关键词： 基因治疗   脊柱融合   椎间盘退变   脊髓损伤   治疗  

摘要： 分子生物学的发展使基因治疗在医学的各个领域开始了探索性的研究。应用于脊柱脊髓疾病的基础研究主要在脊柱融合、椎间盘退变和再生、小关节疾患、脊髓损伤等方面,具有广阔的发展前景。

关键词： TGF-β   髓核   蛋白多糖   Ⅱ型胶原   椎间盘退变   重组腺病毒   基因治疗  

摘要： 我们通过PCR从pcDNA3.1（+）-TGFβ<,1>质粒中大量扩增了TGFβ<,1>基因片段.运用同源重组的方法构建了携带人TGFβ<,1>基因的重组腺病毒载体（Ad/CMV-h TGFβ<,1>）尝试性地培养了兔腰椎间盘髓核细胞,同时观察细胞的演变,探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素,并用脂质体将绿色荧光蛋白（EGFP）基因导入兔髓核细胞内,观察基因的表达情况.在兔髓核细胞培养成功的基础上,我们又进行了人退变椎间盘髓核细胞的原代培养,并获得了成功,希望以体外原代培养的细胞模拟在体内的退变情形.另外,我们将Ad/CMV-hTGFβ<,1>转染至人退变的髓核细胞中,用免疫组化染色观察TGFβ<,1>的表达及其对髓核细胞Ⅱ型胶原合成的调控作用.在体研究中,我们将Ad/CMV-hTGFβ<,1>,生理盐水及Ad/CMV-LacZ分别注入兔椎间盘髓核组织中,于注射后10天、20天用免疫组化定性检测TGFβ<,1>的表达,于注射后10天、20天、45天分别用ELISA定量检测TGFβ<,1>在髓核组织中的含量,称取髓核组织的重量及用放免法检测透明质酸的变化情况.在TGFβ<,1>基因调节Ⅱ型胶原含量的在体研究中,我们将Ad/CMV-hTGFβ<,1>和生理盐水分别注入兔椎间盘髓核组织中,于注射后10天、20天分别用免疫组化定性及用ELISA定量检测Ⅱ型胶原的变化.通过以上实验我们成功构建了TGFβ<,1>基因的重组腺病毒载体,在国内首次进行了人退变椎间盘细胞的原代培养并获得了成功.

关键词： 椎间盘退变   基因治疗   腺病毒载体   Ad/CMV-hTGF-β1   髓核细胞   体内   转染   表达   生物学效应   蛋白多糖  

摘要： 目的：1)以腺病毒做载体转染外源性hTGF-β1治疗性基因(Ad／CMV-hTGF-β1)到兔椎间盘髓核组织；2)观察外源性hTGF-β1基因在兔体内的表达并对其生物学效应进行测定。 材料和方法：1)采用本实验室构建的腺病毒为载体的Ad／CMV-hTGF-β1 20微升(6×10～6 pfu)注射于纯种成年新西兰大白兔腰椎间盘髓核内并设自身对照及磷酸盐缓冲液(PBS)实验对照组；2)手术后4天、1周、2周、4周分别取出椎间盘用免疫组织化学方法对转染的椎间盘髓核细胞及对照组进行基因表达产物测定；用VIDAS图象分析系统进行半定量观察。3)用间苯三酚分光光度法测定不同时间段椎间盘髓核组织中蛋白多糖量的变化。 结果：免疫组织化学染色显示注射Ad／CMV-hTGF-β1椎间盘，4天组可见髓核细胞内呈现阳性染色颗粒；1周组即显示强阳性染色，持续至4周组。实验对照组及自身椎间盘对照组呈阴性或极弱的阳性反应。髓核组织内蛋白多糖含量自1周组开始到4周，实验组较对照组增高，统计学显示差异有显著性。 结论：1)腺病毒为载体的Ad／CMV-hTGF-β1转染兔椎间盘髓核细胞能有效表达TGF-β1蛋白。2)腺病毒载体Ad／CMV-hTGF-β1转染兔稚间盘髓核细胞后，TGF-β1的表达能引起髓核组 织中蛋白多糖含量的增加。3）本研究显示腺病毒介导的外源性 治疗性生长因子基因转染适合子椎间盘髓核靶细胞内的导入， 因此对基困治疗用于椎间盘退变的逆转提供了一定的实验依据 及临床应用前景。

关键词： TGF-β1   髓核   蛋白多糖   Ⅱ型胶原   椎间盘退变   重组腺病毒   基因治疗  

摘要： 椎间盘退变、突出的发病率相当高，这一点已是不争的事实。最新的椎间盘生理、生化及病理研究证明：椎间盘的含水量的保持主要依赖其基质中蛋白多糖的含量，Ⅱ型胶原则在椎间盘承受压力方面发挥关键作用。内因、外因及遗传方面的诸多因素导致椎间盘逐步退变后，其实质就是基质中蛋白多糖的减少，含水量降低，Ⅰ型胶原出现在基质中，Ⅰ、Ⅱ型胶原的比例明显上升，髓核呈纤维样改变，导致椎间盘的膨胀压降低，承重能力下降，椎间高度降低，椎间盘承受的重力不能平均地向各方向传递，致使纤维环疲劳、破裂、髓核突出，造成脊髓或马尾神经受压，引起严重后果。 针对椎间盘退变、突出，传统的治疗方法有两大类：一是非手术疗法;二是手术切除病灶。非手术疗法是以缓解症状为主，依靠的是患者的自我调节和修复能力，而椎间盘是一个血供十分差的组织，尤其是在髓核内，根本就没有血液供应，其营养及氧的获得主要靠被动扩散，细胞活力相当差，所以，椎间盘的自我修复能力十分有限，这就是经非手术疗法缓解的病人，常常复发的原因，其中部分病人不得不转而行手术治疗。手术疗法虽然能解除脊髓的致压物，但是，它一方面增加了病人的痛苦，另一方面又以牺牲病人脊柱的生理完整性为代价。 是否有一种方法既能从根本上阻止甚至逆转椎间盘的退变进程又能保持脊柱的生理完整性，同时将病人所承受的痛苦减到最低呢? 在体外实验中，转化生长因子β(TGF-β)能促进髓核细胞产生蛋白多糖，同时能对Ⅱ型胶原起调节作用。在此基础上我们进行了一些探索性的研究。我们通过PCR从pcDNA3.1(+)-TGFβ质粒中大量扩增了TGF-β基因片段。运用同源重组的方法构建了携带人TGF-β基因的重组腺病毒载体(Ad／CMV-h TGFβ)尝试性地培养了兔腰椎间盘髓核细胞，同时观察细胞的演变，探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素，并用脂质体将绿色荧光蛋白(EGFP)基因导入兔髓核细胞内，观察基因的表达情况。结果为：原代细胞生物学性状最接近体内细胞，传代后细胞呈现衰老现象。活力测定提示，随着培养时间的延长及传代，细胞活力逐渐降低。髓核细胞内细胞器的变化与其生物学活性变化相一致。在用脂质体将绿色荧光蛋白基因导入髓核细胞后，细胞在24小时后即可发出绿色荧光，并能持续发光3个月，直至细胞死亡。兔髓核细胞培养的成功，建立了体外髓核细胞培养的模型，绿色荧光蛋白在髓核细胞内的成功表达，说明髓核细胞适合表达外源性的基因，为将治疗性基因导入髓核细胞从而产生治疗效果的后续实验奠定了基础。 在兔髓核细胞培养成功的基础上，我们又进行了人退变椎间盘髓核细胞的原代 第二军医大学博士学位论文 培养，并获得了成功，希望以体外原代培养的细胞模拟在体内的退变情形。另外， 我们将Ad／Cy十TGF p;转染至人退变的髓核细胞中，用免疫组化染色观察TGF－p;的表达及其对髓核细胞＊型胶原合成的调控作用。结果表明：TGF－P;在髓核细 胞内得到了大量的表达，实验组TGF－i;免疫组化结果呈强阳性，而对照组只显示 弱阳性。11型胶原免疫组化染色结果显示：实验组染色为强阳性，而对照组只显示 了很弱的阳性，说明人退变髓核细胞不仅能大量表达外源性的TGF－p;编码基因， 还能在基因产物的作用下增加11型胶原合成的能力。 在体研究中，我们将＊／CMV－hTGF i;，生理盐水及＊／CM’M－LaCZ分别注入兔椎 间盘髓核组织中，于注射后 10天、20天用免疫组化定性检测 TGF－p;的表达，于 注射后10天、20天、45天分别用ELISA定量检测TGF寸;在髓核组织中的含量， 称取髓核组织的重量及用放免法检测透明质酸的变化情况。结果显示：注射了 Ad／CM’e－hTGF i;的髓核组织，不管是 10天组还是 20天组，都显示了广泛而强烈的 免疫组化阳性染色结果，而注射生理盐水或Ad／CMV－LacZ的髓核组织仅显示了很弱 的阳性染色。TGF－pl的ELISA定量检测结果显示：Ad／CWi－hTGFpl组中10天。 20天、45天组的TGF一p;产量分别是对照组的3倍、2．6倍及2倍(P＜0．01)。注 射了Ad／CM’M－hTGF pl的髓核组织的重量分别为对照

关键词： 腰椎间盘退变   hTGF-β1   基因疗法  

关键词： Biochemistry  

摘要： Asporin, a novel member of the leucine-rich repeat family of proteins, was partially purified from human articular cartilage and meniscus. Cloning of human and mouse asporin cDNAs revealed that the protein is closely related to decorin and biglycan. It contains a putative propeptide, 4 amino-terminal cysteines, 10 leucine-rich repeats, and 2 C-terminal cysteines. In contrast to decorin and biglycan, asporin is not a proteoglycan. Instead, asporin contains a unique stretch of aspartic acid residues in its amino-terminal region. A polymorphism was identified in that the number of consecutive aspartate residues varied from 11 to 15. The 8 exons of the human asporin gene span 26 kilobases on chromosome 9q31.1-32, and the putative promoter region lacks TATA consensus sequences. The asporin mRNA is expressed in a variety of human tissues with higher levels in osteoarthritic articular cartilage, aorta, uterus, heart, and liver. The deduced amino acid sequence of asporin was confirmed by mass spectrometry of the isolated protein resulting in 84% sequence coverage. The protein contains an N-glycosylation site at Asn(281) with a heterogeneous oligosaccharide structure and a potential O-glycosylation site at Ser(54). The name asporin reflects the aspartate-rich amino terminus and the overall similarity to decorin.

关键词： Biochemistry  

摘要： We have discovered a new member of the class I small leucine-rich repeat proteoglycan (SLRP) family which is distinct from the other class I SLRPs since it possesses a unique stretch of aspartate residues at its N terminus. For this reason, we called the molecule asporin. The deduced amino acid sequence is about 50% identical (and 70% similar) to decorin and biglycan. However, asporin does not contain a serine/glycine dipeptide sequence required for the assembly of O-linked glycosaminoglycans and is probably not a proteoglycan. The tissue expression of asporin partially overlaps with the expression of decorin and biglycan. During mouse embryonic development, asporin mRNA expression was detected primarily in the skeleton and other specialized connective tissues;very little asporin message was detected in the major parenchymal organs. The mouse asporin gene structure is similar to that of biglycan and decorin with 8 exons. The asporin gene is localized to human chromosome 9q22-9q21.3 where asporin is part of a SLRP gene cluster that includes extracellular matrix protein 2, osteoadherin, and osteoglycin. Further analysis shows that, with the exception of biglycan, all known SLRP genes reside in three gene clusters.

关键词： 椎间盘退变   基因治疗   重组腺病毒   载体   同源重组  

摘要： 目的:构建一个高效的腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1,为进一步研究椎间盘退变的基因治疗准备.材料和方法:该研究采用了在原核细胞中同源重组的构建方法.首先将hTGFβ1全长cDNA用HidIII和XhoI双酶切,克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上,得到重组体pShuttleCMV-hTGFβ1用PmeI酶切线性化后与腺病毒主干质粒pAdEasy1(去除了E1和E3区)电穿孔法共转染大肠杆菌(BJ5183),两者在BJ5183内进行同源重组获得重组质粒Ad/CMV-hTGFβ1.重组质粒脂质体转染293细胞,在293细胞中包装成完整的腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1.结论:腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1构建成功为进一步的研究椎间盘退变的基因治疗打下了基础.