关键词： 激动剂   紧密连接   肠上皮   二甲双胍   DSS   炎症状态   重激活  

摘要： 炎性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBD)主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。临床主要表现为体重减少,血便及腹部疼痛。炎性肠病不仅会严重影响病人的生活质量,而且久治不愈会大大增加患结肠癌的风险。因此,阐明肠炎发生发展过程中的分子靶标,寻找安全高效的治疗药物,对炎性肠病的治疗具有重要意义。本研究发现小鼠在溃疡性结肠炎发生后,肠组织中腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的磷酸化水平逐渐降低,与肠组织的损伤程度呈正相关。给予AMPK激动剂二甲双胍后,组织中的p-AMPK水平显著升高。我们进一步发现,二甲双胍能改善小鼠的溃疡性结肠炎,表现为明显逆转小鼠体重下降、腹泻、血便以及结肠病理评分和显著抑制结肠组织中炎性因子IL-18,IL-1β,COX-2,iNOS和IL-6的mRNA水平。不仅如此,我们发现AMPK激动剂二甲双胍对结肠炎的这一治疗功效与其对小鼠肠上皮紧密连接的维持作用是密不可分的。肠组织发生炎性损伤后,肠上皮紧密连接蛋白Claudin-1,Occludin和Zonula Occludens-1(ZO-1)的表达水平下降,肠上皮通透性增加;而二甲双胍能显著逆转这一病理变化。我们利用体外肠上皮Caco-2细胞模型对二甲双胍促进紧密连接功能的机制进行了进一步研究。我们还发现二甲双胍可能促进AMPK磷酸化水平升高,进而导致Connexin43(Cx43)蛋白在丝氨酸368位发生磷酸化;因而Cx43与膜蛋白ZO-1结合降低并进入胞浆,使细胞膜上的ZO-1形成更为稳定的紧密连接。综上,本论文实验结果证明二甲双胍对硫酸葡聚糖钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠急性肠炎有较好的治疗效果,其机制可能是通过促进AMPK磷酸化,从而升高p-Cx43(Ser368)水平,促进ZO-1形成紧密连接。这些发现揭示了在肠上皮的结构维持和功能中,能量平衡调控分子AMPK可能发挥了重要的作用。本研究为炎性肠病的治疗提供了新的药物靶标和候选药物。

关键词： 长链非编码RNA   肾小球系膜细胞   炎症   纤维化   增殖   Gm4419   NF-κB   NLRP3炎症小体   炎症   肾小球系膜细胞  

摘要： 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为终末期肾病的主要原因,是糖尿病的常见并发症之一。近年来,研究证据表明核转录因子Kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活和含有热蛋白结构域的甘氨酸结合及寡聚结构域样受体3炎症因子(NACHT,LRR and PYD domain-containing protein 3,NLRP3炎症小体)在糖尿病肾病的炎症进展过程密切相关。然而,它们的机体作用机制尚不清楚。近年来研究显示,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)异常表达在糖尿病肾病等多种疾病中扮演着重要角色。然而,lnc RNA在糖尿病肾病的炎症过程中的功能和作用机制仍未揭开神秘面纱。在我们课题组前期实验中,我们通过转录组测序技术(RNA sequencing,RNA-seq)和实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)在糖尿病肾病db/db小鼠肾脏组织中鉴别了14个呈异常表达的lnc RNAs。在目前的实验中,我们进一步通过q RT-PCR检测这14个糖尿病肾病相关的lnc RNAs在高、低糖条件下培养的系膜细胞中的表达情况,实验结果显示其中12个lnc RNA在肾脏组织和系膜细胞中的表达趋势一致。我们通过生物信息学预测进一步发现在这12个异常表达的lnc RNAs中,只有上调差异倍数最大的基因间长链非编码RNA Gm4419与糖尿病肾病炎症相关的NF-κB亚基p65和p50存在潜在的结合位点点。此外,沉默Gm4419能够明显抑制高糖条件下培养的系膜细胞促炎症因子、肾脏纤维标记蛋白的表达和细胞增殖。然而过表达Gm4419能够促进低糖条件下培养的系膜细胞的系膜细胞的促炎症因子、肾脏纤维标记蛋白的表达和细胞增殖。更有趣的是,Gm4419通过直接与NF-κB的亚基p50相互作用激活NF-κB通路。另外,我们发现在系膜细胞中p50能直接作用于NLRP3炎症小体。因此,我们用以下实验展示,linc RNA Gm4419可能通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路参与高糖条件下培养的系膜细胞炎症、纤维化和增殖,这可能为Gm4419在糖尿病肾病的进展过程中的调控机制提供新视角。第一部分Gm4419在小鼠肾小球系膜细胞中的表达、分布及对系膜细胞炎症、纤维化和增殖的影响目的检测高、低糖培养的小鼠肾小球系膜细胞中Gm4419的表达、分布以及Gm4419对高、低糖培养的系膜细胞炎症、纤维化和增殖的影响,初步探讨Gm4419与糖尿病肾病的关系。方法通过q RT-PCR检测14个糖尿病肾病相关的lnc RNAs在高、低糖条件下培养的系膜细胞中的表达情况,并从中选取上调差异倍数最大,且生物信息学预测唯一与糖尿病肾病炎症相关的NF-κB有绑定位点的lnc RNA Gm4419为研究对象。FISH和q RT-PCR检测Gm4419在系膜细胞中的定位;构建pc DNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒,同时设计合成Gm4419 si RNA,并将pc DNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒和Gm4419 si RNA分别转染至低、高糖培养的肾小球系膜细胞,q RT-PCR检测促炎症因子和肾脏纤维标记蛋白的m RNA表达水平;western blot和免疫荧光检测促炎症因子和肾脏纤维标记蛋白的蛋白表达水平情况;Ed U法和流式细胞术检测转染后细胞的增殖能力。结果Gm4419在高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平较L-MC组显著增高(p<0.01)。将酶切和测序结果证实构建成功的pc DNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒转染至L-MC组细胞,与L-MC mock组或L-MC pc DNA3.1组相比,L-MC Gm4419(+)组细胞炎症因子、纤维化标记蛋白表达水平增高以及增殖能力增强((p<0.05)。此外,q RT-PCR筛选出一条最佳干扰Gm4419的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),转染H-MC组后,与H-MC mock组或H-MC si NC比较,H-MC Gm4419 si RNA组细胞炎症因子、纤维化标记蛋白表达水平增高以及增殖能力减少(p<0.05)。结论lnc RNA-Gm4419参与糖尿病肾病小鼠肾小球系膜炎症、增生和纤维化的调节。第二部分Gm4419通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路调控肾小球系膜细胞中促炎症因子的表达目的探讨调节Gm4419的表达对NF-κB/NLRP3炎症小体信号途径激活的调控及对下游促炎症因子、纤维标记蛋白和系膜细胞增殖的影响。方法通过q RT-PCR检测小鼠肾小球系膜细胞在低糖条件下转染Gm441

关键词： 不明原因复发性流产   母胎免疫耐受   强的松   IL-23/IL-17  

摘要： 研究目的:我们前期研究发现,不明原因复发性流产(Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion,URSA)患者外周血及蜕膜组织中Th17细胞及其相关细胞因子白介素-17(IL-17)、IL-23水平明显高于正常妊娠者。IL-17/IL-23作为经典的炎症轴,已被证实在自身免疫性疾病的病理过程中发挥重要的作用,从而成为相关免疫性疾病治疗的新靶点,而URSA被认为与母胎免疫失衡有关。强的松用于治疗反复胚胎移植失败和复发性流产取得一定疗效,但并未得到广泛认可。本研究以小鼠脾淋巴细胞为实验对象,通过体外细胞培养的方法,利用细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-23刺激淋巴细胞向Th17方向分化,诱导母胎免疫排斥反应的细胞模型,观察强的松对IL-17分泌的影响以及对IL-23/IL-17炎症轴的调节作用,探讨强的松治疗治疗反复胚胎移植失败和复发性流产可能的作用机制,为强的松治疗妊娠失败提供基础理论依据。研究方法:取昆明小鼠,分离脾脏淋巴细胞制成单细胞悬液,并以抗CD3抗体,抗CD28抗体刺激其体外增殖,MTT法检测不同浓度强的松对小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响。另取小鼠脾淋巴细胞分4组,对照组A组用空白培养液、B组用最佳稀释浓度的强的松含药培养液培养,两组细胞培养24h后,换含有TGF-β1、IL-6、IL-23的培养液继续培养48h;C、D组淋巴细胞培养体系中,先用含TGF-β1、IL-6、IL-23培养液培养48h后,C组改用最佳稀释浓度含药培养液,D组改用空白培养液继续培养24h。分别收集不同处理组细胞培养上清液,ELISA检测上清液中IL-17的含量;收集细胞采用Real-Time PCR检测IL-17m RNA、IL-23m RNA的表达水平。研究结果:在0.001μM强的松低浓度下,对小鼠脾淋巴细胞的增殖即出现抑制作用,并与浓度存在一定量效关系。浓度为在0.01-10μM时,对淋巴细胞增殖的抑制作用无差异(P>0.05),当浓度高于100μM时,淋巴细胞增殖受到明显抑制,并且随着浓度增大,抑制作用更加明显。ELISA检测显示,B组IL-17含量低于其他3组(P<0.01),C组IL-17含量低于A组,D组(P<0.01)。B组IL-17m RNA表达量低于A组降低(P<0.05),A、B两组IL-23m RNA表达量比较,差异无统计学差异意义;C组IL-17m RNA、IL-23m RNA表达量低于D组(P<0.05)。研究结论:强的松能够抑制淋巴细胞的增殖,当机体免疫系统失衡促炎因子高表达时,强的松能够抑制IL-17分泌,下调IL-17、IL-23促炎因子基因的表达水平,减弱免疫排斥反应,可能是其治疗相关免疫性疾病的作用机制之一,该结果为强的松治疗由IL-23/IL-17介导的母胎免疫炎症反应提供了一定的理论依据。

关键词： 糖尿病   老年患者   血液透析   营养状态  

摘要： 目的:探讨高通量血液透析对老年糖尿病患者微炎症状况及营养状态的影响。方法:选取2015年1月至2016年12月本院收治的行高通量血液透析的糖尿病老年患者50例,比较本组患者治疗前后的hs-CRP、IL-6、TNF-α、BMI、TP和ALB。结果:经过治疗后,本组患者的hs-CRP水平为(16.48±5.42)mg/L、TNF-α水平为(4.24±1.02)ug/L均低于治疗前的(19.25±8.16)mg/L、(8.15±1.83)ug/L,差异均具有统计学意义(P<0.05);治疗后的IL-6水平为(52.71±7.89)ng/L,高于治疗前的(37.88±6.78)ng/L,差异具有统计学意义(P<0.05);经过治疗后,本组患者的BMI水平为(25.16±2.81)kg/m2、TP水平为(70.83±3.32)g/L、ALB水平为(38.13±0.69)g/L,均高于治疗前的(21.07±0.55)kg/m2、(59.17±5.75)g/L、(29.01±0.52)g/L,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:高通量血液透析可明显改善患者的营养状况及减轻患者的微炎症状态。

关键词： 经皮肾镜碎石术   全身炎症反应综合征   糖尿病   影响因素  

摘要： 目的探讨经皮肾镜碎石术(percutaneous nephrolithotomy,PCNL)术后发生全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的危险因素,以便更好地预防临床中PCNL术后SIRS的发生。方法收集山东大学齐鲁医院泌尿外科2014年1月—2016年10月收治的泌尿系结石并行PCNL的患者信息。根据术后是否发生SIRS分为SIRS组和非SIRS组。分析比较2组患者间性别、年龄、糖尿病史、手术时间、结石大小、单发或多发结石、肾积水和术前尿培养结果与术后SIRS的相关性,探讨SIRS的危险因素。统计分析采用描述性统计分析、单因素分析(卡方分析、独立样本t检验)和多因素Logistic回归分析。结果本研究共入选190例患者,术后SIRS共发生40例(21.1%)。单因素分析的结果显示,糖尿病史(p=0.023)、手术时间(p=0.034)、结石大小(p<0.001)和术前尿培养(p<0.001)与PCNL术后SIRS发生之间显著相关,患者性别、年龄、单发或多发结石、是否合并肾积水与PCNL术后SIRS发生无明显相关性(p>0.05)。纳入糖尿病史、手术时间、结石大小和术前尿培养4个因素的logistic回归中,糖尿病史和结石大小是SIRS的独立危险因素。ROC曲线显示结石大小和糖尿病史两因素具有一定的联合预测价值(AUC=0.743,95%CI:0.653-0.833)。结论PCNL术后SIRS的发生与患者有无糖尿病及结石大小有密切关系,需引起泌尿外科医生高度重视。

关键词： 不同血液净化模式   终末期糖尿病肾病   胰岛素抵抗   微炎症状态  

摘要： 目的本次实验课题主要探讨不同血液净化模式在终末期糖尿病肾病患者维持性血透的治疗中对胰岛素抵抗及微炎症状态的影响。方法本次研究范围限定在我院2014年1月至2017年1月收治的110例终末期糖尿病肾病患者,随机分为观察组和对照组,对照组患者采用序贯血液透析滤过治疗,观察组患者采用序贯血液透析滤过结合血液灌流治疗,对两组患者治疗前后指标变化以及治疗后患者发生不良反应情况进行对比分析。结果观察组和对照组患者在治疗前指标无统计学差异(P>0.05),治疗后观察组患者指标优于对照组(P<0.05);观察组与对照组不良反应情况无明显差异(P>0.05)。结论对终末期糖尿病肾病患者实施序贯血液透析滤过结合血液灌流治疗能够有效的改善患者对胰岛素的抵抗力和微炎症状态。

关键词： 银杏内酯A   巨噬细胞   炎症   LPS   AMPK   NF-κB  

摘要： 炎症是由细胞损伤或内毒素感染等引起的一种重要和复杂的病理过程。急性和慢性炎症反应均可引起严重的疾病,例如动脉粥样硬化、哮喘、类风湿关节炎、急性肝损伤、糖尿病和癌症等。因此,抑制炎症反应可以有效地抑制炎症相关疾病的发生与发展。炎症因子白介素6(interleukin-6,IL-6)作为重要的炎症介导者,参与多种炎症相关疾病的发病机制。因此,本实验前期的研究中就利用IL-6基因的启动子作为萤火虫荧光素酶报告载体筛选系统,从300多种天然化合物中筛选出能抑制IL-6的报告基因表达的银杏内酯A(Ginkgolide A,GA),暗示天然化合物GA可能具备抗炎潜能。基于此研究结果,本论文旨在进一步开展GA的抗炎作用及其作用机制的研究。巨噬细胞是炎症反应的主要参与者,而内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可以有效地激活巨噬细胞并诱导产生各种促炎介质以加剧炎症反应。因此,在体外实验中,我们采用LPS刺激的鼠源,人源和原代的三种不同来源的巨噬细胞作为炎症模型展开研究。首先,MTT分析显示GA在0-40μg/mL浓度下对鼠源RAW264.7(mouse macrophage RAW264.7),人源单核细胞分化的巨噬细胞dTHP-1(differentiated human monocytes,dTHP-1)和小鼠腹腔原代巨噬细胞(mouse peritoneal macrophages)三种来源的巨噬细胞的活力没有影响,以此排除药物毒性对实验的干扰;然后,我们用Western Blot,RT-qPCR(quantitative Real-Time RT-PCR)和ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)方法探究GA在LPS刺激的三种巨噬细胞中的作用,发现GA可以不同程度地抑制促炎介质一氧化氮(nitric oxide,NO)的分泌,环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表达,和促炎细胞因子白介素6(interleukin-6,IL-6)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的转录和表达。我们还发现,GA能改善LPS降低的小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,以加速炎症的消退。最后,我们在体内研究中发现GA能挽救小鼠感染性休克,并且在LPS刺激的小鼠炎症反应中,与体外结果一致,GA能降低血清中IL-6,TNF-α和IL-1β的含量。此外,我们进一步探究GA抗炎作用的分子机制。首先,利用Western Blot和免疫荧光的方法探究发现GA能抑制LPS刺激下IκB(inhibitor of NF-κB)的降解,进一步抑制NF-κB p65的入核,最终抑制炎症相关的转录基因的激活。其次,LPS能诱导MAPKs(Extracellular signal regulated kinase(ERK),c-Jun N-terminal kinase(JNK)和p38 mitogen-activated protein kinase)的活化,并且GA显著抑制了P38和ERK的磷酸化以减弱炎症反应。最后,我们进一步研究还发现,在LPS刺激的巨噬细胞中以及LPS诱导的BALB/c小鼠的血单核细胞中,GA都能显着增强AMPK(AMP-activated protein kinase)的活化,并且利用AMPK抑制剂(Coumpound C,CC)探究发现AMPK的激活能部分抑制NF-κB和MAPKs的活化。上述结果表明,GA部分通过下调NF-κB,MAPK(ERK和P38)信号通路和上调AMPK通路来发挥抗炎作用。综上所述,GA通过介导多条信号通路来抑制LPS诱导的三种类型的巨噬细胞及LPS诱导的BALB/c小鼠中的炎症反应。因此,天然化合物GA可能被开发为炎性疾病的潜在药物。

关键词： 急性冠脉综合征   动脉粥样硬化   CD4+T细胞   共刺激分子   炎症因子   围手术期心肌损伤   免疫炎症反应   CD4+CD28nullT细胞   心肌肌钙蛋白I  

摘要： 目的探讨急性冠脉综合征(ACS)患者外周血CD4+T细胞分布水平的变化和临床意义。方法入选2015年7月至2016年11月于我院心血管内科住院的临床高度怀疑冠心病患者219例,所有患者均接受冠状动脉造影,依据冠脉造影结果、2014年ACC/AHA稳定性冠心病和NSTE-ACS及2013年ACCF/AHA STEMI诊治指南将其分为3组:非狭窄性冠心病组(对照组,63例)、稳定性冠心病(SCAD)组(55例)和ACS组(101例)。采用流式细胞术测定患者外周血CD4+T细胞中CD4+CD28null T细胞、CD4+CD134+T细胞及CD4+CD137+T细胞分布的变化。采用免疫比浊法测定血清C反应蛋白(CRP),ELISA法测定血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的水平。结果(1)ACS患者外周血CD4+CD28null T细胞的分布比例显著高于对照组[(7.78±0.38)%vs(2.40±0.24)%,P<0.05]和SCAD组[(7.78±0.38)%vs(2.32±0.24)%,P<0.05],SCAD组与对照组间差异无统计学意义。(2)ACS患者的血清CRP和TNF-α水平均显著高于对照组[(11.72±0.57)mg/L vs(3.78±0.12)mg/L,P<0.05;(331.98±4.00)pg/m L vs(272.67±5.60)pg/m L,P<0.05]和SCAD组[(11.72±0.57)mg/L vs(5.04±0.22)mg/L,P<0.05;(331.98±4.00)pg/m L vs(296.84±7.67)pg/m L,P<0.05]。但是,ACS患者的血清TRAIL水平显著低于对照组[(437.41±7.84)pg/m L vs(611.43±13.11)pg/m L,P<0.05]和SCAD组[(437.41±7.84)pg/m L vs(567.65±16.01)pg/m L,P<0.05]。(3)患者外周血CD4+CD28null T细胞分布比例与血清CRP、TNF-α水平间均呈正相关(r=0.657,P<0.05;r=0.381,P<0.05),而与血清TRAIL水平间呈负相关(r=-0.467,P<0.05)。(4)ACS患者外周血CD4+CD134+T细胞分布水平高于对照组[(62.77±1.12)%vs(46.36±1.85)%,P<0.05]和SCAD组[(62.77±1.12)%vs(53.48±1.32)%,P<0.05],SCAD组患者CD4+CD134+T细胞分布水平亦高于对照组。(5)ACS患者外周血CD4+CD137+T细胞分布水平高于对照组[(22.21±0.92)%vs(14.67±1.02)%,P<0.05]和SCAD组[(22.21±0.92)%vs(14.49±0.89)%,P<0.05]。(6)ACS患者外周血CD4+CD28null T细胞比例与CD134(r=0.209,P<0.05)和CD137(r=0.241,P<0.05)共刺激分子的表达呈正相关。结论ACS患者外周血中CD4+CD28null T细胞、CD4+CD134+T细胞及CD4+CD137+T细胞的分布水平较冠脉血管正常和SCAD患者显著增多,且CD4+CD28null T细胞比例与CD134和CD137共刺激分子及血清CRP、TNF-α水平呈正相关,而与血清TRAIL水平呈负相关。目的探讨PCI患者外周血CD4+CD28nullT细胞的分布水平与PCI术后发生围手术期心肌损伤(PMI)间的关系。方法入选2015年7月至2016年11月于我院心血管内科住院的临床高度怀疑冠心病患者174例,所有患者均接受冠状动脉造影,依据冠脉造影结果、2014年ACC/AHA稳定性冠心病和NSTE-ACS诊治指南将其分为非狭窄性冠心病组(对照组,63例)和冠心病组(111例)。冠心病组患者均为首次接受PCI。根据2012年ESC/ACCF/AHA/WHF第3次全球心肌梗死定义的指南,将PCI患者分为发生PMI组(32例)和未发生PMI组(79例)。采用免疫荧光法测定血清c Tn I水平和流式细胞术测定外周血CD4+CD28null T细胞的分布比例。结果(1)冠心病组患者外周血CD4+CD28null T细胞的分布比例高于对照组[(5.30±0.40)%vs(2.40±0.24)%],差异有统计学意义(P<0.05)。(2)冠心病患者外周血CD4+CD28null T细胞分布比例与PCI术前c Tn I水平没有相关性(r=0.072,P=0.455),但与术后c Tn I水平间呈正相关(r=0.275,P=0.004)。(3)PCI术后PMI发生率为28.

关键词： PDGFRβ细胞   外周炎症信号   神经元   分子机制  

摘要： 第一部分:PDGFRβ细胞传递外周炎症信号到神经元的分子机制　　大脑是机体最为复杂的器官，由约860亿个神经元组成。这些神经元通过其间约1.5x1014个突触连接形成精细的神经环路。神经环路的正确形成是大脑发挥其功能的结构基础。神经环路的建立受基因和环境因素的双重调控。多个基因的突变会导致神经环路形成与可塑性的异常，从而影响大脑功能。包括感觉经验、急性感染或脑外伤、慢性应激等环境因素对神经环路形成，其可塑性与功能都有重要的调控作用。感觉经验或适当的感觉刺激可以促进神经环路发育，而感觉剥夺则会抑制或减缓正常发育的进程。来自环境的巨大压力或长期应激，则可能导致抑郁症。病原微生物的威胁是不可避免的。急性病原感染如果不得到及时治疗，可能会转变成系统炎症，引发大脑产生强烈的炎症反应，从而影响大脑的正常功能。在本研究中，通过构建三个不同系统感染模型[模拟细菌感染的脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)模型、模拟RNA病毒感染的Poly(I∶C)模型、模拟细菌和DNA病毒感染的ODN 1668模型]，我们发现在系统炎症开始的两个小时内，脑血管周边PDGFRβ细胞可以快速的响应外周炎症刺激合成释放趋化因子配体2 [chemokine (C-C motif) ligand 2,CCL2，又称MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1]。CCL2则通过增加谷氨酸能神经元的兴奋性突触传递，增加多个脑区神经元的兴奋性。通过对单细胞测序技术我们进一步鉴定了PDGFRβ细胞的两个亚群:Col1a1细胞和Rgs5细胞，它们是炎症早期合成CCL2的主要细胞类型。其中Col1a1细胞为血管周边类成纤维细胞，而Rgs5细胞类群中则包含经典的血管周细胞。使用LPS或Poly(I∶C)处理人脑血管周细胞，可以在细胞外液中检测到大量的CCL2，这一外液同样可以提高谷氨酸能神经元的兴奋性突触传递和神经元兴奋性，且这一效果依赖于CCL2。更重要的是，当我们在PDGFRβ细胞中特异的敲除掉CCL2 (Pdgfrβ-Cre;Ccl2fl/fl)，LPS导致的兴奋性突触传递的升高现象得到了显著缓解。这些结果首次在体内证明了PDGFRβ细胞是大脑中最早响应外周感染的细胞，也首次证明了脑血管周边的PDGFRβ细胞可以调控神经元电活动。PDGFRβ细胞一方面可以通过释放细胞因子CCL2提高神经元的兴奋性，另外一个方面PDGFRβ细胞释放的细胞因子还可以激活大脑中的胶质细胞。由于PDGFRβ细胞位于血脑屏障上，既可以接触外周循环系统又可以接触到脑实质，因此其可以非常迅速的感受到来自外界的刺激，并将这一信号传递给脑实质的细胞。由于PDGFRβ细胞的位置特征，以其为靶标的药物不需要通过血脑屏障便可以起效，使其有望成为神经炎症治疗的新靶点。　　第二部分:3，4二磷酸脂酰肌醇介导神经突形成的分子机制　　神经元是所有细胞类型中形态最为复杂的细胞。形态各异的树突使得神经元可以同时接收多种输入，且远程的轴突投射，使得神经元可以将信息同时传递到远距离的多个脑区。神经元高度特化的形态是大脑发挥其功能的结构基础。以往的研究主要集中在神经元发育的后期，而对于神经元发育早期的研究很少，特别是神经突是如何从胞体长出的分子机制仍是未知的。近期的研究表明，细胞膜下局部肌动蛋白聚集体的形成决定了神经突在神经元上长出的位置。然而介导肌动蛋白聚集体形成的分子机制仍然不清楚。在本研究中，我们发现一个以往研究较少的磷脂酰肌醇——3，4二磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol 3，4-bisphosphate，PI(3，4)P2)——是介导肌动蛋白聚集体形成的上游分子，并且对神经突的形成非常重要。做为对照，被较多研究的磷脂酰肌醇——4，5二磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PI(4，5)P2)和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol 3，4，5-bisphosphate，PI(3，4，5)P3)——则不具有该功能。包被PI(3，4)P2的玻璃小球可以局部增加神经元的PI(3，4)P2含量，进而导致肌动蛋白聚集体的形成和神经突的长出。PI(3，4)P2主要通过两条代谢途径形成，其最关键的酶分别为磷脂酶SHIP2（SH2 domain containing inositol 5-phosphatase）和磷脂酰肌醇三位磷酸激酶PI3KC2α (class Ⅱ phosphoinositide 3-kinase alpha)。这两条通路对于肌动蛋白聚集体的形成和神经突的长出以及后续树突的形成是互补且非冗余的。我们还发现PI(3，4)P2是通过神经系统Wiskott-Ald

关键词： 慢性炎症   配胖   Ⅱ型糖尿病   牙周炎   NLRP3   固有免疫  

摘要： 1.研究背景及目的慢性炎症是一系列慢性疾病,如肥胖、糖尿病等的共同病理机制。肥胖机体以长期的低度慢性系统性炎症及免疫反应异常、胰岛素抵抗为重要特征,使其易感于重大代谢疾病包括糖尿病等。肥胖是糖尿病的重要病因,二者呈“孪生”流行趋势,且均可促进牙周炎的发展。而关于NLRP3信号通路在其中所起的关键作用的研究匮乏。本研究目的为探讨肥胖及Ⅱ型糖尿病导致的系统性炎症状态对牙周组织炎症的影响及NLRP3信号通路在其中所起的关键作用。2.研究方法(1)饮食诱导16周牙周结扎10天建立肥胖小鼠牙周炎模型,记为正常饮食组、正常饮食结扎组、高脂饮食组、高脂饮食结扎组。(2)体内通过RT-PCR和IHC的方法检测小鼠牙龈组织内NLRP3信号通路(NLRP3,capase1,IL-1β,NFκb)及巨噬细胞表面标记物F4/80、巨噬细胞趋化因子MCP1的表达情况。(3)体外分离培养不同饮食背景的小鼠BMDMs并对其进行LPS刺激,通过RT-PCR及ICC检测巨噬细胞内NLRP3信号通路的表达。(4)收集人类健康组、慢性牙周炎组及慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病组患者牙龈组织,体内通过RT-PCR及IHC检测牙龈组织内NLRP3信号通路的表达。体外分离培养人牙龈上皮细胞并对其进行高糖及LPS刺激实验,通过RT-PCR及ICC检测上皮细胞内NLRP3信号通路的表达。3.研究结果(1)高脂饲料诱导16w小鼠的体重及血糖明显高于正常饲料组。小鼠牙槽骨吸收:牙周炎组显著高于非牙周炎组,高脂饮食组显著高于正常饮食组。血清胰岛素及炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10表达水平:高脂饮食组显著高于正常饮食组。(2)小鼠牙龈组织中NLRP3,Caspasel,IL-1β及NFκb的mRNA及蛋白质表达水平:牙周炎组显著高于非牙周炎组。(3)小鼠牙龈组织中F4/80及MCP1的mRNA及蛋白质表达水平:牙周炎组显著高于非牙周炎组,高脂饮食组显著低于正常饮食组。BMDMs中NLRP3信号通路因子的mRNA及蛋白质表达水平:LPS刺激组显著高于非刺激组,高脂饮食组显著低于正常饮食组。(4)人牙龈组织中NLRP3信号通路因子的mRNA及蛋白质表达水平:在伴有炎症及Ⅱ型糖尿病的牙龈组织中表达显著性升高。HGECs中NLRP3信号通路因子的mRNA及蛋白质表达水平在高糖刺激后显著升高。4.结论我们发现,肥胖、Ⅱ型糖尿病的机体处于慢性炎症状态均加重了牙周炎的发生发展。肥胖导致感染的牙周组织内巨噬细胞数量减少及活性降低,引起牙周固有免疫的异常,最终加重了牙周炎的局部炎症状况。而Ⅱ型糖尿病患者的高糖状态可能通过牙龈上皮细胞NLRP3信号通路的高表达而加重慢性牙周炎的发生发展。