关键词： 慢性肾衰   微炎症状态   尿毒清颗粒   Meta分析  

摘要： 目的:探讨尿毒清颗粒治疗慢性肾衰患者微炎症状态的疗效及安全性。方法:系统性检索中国知网、维普、PubMed、EBSCO、Elsevier-SDOL、WEB of science等数据库关于尿毒清颗粒(Uremic clearance granule,UCG)治疗慢性肾衰(Chronic renal failure,CRF)患者微炎症状态的随机对照试验,由2位研究人员进行文献筛选并提出数据,用Review Manager5.3软件进行Meta分析。结果:最终纳入55篇文献共3953例患者,文献临床数据完整、质量普遍较低、以小样本量临床研究为主,其中有12篇文献提出发生了与UCG相关的不良反应。根据研究对象的不同分为以下几组:(1)维持性血液透析组有24篇文献共1916例患者:常规治疗+UCG较单用常规治疗降低炎症因子水平差异有统计学意义(降低Hs-CRP水平的MD为2.41,95%Cl为[1.93,2.88],Z=9.96,P<0.00001),说明UCG可改善血透患者微炎症状态;(2)维持性腹膜透析组有8篇文献共378例患者:常规治疗+UCG较单用常规治疗降低炎症因子水平差异有统计学意义(降低Hs-CRP水平MD为2.66,95%Cl为[1.93,3.39],Z=10.03,P<0.00001),说明UCG可改善腹透患者微炎症状态;(3)非透析组有16篇文献共1323例患者:常规治疗+UCG较单用常规治疗降低炎症因子水平差异有统计学意义(降低Hs-CRP水平MD为1.97,95%Cl为[1.22,2.72],Z=5.17,P<0.00001),说明UCG可改善CRF非透析患者微炎症状态;(4)与其它中药制剂对照有7篇文献共496例患者:常规治疗+UCG较常规治疗+其它中药制剂降低炎症因子水平差异无统计学意义(降低Hs-CRP水平MD为-0.26,95%Cl为[-0.83,0.31],Z=0.90,P=0.37>0.05)。结论:UCG能有效改善CRF,包括维持性血液透析、维持性腹膜透析、非透析患者的微炎症状态,且安全性较高。其它中药制剂亦能改善CRF患者的微炎症状态。

关键词： 椎间盘退变   病理机制   自身免疫炎症反应   髓核细胞   白细胞介素9   肿瘤坏死因子α   前列腺素E2  

摘要： 椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration，IDD)是导致腰背痛及椎间盘源性腰痛的最常见原因，给患者个人家庭及社会带来极大的经济负担。IDD的特征为椎间盘发生广泛的形态学和生物力学变化，椎间隙高度减低，椎间盘结构破坏，脊柱活动度下降，最终导致椎间盘生物力学功能丧失，同时引起下腰痛等临床症状。椎间盘退变主要的生化改变为椎间盘内软骨样髓核细胞出现变性及坏死，髓核细胞功能降低和数量减少，髓核细胞外基质中Ⅱ型胶原(TypeⅡ collagen，ColⅡ)、蛋白聚糖等功能性基质大分子丢失造成细胞赖以生存的环境被破坏。炎性介质在椎间盘退变过程中发挥着重要的作用。炎症因子在椎间盘退变过程中通过引起炎症反应、诱导细胞凋亡，破坏椎间盘的组织结构。研究证明，TNF-α、白细胞介素-1β(Interlukin-1β，IL-1β)、白介素17(Interlukin-17，IL-17)、前列腺素E2(Prostaglandin GE2)、环氧化酶-2(COX-2)、一氧化氮(NO)等炎症因子在椎间盘退变进程中起重要作用。炎症因子主要通过引起炎症反应、诱导细胞凋亡等途径，促进椎间盘退变;同时椎间盘组织内炎症因子相互作用发生级联反应，进一步加剧椎间盘组织的炎症反应，加速椎间盘退变。　　IL-9最初被认为是一种T淋巴细胞生长因子，主要由活化的CD4+Th9细胞分泌，此外肥大细胞、嗜酸性细胞、中性粒细胞、其他淋巴细胞亚群也可以少量分泌。研究表明，IL9在炎症反应中能够趋化炎症细胞，促进炎症因子表达，加剧炎症反应。目前，越来越多的证据表明Th9细胞和IL-9可能与人体炎症反应和自身免疫炎性疾病的发病机制相关。IL-9在多种自身免疫炎症疾病，如哮喘、免疫性脊髓炎、骨性关节炎及炎症性肠炎中发挥了重要作用。研究表明，IL-9可以促进IL-4介导B细胞分化及IgE的表达，此外IL-9还能够促进活化T细胞和肥大细胞增殖，从而促进过敏反症的发生。IL-9作为一种细胞因子可以通过调节嗜酸粒细胞的成熟和聚集，促进支气管上皮细胞表达T细胞趋化因子，从而促进过敏性哮喘的发展。在自身免疫性炎性反应方面，Nowak等在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠模型中发现，IL9能够影响中枢神经系统IL-17A和IL-6的表达。体外试验证明，IL-9促进股骨头坏死患者的关节软骨细胞表达、释放TNF-α、COX2等炎性因子，IL-9以浓度依赖和时间依赖方式促进关节软骨细胞分泌大量TNF-α、PGE2等炎症因子，进一步放大髋关节局部的免疫炎症反应。在退变椎间盘组织中，IL-9是否诱导髓核细胞TNF-α的表达及PGE2的产生，并通过二者发挥致炎作用，导致椎间盘内炎症反应，尚无明确研究。IL-9在椎间盘组织内作用的具体作用机制也不明确　　本研究主要分为两部分:第一部分主要探索IL-9及TNF-α在退变椎间盘的表达情况，明确IL-9及TNF-α是否参与椎间盘炎性退变的病理生理过程;第二部分主要通过体外实验探讨IL-9调控退变髓核细胞分泌TNF-α和PGE2的影响，进一步明确IL-9的在椎间盘自身免疫炎症反应中的作用机制。　　第一部分:IL-9、TNF-α在退变椎间盘组织及血清表达的研究　　研究目的:椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)是导致腰背痛和腰椎间盘突出的最常见原因。近年来，突出或脱出的退变椎间盘组织所诱发的炎症反应和自身免疫反应导致神经根炎性疼痛的观点受到重视。前期研究表明辅助性T淋巴细胞9(T helper9，Th9)细胞及其相关细胞因子IL-9在自身免疫性疾病中发挥重要作用。本研究通过检测椎间盘突出患者椎间盘组织中IL-9和TNF-α的表达，明确IL-9及TNF-α是否参与椎间盘炎性退变的病理生理过程。　　研究方法:选取2012年10月-2015年10月在山东大学齐鲁医院骨外科住院、同时经临床表现、体格检查和影像学检查明确诊断为腰椎间盘突出症患者。40例患单节段椎间盘突出症病人的椎间盘组织以及5例脊柱外伤病人的椎间盘组织，根据影像学检查和临床表现分为突出组(Group P)、脱出组(Group E)和正常对照组(Control Group)。免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)染色检测各组退变椎间盘组织中IL-9和TNF-α的表达，观察上述指标在各组退变椎间盘的表达变化及定位;蛋白印迹法(Western blot)检测各组退变椎间盘组织IL-9和TNF-α蛋白表达水平;应用实时定量荧光聚合酶链式反应(real-time PCR)观察各组椎间盘组织中IL-9和TNF-α mRNA含量变化。收集患者外

关键词： 维持性血液透析   轻微炎症状态   高通量血液透析   血液灌流  

摘要： 目的观察常规血液透析、高通量血液透析等对于维持性血液透析患者微病症状态所带来的影响。方法随机抽取某人民医院那透析龄超过六个月的稳定患者45例,并将其随机的分为HD组、HFD组、HD+HP组三类,每类患者15例。分别对于这三类患者在首次治疗前后、治疗三个月后透析之前,通过免疫比浊法和酶联免疫吸附法来测定患者C反应蛋白等含量。结果这三组患者中的每一例患者在治疗之前的各项水平均高于正常对照组。经过系统的治疗之后,HD组在经过首次治疗之后以及治疗三个月之后各项指标皆得到了显著的提升。HFD组反正善良之一,在首次治疗后以及治疗三个月之后各项指标均得到了明显的降低。HD+HP组日,首次治疗后以及治疗三个月之后项指标都显著的下降,但与正常对照组相比仍然较高。结论 MHD患者一直处于微炎症状态。相对来说,采取HP和HFD治疗方式可以有效降低各项指标水平,对于微炎症情况起到轻微的改善作用。这两者对比来说,HP起到的效果更为明显。三个月的治疗期限仍然较为短暂,虽然可以对于微炎症状态产生改善作用,但短期的治疗并不能完全纠正该状态。

关键词： 支气管哮喘   金黄色葡萄球菌   肺泡巨噬细胞   Toll样受体2   磷脂酰肌醇3-激酶  

摘要： 研究背景支气管哮喘是以气道炎症为主要病理特征的气道疾病之一。近20年来,支气管哮喘的发病率持续增加,全球支气管哮喘患者人数已逾3亿。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌,staphylococcus aureus,SA)作为自然界中最常见的革兰氏阳性病原体,已经成为哮喘等慢性气道炎症性疾病最主要的危险因素之一。此外,研究发现Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)信号通路调控自噬和炎症因子的释放,参与了哮喘的发病机理。因此,我们采用金葡菌刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,在细胞水平观察TLR2对金葡菌诱导肺泡巨噬细胞自噬和炎症反应的影响。研究目的探讨肺泡巨噬细胞表面受体TLR2在金葡菌诱导巨噬细胞自噬和炎症反应中的潜在分子机制。研究方法1.检测巨噬细胞受到不同时间金葡菌刺激后自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7受到不同时间金葡菌刺激后,通过Western blot和ELISA方法检测巨噬细胞受到刺激后自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达水平;通过激光共聚焦扫描显微镜观察巨噬细胞内自噬溶酶体的数量。***干扰TLR2对金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白表达的影响检测用金葡菌刺激TLR2 si RNA干预的RAW264.7巨噬细胞2h后,通过Western blot和ELISA方法检测TLR2 si RNA干预的巨噬细胞受到金葡菌刺激后自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达水平;通过激光共聚焦扫描显微镜观察巨噬细胞内自噬溶酶体的数量。3.特异性抑制PI3K信号通路对金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白表达的影响检测用金葡菌刺激PI3K特异性抑制剂3-MA干预的RAW264.巨噬细胞2h后,通过Western blot和ELISA方法检测3-MA干预的巨噬细胞受到金葡菌刺激后自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达水平;通过激光共聚焦扫描显微镜观察巨噬细胞内自噬溶酶体的数量。研究结果1.金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞受到不同时间的金葡菌刺激后,TLR2、My D88、PI3K和p-NF-κBp65信号通路蛋白的表达随时间依赖性的方式显著增加;与此同时,自噬蛋白Beclin-1、LC3-II和促炎症因子TNF-α和IL-6的表达以及巨噬细胞中自噬溶酶体的表达数量也随时间依赖性的方式显著增加。***2对金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及多种信号通路蛋白的表达至关重要金葡菌刺激TLR2 si RNA干预的RAW264.巨噬细胞2h后,TLR2、My D88、PI3K和p-NF-κBp65信号通路蛋白的表达显著受到抑制;与此同时,自噬蛋白Beclin-1、LC3-II和促炎症因子TNF-α和IL-6的表达以及巨噬细胞中自噬溶酶体的表达数量也明显受到抑制。***3K信号通路对金葡菌诱导巨噬细胞自噬蛋白和促炎症因子以及NF-κB信号通路蛋白的表达至关重要用金葡菌刺激PI3K特异性抑制剂3-MA干预的RAW264.巨噬细胞2h后,PI3K和p-NF-κBp65信号通路蛋白的表达显著受到抑制;与此同时,自噬蛋白Beclin-1、LC3-II和促炎症因子TNF-α和IL-6的表达以及巨噬细胞中自噬溶酶体的表达数量也明显受到抑制。研究结论1.金葡菌能够诱导巨噬细胞活化自噬和炎症反应。***2信号通路能够调控金葡菌诱导巨噬细胞活化自噬和炎症反应。***2能够通过PI3K信号通路调控金葡菌诱导巨噬细胞活化自噬和炎症反应。

关键词： 脑卒中   中动脉栓塞模型   脂质组学   液质联用   小胶质细胞   炎症因子  

摘要： 脑卒中已经成为威胁人类生命的最主要疾病之一,正严重威胁着居民的生存、健康和生活质量。而目前对于脑卒中的发病分子机理知之甚少,脑卒中治疗也只能通过通栓药的方式微弱进行。脂质组学作为代谢组学的一个分支,这些年来越来越多地应用在生物医学研究领域,用于相关疾病的生物标志物诊断、揭示疾病的发病分子机制。本论文旨在通过脂质组学技术研究脑卒中诱发的内源性神经脂质变化,找到卒中恢复期关键的脂质分子,探究卒中后神经炎症分子机理,发现保护神经细胞的脂质生物标记物,开发有效治疗脑卒中的新方法。本论文使用脑卒中的疾病动物模型MCAO模型,借助高灵敏度的UPLC-MS分析平台,研究小鼠脑缺血/再灌注损伤恢复期大脑皮层区域不同脂质的变化,建立了大脑脂组代谢图谱,通过建立PCA模型和OPLS-DA模型对小鼠脑缺血/再灌注1天、3天、7天、14天、28天以及假手术组共41个脂质样品里的578个脂质分子分析各组间差异脂质,并结合OPLS-DA模型中的VIP>1及t检验的p<0.05共筛选出84个主要的差异脂质化合物,通过统计分析84个差异脂质分子在恢复期的变化及MCAO行为学情况,得到7个潜在生物标志物,分别是:PC(20:4/22:6)、PC(16:0/18:2)、PC(16:0/16:0)、LPC(16:0)、PG(18:1/20:4)、PE(16:0p/16:1)和Cer(d18:2/18:0)。其中PC(16:0/16:0)和LPC(16:0)脂质分子在恢复期的变化最显著,且PC(16:0/16:0)在磷脂酶A2的作用下产生LPC(16:0)。通过研究PC(16:0/16:0)和LPC(16:0)与小胶质细胞激活的关系,发现PC(16:0/16:0)和LPC(16:0)均不能使小胶质细胞激活产生炎症因子,通过建立LPS诱导的小胶质细胞激活分泌TNF-α、IL-1β炎症模型,发现PC(16:0/16:0)能显著降低LPS诱导的小胶质细胞分泌的TNF-α、IL-1β。PC(16:0/16:0)分子作为潜在的神经保护剂对卒中后神经炎症的恢复有重要意义。

关键词： 消化系统炎症性疾病   参附注射液   药理作用  

摘要： 本文分为以下两个部分进行探讨：　　第一部分 参附注射液通过抑制JNK/Nox4和JNK/NFκB途径来保护棕榈酸诱导的肝AML12细胞损伤　　目的：非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）包括脂肪变性、肝炎、肝细胞损伤和纤维化。在本研究中，我们拟探讨一种传统中药-参附注射液（ShenFu preparation，SF）在体外肝脂肪变性模型中的保护作用和潜在机制。　　方法：建立棕榈酸（Palmitic acid，PA）诱导鼠肝细胞损伤模拟离体NASH模型，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（Terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）和甘油三酯比色测定法（TG Colorimetric Assay）对细胞凋亡和细胞内甘油三酯水平（Intracellular triglyceride，iTG）进行评估;分别采用DCF（Dichlorofluorescein，二氯荧光素）和JC-1（5,5‘,6,6’-四氯-1,1‘,3,3’-四乙基苯酸盐-咪唑羰基花青素）测定活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）水平;使用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）评估细胞因子水平;用免疫印迹法（Immunoblot）检测JNK（C-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）、Nox4（NADPHoxidase4，NADPH氧化酶4）和NFκB（Nuclear factor kappa B，核因子kappa B）的表达变化。　　结果：参附注射液减轻了棕榈酸诱导的细胞凋亡，以及降低了IL-6（白细胞介素-6）、IL-8（白细胞介素-8）和iTG的表达。经过棕榈酸处理的细胞中，添加参附注射液，可以降低Nox4和ROS的水平，同时MMP、MnSOD（锰超氧化物歧化酶）和过氧化氢酶的表达升高，表明线粒体功能障碍的发生。应用Nox4抑制剂-GKT137381抑制了由棕榈酸诱导产生的ROS和细胞凋亡的增加，同时降低了iTG的量，但并没有影响IL-8和IL-6的水平。参附注射液可以抑制棕榈酸诱导的磷酸化氨基末端激酶的上调。JNK抑制剂-SP600125抑制了由棕榈酸诱导的Nox4、IL-8、IL-6和iTG的增加。应用参附注射液后，可以阻断棕榈酸处理过的细胞中检测到的NFκB/p65核转位。BAY11-7082，一种IκB（Inhibitor of NF-κB）降解抑制剂，降低了由棕榈酸诱导的IL-8、IL-6以及iTG的量，而它只是轻微地降低了ROS含量，对细胞凋亡没有影响。　　结论：参附注射液通过减少氧化应激和细胞因子的产生以及抑制JNK/Nox4和JNK/NFκB途径，在预防肝细胞损伤过程中发挥了至关重要的作用。　　第二部分 参附注射液能显著改善脂多糖诱导的肠道上皮细胞损伤　　目的：肠道上皮细胞在肠道屏障功能的维护中起着至关重要的作用，而潜在的损伤机制还没有完全阐明。本研究拟对一种传统中药-参附注射液（ShenFu preparation，SF）在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的肠道上皮细胞损伤中的保护作用和分子机制进行系统探讨。　　方法：采用HIEC-6细胞（Human intestinal epithelial cell，人肠上皮细胞系），单独应用LPS或LPS与SF联合应用来进行实验。应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（Terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）对细胞凋亡进行评估。活性氧（ROS）水平是用DCF（Dichlorofluorescein，二氯荧光素）测定法测定的。经transwell培养板培养的单层人肠上皮细胞-6，通过FITC-albumin influx assay分析其渗透性。应用即时聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）来对细胞因子IL-1β（白介素-1β）、IL-6（白介素-6）和TNF-α（肿瘤坏死因子-α）进行定量分析。蛋白质印迹法（Western blot）用于测定胞浆IκBα（核因子κB抑制因子α）和核NFκB/p65亚基的含量。　　结果：在脂多糖处理的细胞中发现了细胞凋亡、ROS和细胞因子的产生，以及NFκB/p6

关键词： 缺血性脑卒中   免疫炎症反应   CD8+T细胞   FasL  

摘要： 研究背景:免疫炎症反应贯穿了缺血性卒中发生发展的整个过程,是卒中进展、卒中后脑损伤及脑功能修复的重要调控因素。CD8+T细胞可通过细胞毒性作用杀伤靶细胞,在抗原特异性细胞免疫中发挥重要作用。缺血性卒中后,CD8+T细胞可越过破坏的血脑屏障浸润至脑实质内并加重脑损伤,但其作用的具体机制仍不明确。FasL表达于CD8+T细胞表面,在外周,CD8+T细胞可通过FasL使靶细胞发生凋亡,但近年来的研究发现FasL同样具有促炎效应,抑制FasL能够明显减轻缺血性卒中后T细胞相关免疫炎症反应的发生。在本论文中,我们探讨了 FasL是否能够调控脑缺血后CD8+T细胞的功能,并明确了 FasL介导的CD8+T细胞对神经元的杀伤作用,及对促炎型小胶质细胞的活化效应。此外,我们还进一步探索了 FasL调控CD8+T细胞功能的分子机制。研究方法:在体内实验部分,我们对野生型小鼠(WT小鼠)及FasL突变小鼠(gld小鼠)行一侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,于再灌注后不同时间点评估小鼠脑梗死体积及神经行为学功能,同时利用流式细胞术检测缺血侧半球CD8+T细胞的浸润数量及功能;磁珠分选法提取WT小鼠与gld小鼠CD8+T细胞并分别回输至缺乏成熟T细胞的Rag1-/小鼠体内,行MCAO并于术后3天评估小鼠脑梗死体积与神经行为学功能,采用q-PCR检测梗死侧半球促炎因子的表达水平,免疫荧光染色评估梗死灶周围神经元存活及胶质细胞活化情况。体外实验部分,将WT小鼠及gld小鼠来源的CD8+T细胞与OGD后神经元体外共培养,MTT法及LDH释放法检测神经元死亡率;同时将不同基因型CD8+T细胞与小胶质细胞共培养,q-PCR比较两组小胶质细胞极化水平的差异;在部分实验中,利用FasL中和抗体及Fas中和抗体分别处理CD8+T细胞与小胶质细胞,共培后利用q-PCR及流式细胞术评估CD8+T细胞功能及小胶质细胞极化情况。最后,体外直接刺激CD8+T细胞FasL,利用流式细胞术检测MAPK信号通路关键蛋白磷酸化情况;同时使用PD98059、SB203580及SP600125抑制MAPK信号通路活化,采用流式细胞术、q-PCR及CBA法评估CD8+T细胞功能。结果:1)与WT小鼠相比,MCAO后不同时间点gld小鼠脑梗死体积明显降低,神经行为学功能明显改善。2)流式细胞术结果显示,与WT小鼠相比,MCAO后不同时间点gld小鼠梗死侧半球CD8+T细胞数量并无明显差异,但活化分子及毒性细胞因子的表达显著降低。3)与WT组相比,回输gld小鼠来源的CD8+T细胞后,Rag1-/-小鼠MCAO后脑梗死体积、神经功能缺损程度、缺血侧半球促炎因子表达及小胶质细胞活化程度均明显降低,而梗死灶周围神经元的存活率显著增高。4)与WT组相比,gld小鼠来源的CD8+T细胞对OGD后神经元的杀伤作用明显减轻。5)与WT组相比,gld小鼠来源的CD8+T细胞显著减轻了小胶质细胞的M1型极化程度。阻断CD8+T细胞FasL或阻断小胶质细胞Fas后,CD8+T细胞毒性显著降低。6)直接刺激CD8+T细胞FasL后,p-ERK1/2、p-JNK及p-p38的表达水平明显增高,且CD8+T细胞毒性显著增强;抑制MAPK信号通路可阻断FasL介导的CD8+T细胞促炎效应。结论:1)FasL突变可减少缺血性卒中后脑梗死体积,并有效缓解小鼠神经功能缺损;FasL突变可明显减轻缺血侧半球CD8+T细胞的毒性;同时,FasL突变可减轻梗死灶周围CD8+T细胞诱导的神经元死亡及小胶质细胞活化,进一步抑制脑内免疫炎症反应。2)缺血性卒中后,CD8+T细胞通过FasL杀伤神经元,并与小胶质细胞Fas结合,促进小胶质细胞M1型极化及自身毒性增强,两种细胞共同作用进一步加重神经元死亡。3)FasL可通过活化MAPK信号转导通路诱导CD8+T细胞毒性增强。

关键词： 褪黑素   脂肪细胞   内质网应激   炎症   生物钟  

摘要： 褪黑素作为多功能生物因子,具有多样的调节作用,包括抗氧化、抗炎以及参与免疫调节等,但是关于褪黑素是否通过影响内质网应激对炎症起作用却未知。本试验通过使用衣霉素处理建立3T3-L1脂肪细胞内质网应激模型诱导炎症,再用褪黑素,分别检测了其对内质网应激与炎症不同方面的影响以及作用机制,共获以下结果:1.褪黑素通过上调生物节律从而缓解内质网应激。使用1μmol/L褪黑素(Melatonin,MT)处理成熟的脂肪细胞24h之后,检测发现生物钟基因CLOCK和BMAL1的mRNA表达显著增加(P<0.05)、PER1、PER2、CRY1、CRY2和REV-ERB的mRNA表达显著减少(P<0.05),内质网应激和炎症相关基因表达也发生了显著的下降;用钙离子探针对脂肪细胞染色后发现,褪黑素处理显著减少钙离子荧光强度从而缓解内质网应激;通过检测PER1在MT处理前后的DNA甲基化水平显示,褪黑素通过下调生物钟基因PER1的DNA甲基化促进生物节律,其中甲基化结合蛋白3(Methyl-CpG-binding domain 3,MBD3)的减少最显著;进一步在细胞中干扰PER1后发现内质网应激关键通路分子ATF6的mRNA水平显著增加(P<0.05),使用生物信息学预测发现ATF6启动子区有两个位点可以与PER1的E-box位点相结合,通过荧光素酶活性检测发现干扰PER1基因可以显著增加两个E-box位点的相对荧光活性(P<0.05),说明PER1通过负转录调控ATF6缓解内质网应激。2.褪黑素减轻内质网应激介导的炎症反应。为了检测褪黑素对内质网应激介导炎症的现象作用,使用2 ug/mL的衣霉素(tunicamycin,TM)处理细胞12h构建内质网应激的模型,再用褪黑素处理,检测发现内质网应激标志因子ATF6、PERK、IRE1、GRP78、CHOP的mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05),炎症相关基因IL-6、TNF-α、NF-κB、NLRP3、IL-1β的mRNA和蛋白表达也显著增加(P<0.05),说明了内质网应激成功诱导炎症的发生,而MT处理可以缓解这种作用;此外,使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)处理,发现当内质网应激被抑制时,炎症相关基因表达显著下调。又通过活体注射20 mg/kg的褪黑素和1μg/g衣霉素,发现内质网应激和炎症相关基因在脂肪组织中的表达发现与细胞水平一致,并且通过对脂肪组织切片进行H&E染色,发现内质网应激条件下,炎性浸润现象明显,且ATF6的免疫组化水平显著增加,IL-6、TNF-α、GRP78和ATF6的免疫荧光强度也显著升高,而MT可以抑制这种作用,以上说明MT可以缓解内质网应激介导的炎症反应。3.褪黑素减轻内质网应激诱导M1型巨噬细胞极化介导炎症反应。脂肪细胞炎症与巨噬细胞之间的作用联系密切,本实验使用脂肪细胞与巨噬细胞共培养,分别使用脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)诱导M1和M2型巨噬细胞的成熟,脂肪细胞中超表达内质网应激关键通路因子ATF6,通过检测M1型巨噬细胞标志基因IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12以及M2型巨噬细胞标志基因CD163、CD206、IL-10和IL-4的mRNA及蛋白表达,发现脂肪细胞内质网应激条件下M1型巨噬细胞表面标志基因表达显著上调,M2型巨噬细胞表面标志基因表达显著下降;对IFN-γ和CD163的免疫荧光染色发现,脂肪细胞内质网应激可以促进IFN-γ的荧光强度,减弱CD163的荧光表达,而在添加了褪黑素之后,这些现象被逆转。此外,发现超表达ATF6后,炎性小体相关基因NLRP3、Pro-caspase1、Caspase1、Pro-IL-1β和IL-1β的mRNA及蛋白水平也发生了显著的上调(P<0.05),使用MT处理之后,作用相反,说明脂肪细胞内质网应激可以通过激活炎性小体表达促进炎症,而MT可以减轻这种作用。以上结果说明了褪黑素缓解内质网应激介导的炎症反应。综上所述,本试验明确了褪黑素在脂肪细胞内质网应激和炎症中的调控作用,即褪黑素通过增加生物钟基因节律表达抑制内质网应激诱导的炎症反应,并且发现DNA甲基化、基因转录调控及巨噬细胞极化等机制参与其中。本研究为治疗脂肪细胞炎症反应提供了新的靶点,为研究动物脂肪沉积的遗传调控提供一定的理论基础。

关键词： 微炎症状态   血液灌流   血液透析   护理  

摘要： 目的 探讨血液灌流联合血液透析对维持性血液透析患者微炎症状态的影响和护理.方法 选取于我院尿毒症透析患者42例(其中对照组和观察组各21例),对照组患者进行血透治疗,观察组行血液灌流联合血液透析治疗.观察治疗1个月前后的TNF-α、IL-6和hs-CRP水平.结果 观察组经治疗后炎症指标相比治疗前都有所降低,对照组治疗后TNF-α、IL-6和hs-CRP水平比治疗前有所增高,则观察组治疗后TNF-α、IL-6和hs-CRP水平明显低于对照组.结论 维持性血液透析患者存在着微炎症状态,而通过血液灌流联合血液透析治疗能够有效地降低炎症指标TNF-α、IL-6和hs-CRP水平,改善患者的微炎症状态.

关键词： 间充质干细胞   炎症   TNF-α   eIF2a   NF-κB  

摘要： 目的:探讨TNF-α作用于3种不同组织来源的人MSC炎症相关因子表达上调及其分子机制。方法:针对志愿者提供的人脐带、骨髓、脂肪源MSC,分别采用5、10、20 ng/ml TNF-α干预细胞不同时间后,采用定量RT-PCR和Western blot分析IL-8、MCP-1、GRP78、eIF2a、CHOP、NF-κB的基因表达,ELISA检测细胞上清可溶性IL-8、MCP-1的分泌量,并分析salubrinal、PDTC预处理后,内质网应激蛋白、NF-κB信号分子及IL-8、MCP-1蛋白表达水平。结果:不同浓度TNF-α引起3种不同来源MSC的IL-8、MCP-1 mRNA含量不同程度的增加(其中10 ng/ml TNF-α分别干预UCMSC、BMMSC、ADMSC 48 h后,使得细胞因子分别上升至对照组的59、328、506倍和3.7、132、521倍),两者的细胞蛋白表达量明显增加,同时TNF-α(10 ng/ml)还导致MSC可溶性的IL-8、MCP-1蛋白分泌量明显升高(3种MSC的细胞因子分别上升至对照组的 1.7、11.4、7.7 倍和 5.7、4.8、5.5 倍,P 值均<0.001)。TNF-α 刺激后,引起MSC内质网应激蛋白GRP78、CHOPmRNA含量增加,但并未引起XBP-lsmRNA含量改变;还导致 GRP78、GRP94、eIF2a、CHOP、cleaved Caspase-3 蛋白表达升高,且salubrinal能抑制eIF2a、CHOP蛋白表达增高的趋势,同时抑制IL-8、MCP-1细胞蛋白表达和可溶性IL-8、MCP-1分子分泌量的增加。TNF-α能够激活MSC的NF-κB信号通路,经PDTC预处理不仅抑制NF-κB的磷酸化,且同时抑制IL-8、MCP-1细胞蛋白表达和可溶性IL-8、MCP-1分子分泌量的增加;salubrinal还能抑制NF-κB磷酸化水平,抑制NF-κB信号通路。结论:TNF-α作用于3种不同来源人MSC可引起炎症相关因子分泌量的增加,并且随着时间和浓度的增加而增加。TNF-α激活MSC的内质网应激eIF2a/CHOP通路和NF-κB信号通路,导致IL-8、MCP-1细胞蛋白表达和可溶性IL-8、MCP-1分泌量的增加。TNF-α通过增强人UCMSC的eIF2a磷酸化而抑制NF-κB的磷酸化蛋白生成,部分降低IL-8、MCP-1的转录表达。