关键词： 脏腑推拿   肥胖   肠道菌群   氨基酸代谢   肠屏障   慢性炎症  

摘要： 目的: 肥胖逐渐成为广泛的公共健康问题,肥胖慢性低度炎症可导致2型糖尿病、血脂异常、心血管疾病和癌症等疾病的发生,越来越多的研究表明肠道微生物菌群、肠屏障功能与肥胖慢性炎症的发生发展密切相关。本研究通过临床试验观察脏腑推拿对肥胖患者炎症状态的影响,通过动物实验进一步探讨脏腑推拿中振腹法干预肥胖慢性炎症状态的效应机制,从血清和肠组织炎性因子水平、肠屏障相关蛋白及mRNA表达情况、肠道菌群氨基酸代谢及其与炎症状态关联分析探究其可能的作用靶点,以期为脏腑推拿治疗肥胖提供更多科学依据。 方法: 1脏腑推拿对肥胖患者炎症状态影响的研究:临床研究采用随机对照方法,将符合纳入标准的72例肥胖患者,随机分为治疗组(脏腑推拿结合生活方式干预)和对照组(生活方式干预),推拿共治疗4周,每周5次,观察两组患者治疗前和治疗4周后相关指标变化,包括体成分分析、糖脂代谢指标、血清炎症因子以及中医证候积分,并进行疗效评定。以BW、BMI、WC作为主要结局指标,其他作为次要指标来评价脏腑推拿治疗肥胖的临床效应。 2振腹法对肥胖小鼠表型、糖脂代谢及炎症状态影响的研究:以C57BL/6J小鼠为研究对象,适应性喂养7天,随机选取10只作为空白组,其他采用高脂饲料(60%卡路里,Research diet No.12492)继续喂养8周建立肥胖小鼠模型,造模成功后各随机选取10只作为模型组和振腹组。空白组予普通饲料喂养不做任何处理,在治疗组进行干预时进行异氟烷轻度抑制,并进行抓握;模型组予高脂饲料继续喂养,其他干预方法同空白组;振腹法组予高脂饲料继续喂养,应用小动物振腹仪进行治疗,每次10min,每周5次,共治疗4周。干预4周后对小鼠体重、腹围、体脂以及脂肪和肝脏的湿重进行比较,对小鼠脂肪及肝脏进行HE染色,评价振腹治疗对小鼠的减重作用;检测小鼠血脂、血糖变化来评价振腹对小鼠糖脂代谢水平的影响;采用ELISA检测小鼠血清炎症因子TNF-α、IL-10、CRP及LPS水平以评价振腹对小鼠炎症状态的影响。 3振腹法改善肥胖小鼠肠屏障功能及其作用机制研究:造模方法和干预方法同上,干预4周结束后采用ELISA检测小鼠肠组织炎症因子TNF-α、IL-10及LPS含量;分别通过HE染色和免疫组化观察小鼠肠组织的形态学变化以及Occludin、Claudin-1、ZO-1的蛋白表达情况;通过Westernblot技术检测小鼠肠组织TLR4、NF-κB蛋白含量;通过RT-q PCR检测肠组织Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA表达水平,以及TLR4、NF-κBmRNA的表达情况。 4振腹法改善肥胖小鼠肠道菌群及其与炎症状态关联分析:造模方法和干预方法同上,通过宏基因测序技术检测各组小鼠肠道菌群丰度、菌群组成、菌群多样性、基因组成及功能等,对各组小鼠的显著差异菌种与其体重、腹围、内脏脂肪体积、血脂、炎症因子TNF-α、IL-10及LPS等进行关联分析。 5振腹法对肥胖小鼠粪便氨基酸代谢影响的研究:造模方法和干预方法同上,对小鼠粪便进行靶向氨基酸测定,分析差异氨基酸,并将氨基酸与差异菌种、炎症因子进行关联性分析,分析振腹法改善肥胖慢性炎症的潜在机制。 结果: 1脏腑推拿对肥胖患者炎症状态影响的研究:(1)体成分分析方面:治疗结束后两组患者的BW、BMI、WC、体脂肪、VFA等水平较治疗前明显下降(P<0.05);治疗组BW下降更多,BMI、WC、体脂肪、VFA明显低于对照组(P<0.05)。(2)糖脂代谢方面:两组患者治疗前后组内比较,都能够不同程度改善糖脂水平,治疗组在CHO、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、FINS、HOMA-IR方面均明显改善(P<0.05);组间比较治疗组在TG降低方面优于对照组(P<0.05),CHO、HDL-C、LDL-C组间对比无显著性差异(P>0.05),治疗组对机体血糖水平及胰岛素抵抗情况改善程度更大些。(3)血清炎症因子水平:两组患者治疗前后组内比较,TNF-α、hs-CRP、IL-10结果均存在显著性差异(P<0.05),表明两种治疗均可调节机体血清炎症水平;治疗后进行组间比较,治疗组更具优势,两组间有显著性差异(P<0.05)。(4)血清Zonulin水平:两组患者治疗前后组内比较,Zonulin在治疗后均下降(P<0.05),表明两种治疗均可降低机体血清Zonulin水平;治疗后进行组间比较,治疗组更具优势,两组间差异明显(P<0.05)。(5)中医证候积分方面:治疗后两组患者中医证候积分均较治疗前显著下降(P<0.05),且治疗组优于对照组(P<0.05),另外,治疗组在形体肥胖、肢倦怠乏力、脘腹痞闷、头身困重、大便溏薄等方面的疗效更明显(P<0.05),说明脏腑推拿在改善肥胖相关中医症状方面更具优势。(6)疗效方面:

关键词： 肾间质纤维化   微炎症状态   sPD-1   PD-1/PD-L1   MMPs  

摘要： 【研究背景】 肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis,RIF)是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)发展至终末期肾病(ESRD)的重要环节,主要表现进行性纤维化和肾小管萎缩。RIF伴随着大量炎症细胞浸润,并导致肾实质损伤。尽管这个问题非常严重,但目前诊断RIF依赖肾脏活检这一有创操作,且治疗选择很少。微炎症状态是导致肾纤维化的初始因素。活化的浸润性T细胞通过与肾小管上皮细胞(TECs)的直接相互作用在肾炎中发挥着至关重要的作用。程序性死亡受体-1(PD-1)及其配体(PD-L1)传递抑制信号,调节T细胞活化、耐受和免疫病理。PD-L1基因的表达已被证明是由炎症信号控制的,可通过大量炎症介质调节其作用和功能。因此,T细胞介导的慢性炎症状态在肾间质纤维化的进展中至关重要,而PD-1及其配体PD-L1作为T细胞共抑制和衰竭中起关键作用的分子通路,在RIF中的作用和机制尚不清楚。阐明微炎症状态下PD-1/PD-L1在肾间质纤维化中的作用及机制有望为探索RIF的分子靶向治疗提供新的理论依据。 【研究目的】 本研究将采用体内外实验探讨PD-1/PD-L1通路在肾间质纤维化发生及进展中的作用及机制。我们拟收集病理确诊为IgAN的患者病例资料及血清样本,检测血清可溶性PD-1(Soluble PD-1,sPD-1)水平并统计分析其与RIF的相关性。同时在体外培养肾小管上皮细胞系(HK-2)及T细胞来源的Jurkat细胞系(急性T淋巴细胞白血病细胞系)的共培养体系中探讨血清中sPD-1的来源,并研究在微炎症状态中多种细胞因子的刺激下基质金属蛋白酶(MMPs)对膜型PD-1(Membrane bound PD-1,m PD-1)的剪切作用。收集IgAN患者肾活检病理切片,并建立单侧输尿管梗阻(UUO)肾纤维化模型,从人体组织和动物模型上研究肾小管上皮细胞中的PD-L1与肾间质纤维化的相关性。另外,通过酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫组化、免疫荧光染色、细胞增殖刺激、慢病毒感染、Transwell共培养及数据统计分析等方法,从人体、动物、细胞及分子水平上研究PD-1/PD-L1信号通路影响肾间质纤维化进程的作用及分子机制,通过在UUO小鼠模型注射PD-L1融合蛋白探讨阻断血清sPD-1对RIF减轻或好转作用,以期能够为微炎症状态下RIF的分子机制提供新的思路,为肾间质纤维化的诊断治疗提供实验依据。 【研究方法】 第一部分:IgAN患者血清sPD-1促进肾间质纤维化 1.以IgA肾病(IgA Nephropathy,IgAN)患者为肾纤维化模型,收集病检确诊为IgAN患者血清及基线数据,用ELISA法检测其血清sPD-1水平,相关性分析探索sPD-1与RIF分级的关系。 2.通过logistic回归分析研究IgAN患者血清sPD-1与RIF的相关性。 3.对患者进行随访并收集数据,用COX回归分析探索sPD-1与肾功能下降的相关性。 4.通过免疫荧光染色分析RIF患者T细胞浸润及PD-1表达情况。 第二部分:RIF中sPD-1的来源与肾小管上皮细胞PD-L1表达特征的研究 1.体外培养Jurkat细胞系后加入不同的MMPs(以及去整合素和金属蛋白酶A Disintegrin and Metallo-proteinases,ADAMs)刺激,用ELISA法检测其上清sPD-1水平变化,筛选出能够剪切T细胞膜表面的膜型PD-1(m PD-1)的酶。 2.体外培养HK-2细胞系,用细胞因子刺激后收集上清液并检测MMP-2水平变化,再将活化MMP-2刺激Jurkat细胞培养24h后,与HK-2细胞在Transwell中共培养,收集上清及细胞蛋白分析sPD-1水平和细胞PD-L1的表达情况;同时构建sh RNA-MMP2慢病毒并感染HK-2细胞后与jurkat细胞Transwell共培养分析上清sPD-1水平和细胞PD-L1的表达情况。以上实验从多角度证实MMPs切割T细胞上m PD-1生成sPD-1。 3.将患者按照肾脏病理活检的肾间质纤维化程度进行分组,通过免疫组化将患者肾脏活检组织石蜡切片进行染色,探究PD-L1在患者肾小管上皮细胞上的表达情况,并分析组织细胞表达PD-L1与肾间质纤维化程度(病理分级)的相关性。 ***/c小鼠建立肾纤维化UUO(Unilateral ureteral occlusion)模型,通过H&E、Masson和免疫组化等方法探索UUO小鼠肾脏组织细胞PD-L1的表达与肾间质纤维化的关系。 5.体外细胞实验研究肾小管上皮细胞表达PD-L1与纤维化分子的相关性。

关键词： 猫杯状病毒   TLR2-NF-κB通路   NLRP3炎症小体   IL-1β   细胞焦亡  

摘要： 猫杯状病毒（Feline calicivirus,FCV）是猫科动物中常见的一种上呼吸道传染病病原,主要感染幼猫,感染后引起口腔溃疡、慢性口炎、鼻炎、眼结膜炎等临床症状。FCV呈全球流行,对宠物猫及老虎、猎豹、狮子等其他猫科动物的健康和保护造成了严重的威胁。口炎和上呼吸道炎症是FCV感染后最主要的临床表现,也是临床治疗的主要内容,提示炎症在FCV感染和致病过程中扮演着十分重要的角色。炎症是机体应对病原感染产生的一种先天性免疫应答反应,与病毒感染及其其致病机制密切相关。在致炎过程中,炎症小体至关重要,在抵抗病原微生物入侵和应对细胞损伤过程中发挥着重要的作用,对维持细胞内环境稳态具有重要意义。本研究通过体内和体外实验评价FCV感染对炎症应答的影响,筛选识别FCV感染的模式识别受体,以NLRP3炎症小体为切入点,以炎症小体激活IL-1β分泌的启动信号（第一信号）和激活信号（第二信号）为研究重点,通过体内和体外感染试验分析FCV感染、TLRs/My D88/NF-κB信号轴、NLRP3炎症小体活化组装、细胞焦亡、IL-1β释放与炎症反应的调控分子机制和逻辑关系。旨在揭示NLRP3炎症小体在FCV诱导宿主炎症反应中的作用和调控机制,从一个新的视角揭示FCV的致炎机制,为FCV抗炎药物设计和筛选提供新的药物靶点。 本研究共包含四部分研究内容,主要研究结果如下: 1、猫杯状病毒感染诱导炎症反应 为评价FCV感染对机体炎症应答的影响,使用FCV CH-JL2株感染试验猫,评价临床症状、局部组织及外周血炎症相关指标,发现FCV感染后引发口腔溃疡、上腭溃疡、眼结膜炎、鼻脓性分泌物等临床症状;诱导肺脏、脾脏与扁桃体内大量巨噬细胞、单核细胞浸润;诱导外周血与鼻腔分泌物中SAA、IL-1β、IL-6、TNF-α与MCP-1分泌量增加;引起组织中多种促炎细胞因子m RNA转录水平上调,并诱导IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达。然后,使用猫外周血单核巨噬细胞评价FCV感染对炎症因子的影响,发现FCV感染诱导IL-1β、IL-6、IL-18与TNF-α等促炎细胞因子基因转录、表达和分泌,并证明不同FCV毒株感染均可诱导促炎细胞因子分泌。结果表明,FCV体外和体内感染诱导促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1基因转录和分泌,激活炎症反应。 2、猫杯状病毒感染激活TLRs与NLRs受体分子类型的鉴定 为鉴定FCV感染后激活的TLRs与NLRs受体种类,通过体内和体外实验检测FCV感染后对TLRs与NLRs基因转录水平的影响,发现FCV感染诱导TLR2、TLR7与NLRP3基因转录水平上调。通过TLRs抑制试验和RNA干扰试验发现,抑制或沉默TLR2受体,显著降低FCV感染引起的IL-1β、IL-6与TNF-α转录和分泌水平,而TLR4受体对促炎细胞因子的转录与分泌无显著影响,通过过表达TLR2进一步证明FCV感染通过TLR2诱导IL-1β的基因转录与分泌。进一步分析NLRP3受体在FCV诱导IL-1β中的作用,发现抑制或沉默NLRP3、Caspase-1,对IL-1β基因转录无显著影响,但显著抑制了FCV诱导的IL-1β表达和分泌。结果表明,FCV体内和体外感染激活TLR2、TLR7与NLRP3受体基因转录,依赖TLR2受体诱导IL-1β基因转录,依赖NLRP3受体诱导IL-1β分泌。 3、猫杯状病毒衣壳蛋白通过TLR2/NF-κB通路激活IL-1β分泌第一信号 FCV感染激活TLR2受体,并依赖TLR2诱导IL-1β基因转录,为探索FCV激活TLR2诱导IL-1β分泌的机制,分析了FCV感染对TLR2/My D88/NF-κB信号轴的影响,通过阻断TLR2/My D88/NF-κB信号轴评价FCV感染诱导IL-1β基因转录与表达的影响,并分析了FCV激活TLR2的病毒成分。结果发现,FCV感染诱导TLR2、My D88蛋白表达,激活IκBα磷酸化降解IκB,诱导NF-κB（p65）磷酸化并诱导向细胞核转入;通过抑制或沉默TLR2、My D88发现,抑制或沉默TLR2/My D88后能够阻断FCV诱导IκBα磷酸化和NF-κB（p65）入核,证明FCV激活NF-κB依赖TLR2/My D88信号轴。通过抑制或沉默TLR2、My D88、NF-κB或IκBα磷酸化后,发现可以阻断FCV感染诱导的IL-1β基因转录、表达和分泌。然后,探讨了FCV激活TLR2的病毒成分,发现FCV病毒样颗粒（VLPs）可以通过TLR2/My D88/NF-κB信号通路诱导IL-1β基因转录,但不能诱导IL-1β分泌;通过双荧光素酶试验证明FCV编码的VP1蛋白通过TLR2/My D88/NF-κB信号轴诱导IL-1β基因转录,并证明FCV VP1

关键词： 全身免疫炎症指数   血管内治疗   预后   列线图  

摘要： 目的:探究全身免疫炎症指数(Systemic Immune-inflammation Index,SII)与接受血管内治疗的急性前循环缺血性卒中患者出院90天预后的相关性及预测价值,并构建一个针对接受血管内治疗的急性前循环缺血性卒中患者预后的列线图模型。 方法:回顾性收集2018年1月至2023年10月符合标准的桂林医学院附属医院神经内科的急性前循环缺血性卒中血管内治疗患者作为研究对象,总共248例。收集患者的临床数据及入院24小时内的血液样本检测数据,依据中性粒细胞、血小板和淋巴细胞的计数来计算SII值。通过改良Rankin量表(modified Rankin Scale,m RS)评估患者出院90天的预后情况,其中m RS≤2分定义为预后良好组,m RS>2分则定义为预后不良组。根据约登指数确定SII在受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)的最佳截断值,依据此值将研究对象分为低SII组和高SII组。采用卡方检验对低SII组、高SII组与患者不良预后进行相关性分析。通过单变量和多变量Logistic回归分析及lasso回归分析筛选出关键预测变量。将患者随机分配成两个独立的数据集:训练集占总样本的75%(n=186),和验证集25%(n=62)。基于此数据建立了一个预测患者出院后90天预后不良结局的列线图,同时采用C指数和决策曲线分析法来评价模型的预测效能。p<0.05表示差异具有统计学意义。 结果:(1)研究纳入的248例患者中,90天预后不良的患者为149例,总发生率为60.08%。(2)根据约登指数得出SII在ROC曲线中的最佳截断值为1585.589,具有69.1%的灵敏度和60.6%的特异度(AUC=0.6743611,95%置信区间0.6076-0.7411)。(3)低SII组与高SII组在不良预后发生率的差异具有统计学显著性(p<0.01),表明高SII水平对患者预后有影响。(4)单因素及多因素logistic回归分析出性别(OR=0.461,95%置信区间CI0.219-0.971,p<0.05)?SII(OR=3.062,95%置信区间CI 1.731-5.416,p<0.001)以及入院时NIHSS评分(OR=1.176,95%置信区间CI 1.083-1.277,p<0.001)为独立预测因子。(5)选取了入院时NIHSS评分、SII、性别、年龄这四个变量构建列线图,建立的Logistic回归模型的训练集C指数为0.752(95%CI:0.681-0.824),验证集C指数为0.712(95%CI:0.579-0.844)。(6)校准曲线及DCA决策曲线评估列线图模型具有一定的预测价值。 结论:(1)高SII水平与接受EVT的急性前循环缺血性卒中患者90天预后显著相关,并可作为预后不良的独立预测因素。(2)构建的列线图模型可为急性前循环缺血性卒中血管内治疗患者有效控制这些危险因素提供风险评估。

关键词： 人参皂苷Rd   LPS   白细胞介素6   认知障碍   线粒体   C57BL/6J小鼠  

摘要： 全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是指在发生创伤、感染、休克等急性危重病时,发生的机体失控和自身破坏的全身性炎症反应。全身炎症的继续发展会导致败血症、低血容量性休克等疾病,进而出现多器官功能障碍,甚至死亡。在全身炎症发展过程中,由于外周促炎因子释放增加和/或血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)的破坏,机体外周的促炎因子和毒性物质进入中枢神经系统(Central nervous system,CNS),引起神经炎症,进而导致认知障碍等严重后果。目前治疗全身炎症的药物主要有糖皮质激素和抗生素等,然而长期使用糖皮质激素会引起严重的毒副作用,如股骨头坏死、消化性溃疡和库欣综合征等。因此,寻找出毒副作用低,抗炎效果好的药物具有重要的临床意义。 人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd,G-Rd)属于原人参二醇型皂苷(PPD型皂苷),具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、神经保护及心血管保护等多种药理作用。本课题组前期研究发现,G-Rd可以通过抑制c GAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路的激活缓解小鼠的免疫性肝炎,通过抑制TLR4/NF-κB信号通路激活缓解脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的急性肺损伤,但G-Rd是否能缓解LPS诱导全身炎症小鼠的认知障碍尚不清楚。 实验目的: 本研究旨在探讨G-Rd对LPS诱导小鼠全身炎症的影响以及全身炎症所致认知障碍的保护作用和机制。 实验方法: 1.G-Rd对LPS诱导小鼠全身炎症的影响 (1)G-Rd对LPS诱导全身炎症小鼠白细胞数的影响 32只C57BL/6J小鼠适应性喂养3天,根据体重随机分为4组:对照(Vehicle)组、模型(Model)组、人参皂苷Rd小剂量(G-Rd 10 mg/kg)组和人参皂苷Rd大剂量(G-Rd 20 mg/kg)组,每组8只。除Vehicle组外,各组小鼠均腹腔注射(i.p)LPS 3.5 mg/kg,连续3天;每天给予LPS后1 h,G-Rd各剂量组小鼠分别i.p给予相应药物,Vehicle组和Model组小鼠给予等体积的溶剂,连续给药3天。末次给予LPS后2、4、6、8、10、12和24 h,尾静脉取血检测小鼠的白细胞数。 (2)G-Rd对LPS诱导全身炎症小鼠外周血IL-6、IL-1β含量及肺、肝、肾、脑组织形态学的影响 32只C57BL/6J小鼠适应性喂养3天,分组给药方案同上。末次给予LPS后12 h,观察小鼠的一般状态,i.p 1%戊巴比妥钠溶液50 mg/kg麻醉小鼠,眶静脉取血,ELISA检测小鼠血清中IL-6及IL-1β含量;采集小鼠肺、肝、肾及脑组织,H&E染色,观察小鼠肺、肝、肾及脑组织病理形态学改变。 2.G-Rd对LPS诱导全身炎症小鼠认知障碍的保护作用 120只C57BL/6J小鼠适应性喂养3天,根据体重随机分为4组:Vehicle组、Model组、G-Rd 10 mg/kg组和G-Rd 20 mg/kg组,每组30只。除Vehicle组外,各组小鼠每天i.p LPS 3.5 mg/kg,连续3天;每天给予LPS后1 h,G-Rd各剂量组小鼠分别i.p给予相应药物,Vehicle组和Model组小鼠给予等体积的溶剂,连续给药7天。给G-Rd第5天药后1 h,每组取8只小鼠,进行旷场实验(Open Field Test,OFT),计算小鼠的活动指数、运动总距离和中心停留时间。给G-Rd第6天药后1 h,每组取旷场实验后的8只小鼠,进行Y迷宫(Y-Maze)实验,计算小鼠的自发交替率;每组另取8只小鼠,进行新物体识别实验(Novel Object Recognition,NOR),计算小鼠的识别指数。给G-Rd第7天药后1 h,i.p1%戊巴比妥钠溶液50 mg/kg麻醉小鼠,取脑组织,Nissl染色观察小鼠海马组织CA3区的神经元损伤,多重免疫荧光染色检测小鼠海马组织CA3区小胶质细胞标志物Iba-1和星形胶质细胞标志物GFAP的表达情况;取小鼠海马组织,QPCR检测IL-6及IL-1βm RNA表达水平,ELISA测定IL-6及IL-1β含量,流式细胞术检测线粒体膜电位和ROS水平,Western Blot检测TLR4、NF-κB p65、pNF-κB p65、My D88、NLRP3、ASC和pro-Caspase-1蛋白表达情况。 实验结果: 1.G-Rd对LPS诱导小鼠全身炎症的影响 (1)小鼠白细胞计数结果:与Vehicle组比较,Model组小鼠末次给予LPS后2 h白细胞数有增加趋势,但无统计学差异(P>0.05),4 h白细胞数明显增加(P<0.01),12 h白