎 间盘髓核组织中，于注射后 10天、20天用免疫组化定性检测 TGF－p；的表达，于 注射后10天、20天、45天分别用ELISA定量检测TGF寸；在髓核组织中的含量， 称取髓核组织的重量及用放免法检测透明质酸的变化情况。结果显示：注射了 Ad／CM’e－hTGF i；的髓核组织，不管是 10天组还是 20天组，都显示了广泛而强烈的

关键词： 腰椎间盘退变   hTGF-β1   基因疗法  

关键词： Biochemistry  

摘要： Asporin, a novel member of the leucine-rich repeat family of proteins, was partially purified from human articular cartilage and meniscus. Cloning of human and mouse asporin cDNAs revealed that the protein is closely related to decorin and biglycan. It contains a putative propeptide, 4 amino-terminal cysteines, 10 leucine-rich repeats, and 2 C-terminal cysteines. In contrast to decorin and biglycan, asporin is not a proteoglycan. Instead, asporin contains a unique stretch of aspartic acid residues in its amino-terminal region. A polymorphism was identified in that the number of consecutive aspartate residues varied from 11 to 15. The 8 exons of the human asporin gene span 26 kilobases on chromosome 9q31.1-32, and the putative promoter region lacks TATA consensus sequences. The asporin mRNA is expressed in a variety of human tissues with higher levels in osteoarthritic articular cartilage, aorta, uterus, heart, and liver. The deduced amino acid sequence of asporin was confirmed by mass spectrometry of the isolated protein resulting in 84% sequence coverage. The protein contains an N-glycosylation site at Asn(281) with a heterogeneous oligosaccharide structure and a potential O-glycosylation site at Ser(54). The name asporin reflects the aspartate-rich amino terminus and the overall similarity to decorin.