关键词： NLRP3炎症小体   芳香烃受体   转录调控   caspase-1   IL-1β  

摘要： 研究目的NLRP3 (nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor prtein3)炎症小体是目前研究最深入的炎症小体,其活化强度被证实与多种疾病的发生发展密切相关,例如痛风、感染性疾病、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、急性移植物抗宿主疾病及癌症等。因此,针对NLRP3炎症小体活化调控及其分子机制的研究对于阐明这类疾病的发生发展的机理,以及寻找免疫调节治疗的新途径具有重要的意义。目前,环境污染越来越受到大家的重视,二恶英类污染物是环境污染中的主要成分,而二恶英类污染物中毒性最强的是2,3,7,8-四氯-二苯并-对-二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD),其主要通过芳香烃受体(Arylhydrocarbon receptor, AhR)对人体产生影响。近年来,AhR在毒理及癌症方面已得到深入研究,但对于AhR对免疫系统的调控效应与分子机制尚未完全明了。本课题深入研究了AhR对NLRP3炎症小体的调控效应和分子机制,旨在通过阐明NLRP3分子在转录水平的分子调控机制,为寻找防治环境污染因素造成的炎症性疾病的免疫调节疗法提供新途径。材料和方法***对NLRP3表达的影响1.1分别用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞40min,再用LPS刺激不同的时间(0,4h,8h), Western blot检测NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1p在蛋白水平的表达变化。1.2分别用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞40min,再用LPS刺激不同的时间(0,2h,4h),RT-PCR检测NLRP3、AS、caspase-1和IL-1β在mRNA水平的表达变化。1.3用不同剂量的AhR活化剂TCDD (2nM,10nM,20nM,50nM)和FICZ(20nM,100nM,200nM,500nM)分别刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞40min,再用LPS刺激8h,Western blot检测NLRP3在蛋白水平的表达变化。1.4设计合成AhR特异性小干扰RNA,用转染试剂将靶向AhR的SiRNA AhR-siRNA以及相应的对照CTRL-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h。收集细胞沉淀,Western blot检测AhR的蛋白表达情况,明确AhR-siRNA的干扰效率,筛选出抑制效率最佳的干扰片段进行后续实验。1.5用转染试剂将筛选出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h,用LPS对转染的细胞进行刺激,并于不同的时间点(0,4h,8h)收集细胞,通过Western blot检测NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在蛋白水平的表达情况。1.6用转染试剂将筛选出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h,用LPS对转染的细胞进行刺激,并于不同的时间点(0,4h,8h)收集细胞,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR检测NLRP3、 AS、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在mRNA水平的表达情况。***对NLRP3启动子区报告基因活性的影响2.1使用脂质体分别将PGL3质粒和NLRP3启动子区报告基因质粒(nt-2032 tont+166)转染入小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,24h后分别用DMSO和TCDD刺激40min,再用LPS刺激6h。应用报告基因系统检测分析NLRP3启动子区报告基因的活性。2.2使用脂质体将NLRP3启动子区报告基因质粒(nt-2032 to nt+166)转染入RAW264.7细胞,24h后分别用DMSO、TCDD、FICZ和L-kynurenine (L-kyn)刺激细胞40min,再用LPS刺激6h。应用报告基因系统检测分析NLRP3启动子区报告基因的活性。2.3分别将AhR的真核表达载体pCMV-Myc-AhR和空载体pCMV-Myc转染入RAW264.7细胞株,并筛选鉴定出稳定高表达AhR的细胞株以及表达相应空载体的细胞株。向两种细胞中分别转染入PGL3质粒和NLRP3启动子区报告基因质粒(nt-2032 to nt+166),24h后用LPS刺激细胞6h。应用报告基因系统检测分析NLRP3启动子区报告基因的活性。***调控NLRP3表达的分子机制3.1测序分析NLRP3启动子区的碱基序列,发现NLRP3启动子区存在3个潜在的AhR结合序列,分别为XRE1 (nt-1512 to-1504)、XRE2(nt-911 to -904)和XRE3(nt+61 to +67)。构建一系列含NLRP3启动子区的

关键词： 实验性自身免疫性脑脊髓炎   激活前损伤区   自噬   线粒体凋亡   炎症反应  

摘要： 背景与目的多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种中枢神经系统(central nervous system)的自身免疫性疾病,其典型病理改变为白质脱髓鞘、炎症细胞浸润、轴突损伤及血脑屏障的破坏等,有新旧病灶共存的特点。多发性硬化的病理形成机制尚不完全明确,近年通过尸检和一系列影像学等检查发现广泛的少突胶质细胞凋亡是最早出现的病理改变,并随即出现小胶质细胞激活、聚集,而此时髓鞘形态完整,无明显炎细胞浸润及轴突损伤等。之后数周甚至数月才出现单核巨噬细胞及淋巴细胞的浸润、白质脱髓鞘及轴突损伤等MS典型的病理改变,学者们用激活前损伤区(preactive lesion)的新概念来代表MS这种新发病灶出现时的早期病理改变,少突胶质细胞凋亡和小胶质细胞激活聚集是激活前损伤区特征性的改变。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)C57BL/6小鼠模型是研究MS的理想动物模型,病程中呈典型的缓解-复发过程。本课题组早期研究发现,在EAE小鼠中,线粒体能量衰竭和损伤是引起少突胶质细胞凋亡的始动因素,可能是激活前损伤区形成的重要原因,从而导致MS典型病理改变的发生。并且我们发现线粒体损伤和神经细胞凋亡伴随整个EAE病理过程,与疾病严重程度一致。但造成线粒体损伤的原因尚不清楚。自噬是细胞维持稳态的重要生物现象,当线粒体受损时,细胞可启动自噬来清除受损的线粒体及凋亡因子,从而保护细胞免于坏死、凋亡的危险。此外,一系列研究证实自噬对T细胞具有前存活和前死亡的双重作用,是自身免疫及炎症反应的重要介导者。在离体培养的单核细胞中,也发现抑制自噬能促进IL-1β的分泌。说明白噬对炎症反应的发生也起着至关重要的作用。本实验探索自噬在EAE病程中的时序变化,并探讨自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin, RAP)对EAE线粒体凋亡的影响,以及予以自噬抑制剂3甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)后EAE小鼠炎症反应程度的变化,初步阐明自噬对EAE小鼠线粒体凋亡及炎症反应的作用,旨在为多发性硬化的治疗提供新的思路。方法第一部分：将96只C57BL/6雌性小鼠分为正常组、EAE模型组、EAE+雷帕霉素组、EAE+PBS组,EAE+雷帕霉素组自免疫日起每日腹腔注射雷帕霉素(lmg/kg/d)。神经功能评分观察各组小鼠神经功能变化。于免疫后3d、7d、16d、30d通过Western Blot检测各组小鼠脑白质Beclin-1及Cytochrome(cyt-c)表达水平,免疫荧光双标检测免疫后7天caspase-3在少突胶质细胞中表达水平。第二部分：20只C57BL/6雌性小鼠建模后分别于3、7、16、30 d用Western blot检测CNS中LC3B的变化。另将60只小鼠分为正常对照组、EAE模型组、EAE+3-MA组,EAE+3-MA组白免疫日起每日腹腔注射3-MA(100 nmol/pL,2 pL/d)神经功能评分观察备组小鼠神经功能变化。免疫组化检测各组小鼠免疫后7 d小胶质细胞激活情况,Western blot检测免疫后急性期(16d)慢性期(30 d)白介素-1β(IL-1β)的表达,HE染色观察CNS炎性细胞浸润情况。结果1. Western bolt示与正常组相比,EAE组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ自免疫后7d开始降低(P<0.05)此后一直呈低表达水平(P<0.01)beclinl表达水平与LC3B一致；cyt-c的表达自7d时显著升高(P<0.01),于16d时达高峰(P<0.01)自噬激活剂RAP能升高自噬相关蛋白beclinl的水平,抑制cyt-c表达水平(P<0.05)免疫荧光双标示EAE免疫后7d少突胶质细胞即高表达caspase-3,EAE+RAP组少突胶质细胞caspase-3表达水平低于模型组(P<0.05)2.免疫组织化学示EAE免疫后7 d即有小胶质细胞激活,EAE+3-MA组EAE小鼠小胶质细胞激活程度较EAE模型组严重P<0.05)Western bolt示免疫后16、30 d,EAE模型组高表达IL-1β,EAE+3-MA组小鼠IL-1β表达水平较同时间点EAE模型组商P<0.05)HE染色结果显示,EAE+3-MA组炎细胞浸润比同时间点EAE模型组加重(P<0.05)呈典型“血管袖套样”改变；***小鼠在最早免疫后9 d开始发病,大多数集中在12’16 d发病,并于16’20 d达到疾病高峰；EAE+RAP组EAE小鼠较模型组神经功能评分显著降低,疾病严重程度减轻(P<0.01)EAE+3-MA组小鼠发病时间提前,神经功能评分增高,疾病严重程度加重(P<0.05)结论1.在EAE免疫后7天就出现了自噬水

关键词： 脂联素   微炎症状态   慢性肾脏病  

摘要： 目的通过测定不同时期慢性肾脏病(CKD)患者血清当中脂联素(ADPN)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)以及白介素-6(IL-6)的水平,了解脂联素与慢性肾脏病患者微炎症状态的相互关系,探讨脂联素水平对微炎症状态的影响,为改善慢性肾脏病患者长期预后,防治其并发症提供新的诊疗思路。方法研究选取2013年1月至2014年6月在皖南医学附属弋矶山医院肾脏内科住院治疗的慢性肾脏病患者78例,根据改良MDRD公式[1]估算的肾小球滤过率将患者分为CKD1-2期组(GFR≧60ml/min),共计16例;CKD3期组(GFR30-59ml/min),共计15例;CKD4期组(GFR15-29ml/min),共计15例;以及CKD5期组(GFR<15ml/min),共计32例,其中CKD5期组再根据患者接受透析方式的不同分为腹膜透析组和血液透析组各16例,另选16例健康体检者作为正常对照组。所有研究对象均在前一日夜间禁食8小时,于次日清晨安静状态下抽取血液样本,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清脂联素、超敏C反应蛋白和白介素-6水平,并利用全自动生化分析仪检测血肌酐(Cr)、血红蛋白(Hb)、血白蛋白(Alb)等相关指标。利用SPSS17.0数据处理软件对数据进行统计学分析。结果CKD1-5期患者组ADPN、hs-CRP、IL-6水平与健康对照组相比明显升高,差异有统计学意义。各组间ADPN、hs-CRP、IL-6水平差异根据方差检验有统计学意义(P<0.01),表明ADPN、hs-CRP以及IL-6水平水平随肾小球滤过率的下降而逐渐上升。根据直线相关分析得出,健康对照组中ADPN水平与hs-CRP水平无明显相关性,CKD患者组ADPN水平与hs-CRP水平呈正相关关系,CKD1-2期组、CKD3期组、CKD4期组、HD组、PD组与hs-CRP水平的相关系数分别为0.107、0.225、0.294、0.378、0.403、0.469(P<0.01)。根据直线相关分析得出,健康对照组中ADPN水平与IL-6水平无明显相关性,CKD患者组ADPN水平与IL-6水平呈正相关关系,CKD1-2期组、CKD3期组、CKD4期组、HD组、PD组与hs-CRP水平的相关系数分别为0.164、0.413、0.408、0.595、0.738、0.714(P<0.01)。将研究对象中CKD1-5期患者按照是否贫血进行分组,分为贫血组(30例)和非贫血组(48例)。应用t检验比较两组间ADPN、hs-CRP、IL-6水平可发现贫血组与非贫血组之间ADPN、hs-CRP、IL-6水平有显著差异,表明ADPN、hs-CRP与IL-6在贫血的CKD患者中水平较高。将研究对象中CKD1-5期患者按照血白蛋白水平是否正常进行分组,分为正常Alb组(36例)和低Alb组(42例)。应用t检验比较两组间ADPN、hs-CRP、IL-6水平可发现正常Alb组和低Alb组之间ADPN、hs-CRP、IL-6水平有显著差异,表明ADPN、hs-CRP和IL-6在低Alb浓度CKD患者中水平较高。结论1 CKD患者体内hs-CRP、IL-6水平较健康对照组明显升高,表明CKD患者体内存在微炎症状态;2 CKD患者血清ADPN水平明显高于健康对照组,并且与CKD患者微炎症状态密切相关,临床上可以将其作为一种评估CKD病情程度的相关检测指标。

关键词： 新疆哈萨克族   高血压   T淋巴细胞   NLRP3炎症小体   替米沙坦  

摘要： 目的：研究新疆哈萨克族高血压患者外周血T淋巴细胞NLRP3炎症体信号通路相关分子表达变化并探讨该通路参与高血压发生的可能分子机制。方法：随机选取2013年6月至2014年2月期间新疆医科大学第一附属医院心脏中心门诊首次就诊且未经降压药物治疗的新疆哈萨克族高血压患者30例,年龄(54.7±5.6)岁,选取同期同民族健康体检者30例,年龄(54.6±4.7)岁,每组男女比例1：1。采集两组受试者外周血并分别提取血浆和T淋巴细胞。采用ELISA法检测血浆白细胞介素(IL)-1β含量；运用荧光定量PCR和Western blot技术检测高血压组和对照组T淋巴细胞中NLRP3、Caspase-1和IL-1p的mRNA和蛋白相对表达量。然后选取高血压组T淋巴细胞经体外培养活化增殖48h后随机分为空白对照组、替米沙坦组及钾通道阻断剂(阳性对照)组,每组10例,并分别给予对应药物干预后继续培养48小时,并提取每组干预0h、48h细胞培养上清及T淋巴细胞。检测细胞培养上清IL-1β含量及药物干预0h、48h T淋巴细胞中NLRP3、***-1β mRNA和蛋白的表达变化。结果：两组受试者基线资料差异无统计学意义。(1)与健康对照组相比,高血压组血浆IL-1β水平明显升高且T淋巴细胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白相对表达量均高于对照组。(2)经替米沙坦及钾通道阻断剂干预后T淋巴细胞培养上清IL-1β含量较干预前均明显降低,而空白对照组无明显变化。经替米沙坦及钾通道阻断剂干预后T淋巴细胞中NLRP3、Caspase-1及IL-1β mRNA和蛋白相对表达量较干预前均明显降低,而空白对照组则无明显变化。结论：新疆哈萨克族高血压患者外周血T淋巴细胞上NLRP3炎症体通路处于一定激活状态,而该通路的活化可能是T淋巴细胞Kvl.3钾离子通道调控高血压形成的机制之一。

关键词： 巨噬细胞   金黄色葡萄球菌   Toll样受体2   吞噬   自噬   c-Jun氨基末端激酶变应性气道炎症   天然免疫  

摘要： Toll样受体(TLRs)是Ⅰ型跨膜蛋白家族,在体内主要负责感知入侵的病原体。到目前为止,已经确定发现的人类TLR家族有10个成员。它们调节的天然免疫反应被认为参与了多种感染和炎症性疾病的发病。本论文中,我们主要针对TLR2进行了两个方面的研究。***2介导的金黄色葡萄球菌刺激巨噬细胞吞噬和自噬信号通路的分子机制研究背景有报道显示,Toll样受体2(TLR2)能够参与金葡菌的识别,然而,在金葡菌感染的气道环境中,巨噬细胞是否能够激活吞噬和自噬反应予以应对,TLR2在巨噬细胞活化的天然免疫过程中所发挥的作用以及潜在的机制,目前尚未阐明清楚。研究目的1.研究金葡菌感染巨噬细胞过程中,相关吞噬和自噬信号的活化情况。2.探讨TLR2及下游潜在信号级联在金葡菌刺激巨噬细胞所诱导的吞噬和自噬过程中的作用。研究方法1.金葡菌刺激巨噬细胞不同时间信号分子表达及自噬的检测金葡菌刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.715min、30min、45min、60min、120min、 240min。采用Western Blot方法检测多种信号分子和自噬蛋白的表达;通过瞬时转染GFP-LC3质粒的方法,激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬的水平。***干扰TLR2对巨噬细胞吞噬金葡菌及自噬诱导的影响评估TLR2 siRNA作用于RAW264.7细胞的同时,给予金葡菌刺激1h。吞噬试验观察细胞吞噬金葡菌;通过瞬时转染GFP-LC3质粒的方法,激光共聚焦显微镜观察细胞自噬的水平;同时,采用Western Blot方法检测吞噬和自噬蛋白的表达。3.靶向抑制JNK对巨噬细胞吞噬金葡菌及自噬诱导的影响评估JNK特异性抑制剂SP600125处理RAW264.7细胞的同时,给予金葡菌刺激1h。吞噬试验观察细胞吞噬金葡菌;通过瞬时转染GFP-LC3质粒的方法,激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬的水平;同时,采用Western Blot方法检测吞噬和自噬蛋白的表达。研究结果1.金葡菌刺激巨噬细胞活化多种信号通路及自噬RAW264.7细胞在金葡菌刺激作用下,P-JNK、P-ERK、P-p38 MAPKs, MyD88, P-Akt, GTP-Rac1的表达显著增加,在活化的MAPKs中,仅有JNK磷酸化水平的升高是以一种时间依赖性方式进行的;与此同时,金葡菌刺激RAW264.7细胞明显上调了自噬蛋白Beclin-1和LC3-II的表达,以及细胞中GFP-LC3点状颗粒的表达数量。***2对巨噬细胞吞噬金葡菌以及金葡菌诱导的自噬至关重要在TLR2 siRNA作用下,RAW264.7细胞吞噬金葡菌的能力显著降低,金葡菌刺激诱导的P-Akt、GTP-Rac1吞噬蛋白以及P-JNK的表达显著下调,但不减弱ERK、 p38的磷酸化;给予RAW264.7细胞siRNA沉默TLR2,金葡菌刺激细胞活化的自噬蛋白Beclin-1和LC3-II的表达水平明显降低,细胞中GFP-LC3点状颗粒的表达数量也相应的减少。***2依赖的JNK信号通路参与巨噬细胞吞噬金葡菌以及金葡菌诱导的自噬JNK抑制剂作用RAW264.7细胞减弱了细胞吞噬金葡菌的能力,下调了金葡菌刺激诱导的吞噬蛋白P-Akt和GTP-Rac1的表达;给予RAW264.7细胞SP600125处理,金葡菌刺激细胞活化的自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达水平降低,细胞中GFP-LC3点状颗粒的表达数量也相应的减少。TLR2 siRNA和SP600125同时作用与TLR2 siRNA单独作用相比,并未进一步降低RAW264.7细胞吞噬金葡菌的能力以及金葡菌刺激细胞活化的自噬水平。研究结论1.金葡菌刺激巨噬细胞诱导了吞噬和自噬活化。***2通过JNK信号通路介导了金葡菌刺激巨噬细胞诱导的吞噬和自噬,是一种新的可能的天然免疫调节机制。2.靶向抑制TLR2基因敲除小鼠JNK信号对变应性气道炎症及自噬活化的影响研究背景据世界卫生组织(WHO)评估,全世界超过3亿人罹患支气管哮喘(简称哮喘)。目前,已有的TLR2激活的天然免疫反应在哮喘发病中的作用研究仍存在争议。另外,哮喘发病过程中自噬的发生情况也不十分清楚。考虑到是哮喘最具特征性的临床表现之一,TLR2在变应性气道炎症中的作用,和对相关自噬活化的影响及潜在的信号机制有待阐明。研究目的1.观察变应性气道炎症模型中TLR2的表达情况。2.探讨TLR2及下游潜在信号级联在小鼠变应性气道炎症及自噬活化中的作用。研究方法1.建立变应性气道炎症模型,检测野生型小鼠肺组织中TLR2的表达卵清蛋白(OVA)致敏和激发野生型小鼠。采用Western Blot方法检测野生型小鼠肺组织中TLR2的蛋白表达水平;通过免疫荧光的方法,荧光倒置显微镜观察野生型小鼠气道TLR2的表达。***2基因敲除对小

关键词： 重叠综合症   间歇低氧   肺气肿   炎症   凝血因子  

摘要： 背景与目的:慢性阻塞性肺病和阻塞性睡眠呼吸暂停均能增加系统炎症和心血管疾病发生风险。两者同时存在,即重叠综合症,较睡眠呼吸暂停或慢性阻塞性肺病单独存在时低氧血症和高碳酸血症程度更著,且心血管死亡风险更大。因此,我们建立肺气肿合并间歇低氧模型,探索肺气肿合并间歇低氧是否导致严重的肺脏、肝脏、胰腺、颈动脉及外周血炎症状态,探讨炎症是否改变肝脏合成的凝血/抗凝血因子水平,并检测外周血中性粒细胞(PMN)、T淋巴细胞凋亡率及内皮祖细胞(EPC)水平以探索EPC动员情况。实验方法:将60只Wistar大鼠分成4组。对照组:假烟熏暴露和常氧暴露;IH组:假烟熏暴露和IH暴露;IH暴露:将大鼠置于特制IH装置中每天9AM到5PM通入交替氮气30s和空气90s,从13周开始到16周结束持续4周;肺气肿组:烟熏暴露和正常氧暴露,每天早上9AM之前和5PM之后两次将大鼠暴露于15只香烟烟雾持续16周;重叠组:烟熏暴露和IH暴露。每组随机选取5只大鼠进行血气分析预实验。剩下的每组10只大鼠,收集肺泡灌洗液行细胞计数,收集外周血检测T淋巴细胞凋亡率、中性粒细胞(PMN)凋亡率及内皮祖细胞(EPC)相对浓度。同时检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及肝脏凝血/抗凝血因子(抗凝血酶(AT)、纤维蛋白原(FIB)、VIII因子(F VIII)、血管性血友病因子(v WF))。我们提取肺组织块、肝脏、胰腺、右颈动脉进行病理评分病检测肝脏氧化应激指标(肝脏氧化应激酶,超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)浓度)。采用SPSS 11.5软件进行数据分析。结果:(1)各组大鼠肺病理评分、MLI重叠组>肺气肿组>IH组>对照组(均P<0.05),各组大鼠MAN是重叠组<肺气肿组IH组(20.65±1.3066071)>肺气肿组(18.49±1.6736188)>对照组(13.02±1.1820885),CD3+CD8+淋巴细胞凋亡率重叠组(18.42±1.1583513)IH组(19.20±1.1814,13.60±2.951,18.50±4.743,53.9950±1.80079)。(6)各组大鼠BALF中巨噬细胞比例是肺气肿组(75.25±2.530)%和对照组(73.55±9.847)%>IH组(45.45±4.368)%>重叠组(36.75±6.857)%,肺气肿组和对照组无显著差异;淋巴细胞比例为重叠组(60.50±7.944)%和IH组(53.25±5.514)%>对照组(24.85±10.504)%>肺气肿组(9.85±2.358)%,重叠组和IH组无显著差异;中性粒细胞比例肺气肿组(14.90±3.062)%明显高于其他组,对照组(1.60±1.174)、IH组(1.30±1.903)、重叠组(2.75±1.919)间无统计学差异。(7)各组大鼠AT、FIB、v WF、F VIII差异明显(F=71.570,171.073,129.446,289.047,P=0.000),FIB、v WF、F VIII重叠组(201.330±6.6291,72.570±3.8268,315.920±26.1305)最高,对照组最低(134.730±6.4790,48.890±2.4978,116.350±3.8254),IH组(153.120±6.8579,57.520±2.3569,198.680±7.9140)<肺气肿组(175.790±7.8053,65.310±2.3695,231.030±13.5187),AT对照组(123.10±3.281)最高,重叠组(96.12±5.351)最低,IH组(117.10±2.885)高于肺气肿组(105.37±5.779)。(8)各组大鼠SOD、CAT、MDA差异明显(F=90.206,270.257,118.267,P均=0.000),SOD、CAT对照组(88.300±4.5097、113.820±6.30726)最低,重叠组(63.860±3.7283,49.8480±3.62149)最低,肺气肿组(73.970±2.2361,79.0330±5.05598)

关键词： 奶牛子宫内膜炎   脂多糖   鱼腥草素钠   NF-κB   MAPK  

摘要： 奶牛产后子宫内膜炎是由致病微生物上行感染母牛生殖道而引起的炎症。大肠杆菌是主要的致病菌之一,但其发病机制并不十分清楚。鱼腥草素钠(Sodium houttuyfonate, SH)是鱼腥草有效成分鱼腥草素的亚硫酸氢钠加成化合物,稳定性强,临床上用于治疗炎症疾病。目前鱼腥草素钠对抗炎症疾病的分子机制还不完全清楚,我们假设NF-κB充当关键调解物,从体外细胞水平探明其抗炎分子机制。并在体内对小鼠子宫内膜炎模型和奶牛子宫内膜炎的疗效进行观察。从而深入研究SH抗炎活性和其药理机制。 本研究运用体外原代培养细胞的方法,分离鉴定了奶牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞。并对培养获得的原代细胞进行了不同染色方法的形态学观察和透射电镜观察。在此基础上,建立LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)炎症模型。为了评估SH的体内外抗炎作用,首先用MTT法和LDH分析检测梯度浓度的SH对bEECs的毒性;其次用ELISA和qRT-PCR方法分别从蛋白分泌和nRNA表达两个水平检测细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8,同时用western blotting的方法检测细胞内炎症信号转导通路MAPKs/NF-κB的关键蛋白ERK、JNK、p38、IκBα和NF-κBp65;最后用临床诊断的方法评估SH治疗小鼠和奶牛子宫内膜炎的疗效。 研究表明,运用组织培养和复合酶消化结合差时技术可以分离出纯度很高的bEECs,为后续的实验提供了足够的细胞。不同染色方法对子宫内膜细胞观察可知其细胞结构清晰,胞浆胞膜分明;超微结构观察结果显示,体外培养的子宫内膜上皮细胞可清晰看到微胞凸,胞内各种细胞器清晰可见。细胞毒性实验显示,SH (120μg/mL)浓度范围内对bEECs无毒副作用;15,30and60μg/mL高中低浓度的SH可以抑制LPS诱导bEECs的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的蛋白分泌水平,并呈浓度依赖关系;对炎性细胞因子的mRNA有同样的调控作用。而且,在LPS激活的bEECs中,SH抑制了IκBα的降解和NF-κB p65的磷酸化;压制了ERK、JNK、p38磷酸化水平。体内疗效实验证实,SH能够显著减弱模型组小鼠子宫内膜的炎性反应,子宫指数与正常对照组差异不显著,镜检子宫组织显示显微结构基本正常,表明SH对实验性子宫内膜炎模型小鼠有很好的治疗效果。用SH治疗奶牛临床型子宫内膜炎受孕率达到86%,发情头数占总头数的91.7%。而用土霉素治疗奶牛受孕率为50%,发情头数占总头数的67%。在发情头数和受孕率上SH的治疗效果优于土霉素。

关键词： 微炎症   单核细胞   尿毒症   对甲酚  

摘要： 研究背景:慢性肾病(Chronic kidney disease CKD)是肾内科常见疾病,患病率达8%-10%,其晚期并发症多,死亡率高,是人类生存的重要威胁之一。CKD患者中约有70%死于心血管疾病(50%)和感染(20%),两者都是由免疫应答改变造成的[1]。在尿毒症患者中,一方面免疫防御能力被抑制,机体感染可能性升高;另一方面,免疫细胞的预活化及活化诱发了炎症以及心血管疾病,尤其当免疫反应不能被有效控制时,它就变成了一把双刃剑[2]。因而,免疫反应在CKD病程进展过程中发挥重要的作用。营养不良-炎症-动脉粥样硬化综合征的提出[3],较好的阐述了尿毒症患者炎症状态与其营养不良、动脉粥样硬化及高死亡率之间的关系,而这一系列病症的核心就是微炎症。当机体处于微炎症状态时,体内的单核-巨噬细胞系统激活并释放多种促炎症细胞因子,从而引起炎症性损伤,进一步加速了CKD的发生和发展。透析是CKD患者终末期替代治疗方式之一,相关研究认为透析前的慢性肾功能衰竭患者就存在明显的微炎症状态。而当患者接受长期血液净化后,炎症反应状态仍然持续存在,这提示透析不能完全缓解患者的微炎症状态。尿毒症毒素中有一部分毒素能与血清蛋白结合即蛋白结合毒素(protein-bound uremic toxins),现有透析手段不能将其有效清除。尿毒素对甲酚(P-cresol PC)是蛋白结合毒素中的一种,在肾脏功能受损的病人中,PC在血液中蓄积,并以94%的结合率与血清白蛋白结合。而常规透析方法对PC的清除率非常低,这使得其在尿毒症患者体内大量蓄积。已有研究证明有毒溶质在体内的蓄积可能影响单核细胞/巨噬细胞,使其不能维持有效的免疫反应水平,进而引起传染病或预激活,导致炎症反应[4]。但PC对单核细胞的影响及其具体机制尚不明确。研究目的:本研究拟以THP-1人单核细胞系为细胞模型,通过PC对细胞的处理,检测其对细胞活性以及炎症相关细胞因子表达水平的影响,从而探讨PC对单核细胞的影响及其可能机制。研究方法:(1)体外培养thp-1细胞,分别用20mg/l、40mg/l、80mg/l、160mg/l浓度pc处理单核细胞,用倒置显微镜观察细胞形态,用cck-8法(cellcountkit-8)检测thp-1经pc处理后的存活率。(2)体外培养thp-1细胞,分别用40mg/l、80mg/l浓度pc处理单核细胞24h后,用反转录pcr(rt-pcr)检测单核细胞中肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)和白细胞介素-10(interleukin-10,il-10)的mrna表达,免疫印迹(westernblot)法检测单核细胞中tnf-α和il-10的蛋白表达水平,分析这些因子的表达变化与pc处理的关系。(3)体外培养thp-1细胞,分别用40mg/l、80mg/l浓度组pc处理单核细胞24h后,用rt-pcr及免疫印迹(westernblot)法检测单核细胞中toll样受体-4(toll-likereceptor4,tlr4)的表达,并分析其表达变化与前述炎症相关因子表达变化的关系。结果:(1)thp-1细胞经对甲酚处理6h后,20、40、80、160mg/l处理组细胞活力分别下降至正常对照组的88.18±7.81%、87.94±5.66%、76.03±4.55%、67.25±8.48%,而80、160mg/l的pc处理组与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。pc处理12h及24h后,80mg/l处理组及160mg/l处理组对thp-1细胞增殖活力的抑制明显,分别为正常水平的65.31±7.72%、55.17±6.24%及57.65±6.14%、52.99±9.07%,差异均有统计学意义(p<0.05)。可见,对甲酚呈浓度依赖性抑制thp-1细胞增殖。(2)对甲酚处理thp-1细胞24h后,细胞tnf-α的mrna表达水平显著升高,80mg/l浓度组升高达1.86±0.13倍,高于40mg/l浓度组的1.20±0.06倍,且80mg/l浓度组与对照组相比,tnf-α的mrna表达水平升高显著(p<0.05);il-10的mrna表达水平在pc处理后逐渐降低,80mg/l处理组降低为对照组的66±13%,且降低显著(p<0.05)。pc可在核酸水平及蛋白水平促进tnf-α促炎因子的表达,并抑制il-10抑炎因子的表达。(3)对甲酚处理thp-1细胞24h后,80mg/l处理组的细胞中tlr-4的mrna表达水平升高至对照组的2.67±0.11倍,升高程度高于40mg/l处理组的2.08±0.10倍,且80mg/l处理组与对照组相比,tlr-4的升高显著(p<0.05)。细胞中tlr-4的蛋白表达水平也有显著升高,且80mg/l处理

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒   nsp11   nsp1α   NLRP3炎症小体   IL-1β  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是严重危害养猪业的重大病毒性传染病,其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应,引起机体免疫抑制,造成持续性感染,从而给该病的防控带来困难。PRRSV感染可以引起机体强烈的间质性肺炎,诱导肺部许多促炎性细胞因子的产生。最近的研究表明PRRSV可以激活NLRP3介导的炎症反应,诱导促炎性细胞因子IL-1β的分泌。炎症反应是机体天然免疫系统中抵抗病毒入侵的坚固防线,但是对PRRSV如何调控炎症反应从而实现免疫逃逸的研究还未见报道。因此,本篇论文对PRRSV调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制加以研究。其主要内容和结果如下:***激活NLRP3炎症小体的动态变化情况。用PRRSV BJ-4株在不同时间点(12 h、24 h、48 h、72 h)感染猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs),利用荧光定量PCR和ELISA方法检测NLRP3介导的炎症反应信号通路中重要组分的mRNA水平和IL-1β的蛋白水平,发现NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平和细胞上清中的IL-1β在PRRSV感染早期都呈现上升趋势,并分别在24 h和48 h达到峰值,但是在感染晚期NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平急剧下降,并与空白对照组水平相当,IL-1β的蛋白水平在之后的阶段也呈现出下降趋势。而不同剂量PRRSV感染PAMs的实验发现,PRRSV上调的procaspase-1、pro-IL-1β的mRNA水平和IL-1β的蛋白水平呈明显的剂量依赖效应。这些实验结果表明PRRSV通过上调NLRP3信号通路蛋白而促进早期炎症反应,但在感染晚期,PRRSV可能通过某种机制而抑制了NLRP3介导的炎症反应。因此接下来本研究首先确证PRRSV激活的炎症反应是NLRP3炎症小体所依赖的,然后筛选鉴定PRRSV编码抑制炎症反应的组分,最后探究PRRSV感染早期促进炎症反应的分子机制。***诱导IL-1β的分泌依赖于NLRP3炎症小体。分别利用NLRP3的特异性抑制剂Glyburide以及针对NLRP3和ASC的特异性siRNAs对NLRP3炎症小体进行抑制和干扰,结果发现,Glyburide能够显著抑制由PRRSV BJ-4株诱导的IL-1β的分泌,而且,针对NLRP3和ASC的特异性siRNAs可以显著下调该基因的表达,并且也能够显著抑制由PRRSV诱导的IL-1β的分泌。***非结构蛋白nsp11和nsp1α是抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1β分泌的病毒组分。分别将nsp11及其核酸内切酶活性缺失的突变体和nsp1α及其缺失或突变N端锌指(ZF)结构的突变体转染PAMs细胞,结果发现,nsp11和nsp1α都能够抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高以及由LPS和尼日利亚菌素(Nigericin)引起的IL-1β蛋白水平的升高。进一步的突变实验结果显示nsp11的核酸内切酶活性以及nsp1α的N端锌指结构对于其抑制作用是必需的。然后,在已重构NLRP3炎症小体模型的HEK293T细胞上转染PRRSV nsp11和nsp1α及其突变体的真核表达质粒,得到与PAMs细胞上相一致的实验结果,进一步确定nsp11和nsp1α对NLRP3炎症小体介导的IL-1β表达的抑制作用。***上调的miR-373能促进炎症反应。我们的前期实验发现PRRSV感染MARC-145细胞后上调宿主miR-373的表达,而进一步的实验发现,在LPS和Nigericin共同刺激的PAMs细胞上过表达miR-373,可以显著增加NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌以及促进NLRP3、procaspase-1和pro-IL-1βmRNA水平的升高,从而促进炎症反应的发生。另外,PRRSV感染PAMs细胞后可以显著下调miR-373的靶基因TGFBR2(免疫抑制性受体)的表达。综上所述,PRRSV感染激活NLRP3炎症小体并产生IL-1β等促炎性细胞因子来抵御病毒入侵和保护机体的同时,病毒自身又编码能拮抗NLRP3炎症小体活化的蛋白——nsp11和nsp1α,抑制炎症反应的发生,从而使其能够在宿主体内持续增殖。另外,首次发现miR-373可以促进炎症反应的发生,可能参与调控PRRSV引起的天然免疫反应过程。PRRSV感染可以显著上调miR-373并下调其靶基因TG