关键词： 天然化合物   抗炎   脂多糖   巨噬细胞   炎症细胞因子  

摘要： 炎症反应是由免疫系统分泌的致炎因子介导的针对有害刺激产生的一种自然性防御反应,然而异常的炎症反应比如反应过度或针对自身正常组织产生反应却可造成机体组织的损伤,导致多种疾病,如急、慢性炎症性疾病及自身免疫性疾病等;因此控制炎症反应对于治疗以上炎症相关疾病具有重要意义。白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)是一个重要的炎症介导因子。在前期研究中,我们构建了以荧光素酶报告基因为基础的IL-6表达调节剂筛选系统,以筛选可能抑制炎症反应的化合物。利用该筛选系统,从300多种天然中药化合物中筛选得到TI110,发现TI110可以明显抑制IL-6启动子调节下的报告基因的表达。本论文即在此基础上,针对TI110作为抗炎候选化合物开展了深入研究。为了研究TI110对炎症反应的抑制作用,我们在体外利用了LPS刺激的巨噬细胞炎症反应模型。首先,通过MTT分析发现实验剂量的TI110对巨噬细胞的细胞活力没有显著影响。然后通过RT-PCR,RT-qPCR及ELISA检测发现TI110在RAW 264.7细胞,小鼠腹腔巨噬细胞和人单核巨噬细胞THP1等三种来源的巨噬细胞中都可以显著地抑制炎症细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β的mRNA水平和蛋白水平的表达。同时,我们发现TI110在LPS刺激的巨噬细胞中促进抗炎细胞因子IL-10和TGF-β1 mRNA水平的表达,增加抗炎因子的释放。然后,我们进一步研究了TI110对炎症介质产生的影响,发现TI110能明显抑制巨噬细胞中LPS刺激下iNOS的表达和NO的释放,抑制COX2蛋白的表达和晚期炎症因子HMGB1的分泌。接下来,我们研究了TI110在巨噬细胞中发挥抗炎作用的机制。在LPS刺激的巨噬细胞中,TI110能够抑制NF-κB磷酸化和p65的入核,提示TI110能够抑制LPS介导的NF-κB信号通路活化。此外,TI110在LPS刺激的巨噬细胞中显著抑制IRF5的表达。对于介导炎症反应的MAPK信号通路,TI110对p38/MAPK,ERK/MAPK的信号通路没有显著的影响,只对JNK信号通路有抑制作用。我们进一步研究还发现TI110能够促进LPS刺激的巨噬细胞AMPK磷酸化激活AMPK。我们利用AMPK抑制剂Compound C抑制AMPK的激活,则消除了TI110对NF-κB和IRF5的抑制作用,这提示了TI110对NF-κB和IRF5信号通路的抑制作用是通过激活AMPK而实现的。上述结果表明TI110可通过多种分子机制发挥其抗炎作用。最后,我们构建了LPS诱导的小鼠体内炎症模型,发现腹腔注射TI110增加感染性休克小鼠的存活率,降低其血清中IL-6,TNF-α,IL-1β等炎症细胞因子的含量,降低NO和HMGB1炎症介质的释放,增加抗炎因子IL-10的分泌且减轻模型组小鼠的肝损伤。综上所述,我们利用体外和体内实验证明TI110可显著抑制LPS引起的炎症反应,且TI110的抗炎作用是通过调节多种炎症相关信号通路来实现的。因此,天然化合物TI110可能会成为治疗炎症相关疾病的潜在药物。

关键词： 新生儿疾病   NOD受体   蛋白表达   细胞病理学  

摘要： 目的：分析和探讨小于胎龄儿（SGA）、适于胎龄儿（AGA）两组新生儿的临床特点及围产期危险因素，以及通过比较小于胎龄儿（SGA）、适于胎龄儿（AGA）两组新生儿的NOD受体（NOD1和NOD2）表达水平及介导炎症反应能力的差异，探讨小于胎龄儿（SGA）模式识别受体的功能特点及其与感染的关系，旨在为临床干预小于胎龄儿（SGA）提供理论依据。　　方法：对苏州大学附属儿童医院2014年6月至2016年2月新生儿病房住院符合SGA和AGA诊断标准的临床资料进行回顾性分析，比较SG A和AGA的围产期高危因素及并发症。将符合入选条件的实验对象分为早产组（SGA、AGA）、足月组（SGA、AGA）、成人组。收集其外周血：分离单个核细胞，通过PCR测定各组NOD1、NOD2基因表达水平;采用NOD1、NOD2激动剂Tri-DAP、MDP分别刺激早产组（SGA、AGA）、足月组（SGA、AGA）、成人组外周血4h，应用ELISA试剂盒测定炎症因子TNF-和IL-6的表达水平。　　结果：⑴足月组SGA羊水量少、妊娠期高血压、脐带异常、父亲吸烟、母亲妊娠期合并贫血宫内窘迫发生率均分别高于AGA组，差异有统计学意义(P<0.05);早产组SGA发生的高危因素是妊娠期高血压，差异有统计学意义(P<0.05);脐带异常和妊娠期高血压是SG A高发的独立相关因素。⑵足月组SGA并发新生儿窒息、低血糖、高胆红素血症、肺炎、颅内出血、败血症、化脓性脑膜炎和泌尿系感染均较足月组AGA高，差异有统计学意义(P<0.05);早产组SGA较早产组AGA易并发低血糖，差异有统计学意义(P<0.05);早产组SGA与AG A在并发新生儿窒息、坏死性小肠结肠炎、高胆红素血症、败血症、化脓性脑膜炎等疾病中无明显差异(P>0.05);足月组SGA与早产组SGA在并发症中比较我们发现，早产组 SGA中新生儿窒息、RDS、呼吸暂停、低血糖、高胆红素血症、颅内出血、NEC发生率均较足月组 SGA明显高，差异有统计学意义（P<0.01）;早产组SGA在泌尿系感染较足月组SGA高，差异有统计学意义（P<0.05）。⑶足月组SGA较足月组AGA住院时间长，具有统计学差异（P<0.05），而早产组无明显差异。⑷足月组AGA和SGA，NOD1的表达低于成人，且SGA的表达量低于AGA;足月组SGA的NOD2表达量明显低于足月组AGA和成人，但足月组AGA和成人之间的表达量是一致的;早产组AGA和SGA NOD1和NOD2表达低于成人，但两者间无明显差异。⑸Tri-DAP和MDP分别刺激后，早产组SGA和AGA产生IL-6、TNF-α的表达水平显著低于成人和足月组，但 SG A和 AG A之间无明显差异;足月组 SG A和AGA产生IL-6、TNF-α的表达水平显著低于成人，且SGA明显低于AGA。　　结论：①妊娠期高血压、脐带异常、羊水量少、父亲吸烟、母亲妊娠期合并贫血是SGA发生的高危因素。②足月组SGA较足月组AGA更易并发坏死性小肠结肠炎、败血症、泌尿系感染等疾病。③足月组SGA NOD1和NOD2的表达水平均低于足月组AGA，而早产组差异不大，提示SG A抗感染免疫应答存在缺陷。④足月组SGA外周血经NLRs受体激动剂刺激后，产生炎症因子的水平较足月组AGA低，提示SGA NOD样受体介导的信号通路存在缺陷。

关键词： 刺梨冻干粉   慢性肾脏病   炎症状态   检测指标   中医药治疗  

摘要： 目的:通过临床观察刺梨冻干粉对慢性肾脏病(Chronic KidneyDisease，CKD)3期患者微炎症状态检测指标的影响，探查刺梨冻干粉在减轻CKD3期患者微炎症状态中的疗效和安全性，为中医药治疗CKD微炎症状态提供临床依据。　　方法:采用随机数字表法将符合纳入标准的60例患者分为治疗组、对照组，每组各30人。两组患者均采用一般常规性治疗，如纠正高血压、高血糖、贫血及电解质紊乱等。治疗组在基础治疗上服用刺梨冻干粉，每日3次，每次1g，疗程共12周。两组患者在第0周和第12周时分别检测超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、24小时尿蛋白定量及中医临床证候的变化。第0周、第4周、第8周、第12周时对肾功能指标血肌酐(SCr)、肾小球率过滤(GFR)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等安全性指标进行检查。实验数据通过SPSS16.0统计学软件进行分析。　　结果:两组患者在年龄、性别、原发病、病程等方面经统计学分析无明显差异(P＞0.05)，具有可比性。　　1.中医临床证候比较:两组治疗前的中医证候积分组间比较P＞0.05，无明显差异;治疗后组间比较有显著差异(P＜0.01)。　　2.微炎症状态指标比较:两组治疗前组间比较无统计学差异(P＞0.05)，两组治疗前后hs-CRP、IL-6、TNF-α组内比较均有差异(P＜0.05)，两组治疗后组间比较具有显著差异(P＜0.01)，治疗组疗效优于对照组。　　3.24小时尿蛋白定量比较:两组在治疗前组间比较及治疗后组间比较均无无统计学差异(P＞0.05)。　　4.安全性指标:两组患者安全性指标治疗前后未见明显异常。　　结论:　　1.刺梨冻干粉可有效改善CKD3期患者的中医临床症状。　　2.刺梨冻干粉可下调CKD3期患者的hs-CRP、IL-6、TNF-α的表达，减轻微炎症状态。　　3.刺梨冻干粉临床使用具有安全性。

关键词： Ig A   FcαRI   过敏性紫癜   中性粒细胞   血管内皮细胞   Ig A   FcαRI   CD11b   Syk   PI3K   MIP8a   FcαRI   Ig A  

摘要： 第一部分FcαRI在儿童过敏性紫癜体内表达及其意义目的:观察急性期过敏性紫癜(HSP)患儿Ig A Fc受体FcαRI在外周血及皮肤组织中的表达,了解血清可溶性s FcαRI-Ig A和皮肤组织中FcαRI水平的相关性;同时探讨FcαRI与炎症相关因子的关系及其在儿童急性期HSP发病中的作用。方法:采用Sandwich固相ELISA法、免疫组化及Westernblot等方法,分别检测FcαRI在HSP患儿血清和皮损组织中的表达和分布。直接免疫荧光检测皮损组织中Ig A、C3、Fib的沉积;ELISA检测患儿血清FcαRI相关炎症细胞因子IL-6、TNF-α的水平。结果:1、HSP皮肤组织FcαRI的免疫组化染色显示,HSP各组皮肤组织均有明显FcαRI沉积,强阳性染色见于基底层、颗粒层,皮肤附属器和汗腺导管,中性粒细胞也可见阳性表达,角质层未见FcαRI表达。与对照组比较,HSP各组皮肤组织FcαRI组化染色强度明显增加;急性期HSP患儿皮损处FcαRI免疫组化HSCORE评分平均为205分,显著高于正常对照组(p<0.01)。western blot条带灰度值分析HSP患儿组FcαRI蛋白表达较正常对照显著增加,而HSP组与HSPN组之间无显著性差异(p>0.05)。2、HSP组和HSPN组急性期血清可溶性s FcαRI-Ig A水平较正常对照组明显增高(p<0.01),而HSP组和HSPN组之间无明显统计学差异(p>0.05),血清s FcαRI-Ig A水平与皮肤组织FcαRI表达水平呈正相关(r=0.51,p=0.02)。急性期HSP血清IL-6水平较正常对照组增高(p<0.01),HSP组和HSPN组之间无统计学意义(p>0.05),急性期HSP患儿PBMC上清中TNF-ɑ水平高于正常对照组(p<0.05),HSPN组TNF-ɑ水平高于HSP组(p<0.05)。结论:Ig A受体FcαRI在HSP系统性血管炎症中有重要作用,急性期HSP患儿血清s FcαRI-Ig A水平明显增高,且与皮损中的表达呈正相关,FcαRI相关促炎细胞因子IL-6、TNF-α水平明显增高,FcαRI直接参与了HSP免疫发病过程。第二部分:HSP患儿中性粒细胞活化对血管内皮细胞的影响目的:研究HSP患儿中性粒细胞活化对血管内皮细胞凋亡的影响及促炎细胞因子IL-8、TNF-ɑ在其中的作用,并探讨FcαRI在不同类型配体Ig A作用下对中性粒细胞活化致血管内皮细胞损伤的调控效应。方法:采用流式检测HSP患儿外周血中性粒细胞早期活化标志分子CD11b;q PCR检测外周血中性粒细胞FcαRI m RNA的表达,Western blot检测其蛋白的水平;细胞共培养技术构建HSP患儿中性粒细胞-血管内皮细胞炎症模型,分别加入m Ig A、p Ig A干预,流式观察m Ig A、p Ig A作用下HUVEC的凋亡;ELISA检测细胞上清IL-8、TNF-α水平。结果:1、HSP组中性粒细胞FcαRI的m RNA表达与正常对照组比较无统计学差异(P=0.98),FcαRI蛋白表达较正常对照显著降低(p<0.05),western blot条带灰度值分析显示HSP患儿较正常对照组降低,急性期HSP患儿中性粒细胞CD11b的平均荧光强度(MFI)显著高于正常对照组(p<0.01)。2、HUVEC+HSP Neu+p Ig A组血管内皮细胞平均凋亡率达63.99%,较HUVEC+HSP Neu+m Ig A组(27.07%)显著增高(p<0.01),HUVEC+HSP Neu+p Ig A组血管内皮细胞平均凋亡率高于HUVEC+HSP Neu+PBS组(34.9%)(p=0.01),HUVEC+HSP Neu+m Ig A组凋亡率低于HUVEC+HSP Neu+PBS组,但无统计学差异(p>0.05)。3、HUVEC+HSP Neu+p Ig A组细胞上清IL-8,TNF-α的水平显著高于HUVEC+HSP Neu+m Ig A组(p<0.01,p<0.01),较HUVEC+HSP Neu+PBS组也增高(p<0.05,p<0.05);HUVEC+HSP Neu+m Ig A组细胞上清IL-8,TNF-α水平较HUVEC+HSP Neu+PBS组降低,但无统计学意义(p>0.05,p>0.05)。结论:1、急性期HSP中性粒细胞FcαRI在转录水平正常,但在蛋白水平较正常对照降低。中性粒细胞活化早期表达的粘附分子CD11b增高,可促进中性粒细胞向血管内皮细胞的粘附和迁移。2、急性期HSP中性粒细胞可诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC发生凋亡,p Ig A对中性粒细胞介导的HUVEC凋亡具有促炎效应;m Ig A对中性粒细胞介导的血管内皮细胞凋亡可能具有抑制效应。p

关键词： 宫内感染   肺损伤   NLRP3   MicroRNA   微阵列  

摘要： 宫内感染可导致宫内炎症,不仅是早产重要的独立危险因素,而且是支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的重要病因,但是其中的分子机制尚未明确。近年来,尽管呼吸系统疾病研究中发现MicroRNA(miRNA)参与呼吸系统发育调控、病原感染、炎症、纤维化和肿瘤形成等多种病理生理过程,但是关于miRNA参与宫内感染/炎症诱发肺发育损伤的研究甚少,关于宫内感染/炎症诱发肺发育损伤后肺组织miRNA表达谱变化特征的研究尚未见报道。目的:研究宫内感染/炎症对不同时间点胎鼠和新生大鼠肺组织发育的影响及其机制,探索宫内感染/炎症后新生大鼠肺组织miRNA表达谱变化特征,筛选出肺发育损伤相关的miRNA并预测其靶基因。方法:1.利用SD孕鼠宫颈接种大肠杆菌建立宫内感染/炎症的动物模型并作为宫内感染组,对照组接种生理盐水。2.以孕17、19、21日胎龄和生后1、3、7、14日龄为观测时间点,检测两组各时间点胎鼠或新生大鼠的体重、肺重、肺重/体重、肺组织病理HE染色检查,以免疫组织化学方法、荧光定量PCR方法和Western blot方法检测胎鼠和新生大鼠肺组织,研究指标包括NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF、Collagen Ⅰ、SP-A、SP-B和SP-C等表达水平。3.采用miRNA微阵列(芯片)技术检测两组1、3、14日龄新生大鼠肺组织1218种miRNA的表迖谱,筛选出相关miRNA。4.选取miRNA芯片结果中两组表达差异显著的miRNA作指标,以荧光定量PCR方法对芯片结果进行验证。5.应用TargetScan在线靶基因预测软件,对芯片检测结果中筛选出的相关miRNA作靶基因预测。结果:1.动物模型和仔鼠情况:24只SD孕鼠在接种大肠杆菌混悬液或生理盐水前后活动和进食无明显变化,两组自然分娩时间均为21～22天。仔鼠情况:宫内感染组获得77(77/79)(存活仔鼠/总仔鼠)只胎鼠和48(48/51)只新生大鼠;对照组获得76(76/78)只胎鼠和52(52/53)只新生大鼠。两组中胎鼠和新生大鼠死产率无差异。宫内感染组孕鼠的胎盘和子宫壁血管充血、水肿,并见大量中性粒细胞浸润;对照组孕鼠的子宫和胎盘病理检查均未见明显的炎症表现。2.仔鼠生长发育表型测定发现:宫内感染组17、19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3日龄的新生大鼠体重较对照组减轻;17、19、21日胎龄的胎肺重量和生后1、3、7日龄的新生大鼠肺重较对照组减轻;17、19、21日胎龄的胎鼠肺重/体重比值较对照组减轻。3.肺组织HE染色病理学检查:与对照组相比,宫内感染组胎鼠肺内炎性细胞浸润,囊泡状结构和肺泡数目减少,肺泡隔数目减少,肺泡隔结构增厚;与对照组相比,宫内感染组新生大鼠肺组织炎性细胞浸润,肺泡数目减少,肺泡隔增厚。4.肺组织NLRP3检测:免疫组织化学检测和荧光定量PCR检测均发现,宫内感染组17、19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3、14日龄的新生大鼠NLRP3表达水平较对照组增高。Westernblot检测发现,宫内感染组19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3、14日龄的新生大鼠肺组织NLRP3蛋白表达较对照组上调。5.肺组织炎症因子检测:荧光定量PCR检测发现,宫内感染组17、19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3日龄的新生大鼠肺组织TNF-α mRNA表达水平较对照组增高;宫内感染组17、19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3、7日龄的新生大鼠IL-1β mRNA表达水平较对照组增高;宫内感染组17、21日胎龄的胎鼠和生后1日的新生大鼠IL-6mRNA表达水平较对照组增高。6.肺表面活性物质蛋白检测:荧光定量PCR检测发现,宫内感染组19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3、14日龄的新生大鼠SP-AmRNA表达水平较对照组降低;宫内感染组19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3日的新生大鼠SP-BmRNA表达水平较对照组降低;宫内感染组17、19、21日胎龄的胎鼠和生后1、7日的新生大鼠SP-CmRNA表达水平较对照组降低。Western blot检测发现,宫内感染组17、19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3、14日龄的新生大鼠SP-A蛋白表达较对照组下调;宫内感染组19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3日龄的新生大鼠SP-B蛋白表达较对照组下调;宫内感染组17、19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3、7日龄的新生大鼠SP-C蛋白表达较对照组下调。7.肺组织VEGF检测:免疫组织化学染色检测发现,宫内感染组17、19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3日龄的新生大鼠肺组织VEGF免疫组织化学染色强度较对照组减低;免疫荧光PCR和Western blot检测均发现,宫内感染组19、21日胎龄的胎鼠和生后1、3、7日龄的新生大鼠VEGF表达水平较对照

关键词： JAK/STAT信号通路   Th17   补肾法   活血法   清热法   强直性脊柱炎  

摘要： 背景：强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是目前世界性的难治性免疫系统疾病,以骶髂关节炎和脊柱强直为主要特点。炎症、骨破坏和新骨形成是AS三个典型病理改变。AS的炎症主要发生在脊柱、骶髂关节及周围的肌腱韧带等组织,随着炎症侵蚀,会逐渐影响骨皮质,引起骨破坏,骨破坏后又会继发新骨形成,致使骶髂关节融合,形成方形椎,引起脊柱竹节样变,从而导致残疾。因此炎症是导致AS残疾的首要环节,控制炎症是国际AS治疗学的研究重点,是延缓AS病情进展、保护关节功能与防止致残的关键。Th17是一群能够特异性分泌白介素17(IL-17)的T辅助性细胞亚群,主要通过分泌的炎性因子来促进中性粒细胞的动员、募集和活化,介导促炎症反应,启动急性炎症。其中最主要的效应因子是IL-17, IL-17可通过与不同的细胞上的IL-17受体(IL-17R)结合,促进促炎介质及趋化因子的释放,从而开启多种致炎途径,是介导AS炎症的关键因子。IL-17的分泌和Th17的分化、扩增均离不开IL-23的诱导刺激。IL-23可通过与已分化的Th17表面的IL-23受体结合后,通过JAK2/STAT3信号通路途径活化STAT3,同源STAT3二聚体化进入细胞核后一方面可以与Th17的特异性转录因子RORc结合,开启了Th17的分化,一方面可以与IL-17的启动子结合,开启的IL-17的合成和分泌。因此,IL-23/Th17炎症轴在AS炎症中发挥了重要作用,通过JAK/STAT信号通路可以调控Th17的分化,是临床治疗AS炎症的靶目标。中医认为强直性脊柱炎的病机为先天禀赋不足,肾督亏虚,风寒湿热等外邪乘虚而入,内外合邪,致使督脉受邪而骨失淖泽形成脊柱佝偻；痹证日久,脏腑功能失调,气血交阻,瘀血乃生：故肾精亏虚,湿热痹阻,痰瘀互结为其基本病因病机。补肾之法能够滋养肾精、生髓壮骨,可调整阴阳,恢复机体的平衡；清热之法可使内伏之热邪得以清解,从而使经络气血通畅,关节肌肉得以濡养,改善活动期AS症状,阻止病情的进展；通过活血化瘀,可使气血调和,经脉畅通,既可消除瘀血病因,又可改善与其有关的病理变化：故补肾、清热、活血法为强直性脊柱炎的基本治法。我们在前期研究中发现补肾活血法、清热活血法治疗AS临床疗效满意,在控制AS炎症及病情活动方面发挥重要作用；针对AS炎症始动环节,初步证实清热活血法通过干预Th17分化、抑制IL-17分泌而发挥抗炎作用。因此,本研究在前期研究基础上将继续探索补肾、清热、活血三种治法通过JAK/STAT信号通路对Thl7分化的影响,了解其干预炎症的可能分子机制。从炎症靶细胞Th17视角探索补肾、清热、活血法治疗AS分子机制,解释了补肾、清热、活血法干预免疫应答的科学内涵。目的：从JAK/STAT信号通路调控Th17分化,探索补肾、清热、活血法干预AS炎症的可能分子机制,为中医药治疗AS的临床研究提供思路方法：15例活动期AS患者(18-60岁,平均年龄为33.73±8.35岁,BASDAI≥4)均来自广安门医院门诊或住院病人,15例正常对照(18-60岁,平均年龄为23.82±3.25岁)为健康体检者。提取活动期患者及健康人外周血单个核细胞,将不同剂量淫羊藿苷、苦参碱、丹参酮与活动期患者外周血单个核细胞共同孵育24小时。运用蛋白印迹法(western blotting,WB)检测每组JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3及RORc蛋白表达水平；运用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测每组RORc mRNA表达水平。结果：1、活动期AS患者组JAK2、STAT3的蛋白总量虽然较正常对照组无明显改变(JAK2: p>0.05; STAT3>0.05),但磷酸化pJAK2、pSTAT3显著升高(pJAK2:p<0.05;pSTAT3: p<0.05);RORc蛋白表达量及mRNA表达水平显著升高(蛋白：p<0.05;mRNA:p <0.05)。2、经淫羊藿苷、苦参碱、丹参酮干预后的活动期AS-PBMC中,JAK2蛋白总量较活动期AS组无明显改变(淫羊藿小中剂量组JAK2:p>0.05;苦参碱小中大剂量组JAK2: p>0.05;丹参酮ⅡA大剂量组JAK2:p>0.05);STAT3蛋白总量较活动期AS组无明显改变(淫羊藿小中剂量组STAT3:p>0.05;苦参碱小中剂量组STAT3:p>0.05;丹参酮ⅡA小中大剂量组STAT3:p>0.05)。3、经淫羊藿苷、苦参碱、丹参酮干预后磷酸化pJAK2较活动期AS组显著降低(淫羊藿小中大剂量组pJAK2:p<0.05;苦参碱小中剂量组pJAK2:p<0.05;丹参酮ⅡA中大剂量组pJAK2:p<0.05); pSTAT3较活动期AS组显著降

关键词： 人脐静脉内皮细胞系EA.hy926   乌司他丁   肿瘤坏死因子-α   高通透性   Rho/ROCK信号通路   乌司他丁   脂多糖   肺损伤   血管钙黏蛋白   Rho/ROCK信号通路  

摘要： 第一部分:乌司他丁对TNF-α作用下***926细胞通透性的影响及相关机制的研究目的:探讨乌司他丁(UTI)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所致血管内皮细胞通透性增加的影响及其主要的分子机制。方法:以TNF-α干预人脐静脉内皮细胞株***926,建立炎症刺激的细胞模型,用UTI干预***926细胞,构建Rho A过表达慢病毒,采用Transwell法、TEER法检测细胞通透性;免疫荧光法测肌球蛋白磷酸酶结合亚基1(p-MYPT1)的表达及细胞纤维肌动蛋白(F-actin)形态及分布;分别采用免疫细胞化学法、Western Blot法及q RT-PCR法检测与通透性相关的关键分子Rho A、Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶Ⅱ(ROCK2)、MYPT1、p-MYPT1及内皮血管钙黏蛋白(VE-cadherin)表达的变化情况。结果:***-α作用下***926单层细胞电阻值明显降低,细胞通透性显著升高(P<0.05),细胞内p-MYPT1的表达量较正常组明显增加,F-actin细胞骨架明显重新分布,细胞内应力纤维增多,VE-cadherin的表达量明显降低,而UTI可改善***926的上述变化情况;2.免疫细胞化学及Western Blot结果均显示,与正常对照组比较,TNF-α使Rho A、ROCK2的表达明显增加(均P<0.05),而UTI可抑制这两种蛋白的高表达;3.与未转染病毒细胞相比,UTI和TNF-α作用下,Rho A过表达使细胞内Rho A、ROCK2及p-MYPT1的表达显著增高,VE-cadherin表达降低,细胞通透性增加(均P<0.05);而空载对照病毒对Rho A、ROCK2、p-MYPT1和VE-cadherin的表达以及细胞通透性无明显影响(均P>0.05)。结论:UTI以剂量依赖性方式抑制TNF-α引起的***926细胞通透性增加,这一作用可能与Rho/ROCK信号通路有关。第二部分:乌司他丁对脂多糖诱导脓毒症小鼠肺损伤的保护作用及其可能机制目的:探讨乌司他丁(UTI)对脂多糖(LPS)诱导脓毒症小鼠肺损伤的保护作用及其可能机制。方法:1.将C57BL/6小鼠随机分为对照组(Con组,n=10)、模型组(LPS组,n=10)及UTI干预组(L+U组,n=30),建立LPS脓毒症小鼠模型;2.采用肺组织肺湿干重比(W/D)法及伊文思蓝染色(Evans Blue,EB)法观察各组小鼠肺组织含水量及肺微血管通透性的变化;***染色法检测各组小鼠肺组织病理变化;4.免疫组化法检测肺组织VE-cadherin及ROCK2表达水平的变化。结果:1.与对照组比较,LPS组小鼠肺组织W/D及EB含量均显著增加(均P<0.05),而UTI干预组W/D及EB含量明显降低,其中UTI在104 U/kg、105 U/kg剂量时,与LPS组相比,有统计学差异(均P<0.05);2.与对照组小鼠肺组织相比,LPS组小鼠肺组织水肿,损伤严重,而UTI干预组肺组织损伤明显减轻;3.免疫组化结果显示,LPS组小鼠肺组织VE-cadherin的表达明显降低,ROCK2的表达明显增高(均P<0.05),而UTI干预后,VE-cadherin的表达显著增加,ROCK2的表达显著下降(均P<0.05)。结论:UTI以一定的剂量依赖性降低LPS所致的肺毛细血管通透性增加,从而改善脓毒症小鼠肺损伤,这一作用可能与UTI抑制Rho/ROCK信号通路的激活有关。

关键词： 经口急性砷暴露   肺组织   炎症反应   MAPK通路   转录因子-κB   Nrf2信号通路  

摘要： 目的:　　砷是一种有毒的类金属元素，广泛存在于地壳、土壤、海水、大气和食物中。早在1987年，砷及其化合物就被国际癌症研究机构(international agency forresearch on cancer，IARC)确认为人类Ⅰ类致癌物，损伤机体多种组织、器官或系统。砷作为一种全身性毒物，慢性饮水无机砷暴露可以引起皮肤过度角化、色素沉着、神经系统损伤以及皮肤、膀胱、肺、肝等实质器官肿瘤，此外还与糖尿病、心脑血管疾病等发病风险的增加有关。砷的广泛分布及其对机体造成的许多不良影响，使得砷暴露对人类健康的危害已经成为世界严重的公共卫生问题。　　呼吸道吸入砷作为职业性砷暴露的重要途径，主要集中在一些农业和工业发达的国家和地区，沿海地区主要是通过水生食物摄入有机砷，而通过饮水方式摄入则是广大砷病区人群无机砷暴露的最主要途径。有趣的是，无论是呼吸道吸入还是消化道摄取，流行病学调查发现无机砷暴露都可以诱导肺癌高发，其主要取决于无机砷的吸入/摄入剂量。无论何种途径的砷暴露都使得肺组织成为砷毒性最敏感的器官之一，长期饮水砷暴露与肺癌发病率之间存在明显的剂量-反应关系。此外，越来越多的证据表明长期接触无机砷还会降低肺功能、增加罹患肺部疾病的风险，增加支气管扩张。尤其在胎儿、婴儿时期砷暴露，会明显增加肺部机会性致病菌感染风险，引起肺结核、呼吸道感染等疾病的发生，表现为炎症、不可逆性支气管损伤以及呼吸衰竭等。　　砷暴露还被证实可活化一些转录因子，例如AP-1、HIFs、NF-κB以及Nrf2等，这些转录因子都参与各种炎症介质的合成及其生理调控。NF-κB作为调控炎症反应的经典信号通路，研究表明无机砷暴露使IκB磷酸化，激活NF-κB，启动下游靶基因转录，促进炎性介质(IL-1β、IL-6和TNF-α)的分泌，在免疫和炎症反应中发挥重要作用。也有报道称在砷暴露诱导炎症反应中，MAPK信号通路，主要是细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基未端激酶(c-Jun N-Terminal kinase，JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)，参与调节炎症因子的基因转录，发挥其对炎症反应的调控作用。有研究表明，P38MAPK的激活可以使巨噬细胞产生大量炎性介质，与JNK一起通过c-jun磷酸化激活AP-1，进而调控IL-6和TNF-α的释放。磷酸化的P38和JNK表达降低时可抑制促炎细胞因子的IL-1β、IL-6和TNF-α分泌。　　综上所述，目前针对砷诱导肺炎症反应的研究主要集中在细胞学实验，少数体内实验研究也主要采用气道吸入式染毒，模拟人群饮水砷暴露方式的经口砷暴露的整体动物实验尚未见报道。砷暴露诱导肺组织免疫/炎症反应相关作用机理亦尚不清楚。本研究以亚砷酸钠(sodium arsenite，NaAsO2)为处理因素，观察经口急性无机砷暴露对C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及肺组织的炎症反应、Th1/Th2细胞因子和相关转录因子以及MAPK、Nrf2等信号通路的可能影响，试图探讨饮水砷暴露诱发小鼠肺免疫炎性反应及其可能机制，为深入研究无机砷致肺部疾病和肺癌的发病机制提供新的实验基础。　　方法:　　1、实验动物与分组:　　健康C57BL/6雌性小鼠100只，适应性饲养1周后，将小鼠按体重随机按数字表分组。采用一次性灌胃方式染毒，染毒浓度分别为2.5 mg/kg、5 mg/kg和10mg/kg NaAsO2，对照组采用生理盐水灌胃，染毒时间分别为6、12、24 h，共计10组，每组10只。染毒期间各组小鼠均喂养普通饲料。染毒终点，眼球取血，提取BALF并摘取肺组织，部分甲醛固定，用于病理实验;部分保存于-80℃备用。　　2、检测指标与方法:　　(1)肺组织砷含量测定:高效液相色谱-氢化物发生-原子吸收测定法　　(2)肺组织病理改变:采用HE染色的方法　　(3)BALF中细胞数目和形态:Countstar细胞计数和Diff-Quik染色　　(4)BALF中蛋白浓度和细胞因子含量的检测:采用BCA试剂盒和ELISA检测试剂盒　　(5)肺组织氧化应激检测:采用南京建成公司试剂盒测定肺组织MDA含量、GSH-Px和CAT活力　　(6)肺组织炎性损伤检测:采用南京建成公司试剂盒测定肺组织MPO活力;RT-PCR法检测肺组织中Th1/Th2相关细胞因子(T-bet、IL-2、IFN-γ、GATA-3、IL-4、IL-10)和炎性细胞因子(IL-1β、IL-6和MIP-2)基因的mRNA表达水平　　(7)肺组织MAPK和Nrf2信号通路蛋白

关键词： 经皮肾镜碎石术   尿源性脓毒血症   全身炎症反应综合征   高危因素  

摘要： 研究目的:泌尿系统结石是泌尿外科的常见病、多发病,其中肾结石和输尿管上段结石是经皮肾镜碎石术(percutaneous nephrolithotomy,PCNL)治疗这类疾病最常用的手术方式之一,具有高效、安全、结石清除率高等特点,已在临床上广泛开展使用[1,2],但是,PCNL术后常出现一系列并发症,如出血,感染,水中毒,肾盂输尿管连接部狭窄,尿外渗等,其中感染是最严重的并发症,可危及生命,而伴有感染的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),即证实有细菌存在或有高度可疑感染病灶,为脓毒血症。因此,当PCNL术后SIRS伴感染者即演变为尿源性脓毒血症,大大增加了患者病死率、住院时间及治疗费用。在关于PCNL的研究中,尿源性脓毒血症是报道最多的围手术期死亡原因,因此受到越来越多的泌尿外科医生及麻醉医生的关注[3]。有文献报道,约有21.0～32.1%的患者术后并发发热症状,约有0.3～4.7%患者进展成为尿源性脓毒血症,进而成为感染性休克或多器官功能衰竭,甚至死亡[4,5]。本研究通过556例行PCNL的患者进行回顾性分析,以了解PCNL术后发生全身炎症反应综合征的危险因素,探讨围手术期的麻醉相关因素及防治策略。研究方法:通过采集2015年3月1日～2016年2月29日556例在我院行经皮肾镜碎石术的肾结石患者的病历资料,选取性别、糖尿病史、尿常规及尿培养结果、结石手术史、术中低血压、铸型结石、术前肾积水、年龄、术前肌酐、结石大小、手术时间、术中补液量、拔管时间、恢复室体温(患者刚入复苏室时所测量的体温)等因素,应用logistic回归分析的方法研究经皮肾镜碎石术后发生全身炎症反应综合征的高危因素及麻醉相关因素。研究结果:本研究共纳入556例患者,共有81例(14.6%)患者术后发生了 SIRS。其中非SIRS组(475例)的男性293例,女性182例,平均年龄52.84±11.31岁;包括铸型结石3例,术前尿常规阳性414例;尿培养阳性率51例,血肌酐89.46±46.49U/L,结石直径1.54±0.75cm,肾积水374例。SIRS组(81例)的男性40例,女性41例,平均年龄52.71±11.33岁;铸型结石12例,术前尿常规阳性73例;术前中段尿培养阳性率24例,血肌酐106.18±91.15U/L例,结石直径1.78±0.73cm,肾积水62例。麻醉及复苏情况:非SIRS组(475例)术中低血压发生率115例,术中补液量1158.69±350.38ml,手术时间61.86±21.61min,拔管时间30.45±21.66min,复苏室体温平均36.102±0.506℃。SIRS组(81例)术中低血压发生率40例,术中补液量1018.52±320.59ml,手术时间70.51±30.5min,拔管时间31.37±19.26min,复苏室体温平均35.998±0.589℃。单因素logistic回归分析发现术前肌酐是否异常、结石大小、是否铸型结石、是否中段尿培养阳性、是否女性、是否尿常规阳性、是否有术中低血压、术中补液量、手术时间及恢复室体温共10个因素的P值<0.1(以P值=0.1为限,>0.1需剔除)。再选取这10个因素做多因素logistic回归,结果显示术前肌酐异常、结石大小、铸型结石、中段尿培养阳性及术中低血压是PCNL术后发生全身炎症反应综合征的高危因素。研究结论:术前肌酐异常、结石大小、铸型结石、中段尿培养阳性及术中低血压是PCNL术后发生全身炎症反应综合症的高危因素,从而根据麻醉相关因素着手,加强围手术期的麻醉监管,提高防治策略的认识。

关键词： 乳腺癌   围手术期   中医药   引流液   炎症状态  

摘要： 目的：通过观察三黄煎剂改善乳腺癌围手术期患者炎症反应临床功效,探讨其促进患者术后恢复与降低肿瘤复发转移的相关关系。方法：将30例乳腺癌患者随机分为治疗组与对照组,每组病例数各15例。实验组在基础治疗同时于术后当日起至术后第7天口服三黄煎剂,对照组予以基础治疗,两组均采用均衡的围手术期治疗方式。分别于手术当日、术后第1日、第3日、第7日评估中医症状、局部炎症症状、全身炎症症状进行,同时监测腋窝引流液的量并测定引流液及血液中的炎症与应激相关因子水平(IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、TAOC)。结果：1.治疗组对中医气虚血瘀证症状有明显改善,与对照组相比,术后7天症状积分有显著差异(P<0.05)。2.治疗组对局部炎症症状有明显改善,其术后7天症状积分明显低于对照组,存在统计学意义(P<0.05)。3.对全身炎症症状无明显影响,乳腺癌围手术期患者未出现明显全身炎症症状(P<0.05)。4治疗组对血清中炎症因子水平的下降均有明显作用,术后7天炎症因子水平(IL-2R、IL-6、IL-8、TNF-α、CRP)明显低于对照组。术后7天总抗氧化能力(TAOC)明显高于对照组。二者之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。5.治疗组明显降低引流液中炎症因子水平,术后7天炎症因子水平(IL-2、 IL-6、IL-8、TNF-α、CRP)明显低于对照组。治疗组术后7天总抗氧化能力(TAOC)明显高于对照组。二者间的差异存在统计学意义(P<0.05)。结论：三黄煎剂可有效的降低乳腺癌围手术期患者血清及引流液中的炎症因子水平,即时改善术后中医气虚血瘀症状、局部炎症反应。有利于术后恢复及降低复发转移的风险。