关键词：
托伐普坦
炎症
药物性肝损伤
机制
转录组学
摘要：
目的:研究炎症状态下托伐普坦致药物性肝损伤分子机制。（1）提高托伐普坦原料药溶解度及其生物利用度,制备与临床使用相似的托伐普坦固体分散体;（2）建立炎症状态下托伐普坦致C57BL/6小鼠肝损伤模型,模拟临床使用托伐普坦致肝损伤情况;（3）筛选出可能参与机制的差异表达基因及信号通路,并验证其导致的药物性肝损伤机制,为临床安全使用托伐普坦提供科学依据及参考意义。方法:（1）选择聚维酮K29/32为分散载体,溶剂蒸发法制备托伐普坦固体分散体,建立高效液相色谱方法测定托伐普坦含量,差示扫描量热法和X-射线粉末衍射法验证固体分散体中托伐普坦存在形式。（2）32只C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组、脂多糖（LPS）组、托伐普坦（TVP）组和炎症状态下的托伐普坦（LPS+TVP）组,对照组和LPS组连续给1%羟丙甲基纤维素（HPMC）溶液3天,TVP组和LPS+TVP组连续灌胃给予60mg/kg托伐普坦溶液3天。第3天,对照组和TVP组腹腔注射生理盐水,LPS组和LPS+TVP组腹腔注射4mg/kg LPS溶液,2h后,对照组、LPS组小鼠分别灌胃给予1%羟丙甲基纤维素溶液,TVP组、LPS+TVP组小鼠分别灌胃给予托伐普坦溶液（60mg/kg）。第4天,收集各组小鼠血浆、肝组织样本,生化指标试剂盒测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）、谷胱甘肽（GSH）变化值,观察H&E染色切片,液相色谱-质谱联用方法测定小鼠血浆中胆汁酸浓度变化。（3）利用Illumina高通量测序平台,Fast QC软件对原始数据进行质控,测序数据比对参考基因组序列后,运用生物信息学软件统计分析基因表达量,应用GO、KEGG pathway数据库对差异表达基因进行分析。（4）运用实时荧光定量PCR法和蛋白免疫印迹技术阐明炎症状态下托伐普坦致药物性肝损伤分子机制。结果:（1）建立了测定托伐普坦含量的高效液相色谱方法。流动相0.1%磷酸和乙腈的比例为40:60（v/v）,流速1.0m L/min,检测波长254nm,柱温40℃,托伐普坦保留时间约为4.6min,峰形较好,且与辅料PVP K29/32分离完全,托伐普坦在浓度范围为0.5-50μg/m L内线性关系良好（R2=1）,日内日间精密度≤8.37%,回收率在99.84-100.50%之间。差示扫描量热法和X-射线粉末衍射法方法验证固体分散体中托伐普坦以无定型形式存在。（2）当LPS和TVP联用时,ALT、AST水平显著性升高,TBA、TBIL有升高趋势,而GSH水平保持不变。病理切片结果显示二者联用时肝细胞呈不规则形态,且间隙明显变大,可见炎性浸润,肝索结构模糊或消失,有轻微的脂肪变性。小鼠血浆胆汁酸浓度变化结果表明,与对照组比较,LPS+TVP组有4种胆汁酸显著性下调,分别为CA、MCA、CDCA与NORDCA;与TVP组比较,LPS+TVP组有2种胆汁酸显著性上调（TCA、TCDCA）,3种胆汁酸显著性下调（UDCA、CDCA及NORDCA）。（3）通过转录组学研究筛选出小鼠肝脏药物代谢酶Cyp3a11,5种胆汁酸转运体Ntcp、Bsep、Mrp2、Mrp3、Mrp4,胆汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1,胆汁酸酰胺化酶Baat,炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及TLR4、My D88、NF-κB差异表达基因。（4）从基因及蛋白表达水平研究发现:在LPS存在下,小鼠肝脏内托伐普坦主要代谢酶Cyp3a11、胆汁酸转运体Ntcp、Bsep、Mrp2、Mrp3及其合成酶Cyp7a1表达显著性下调,Mrp4、Cyp8b1、Baat、Fxr、Pxr、Car基因表达显著性下调。除此之外,TLR4、My D88、NF-κB及TNF-α、IL-6、IL-1β表达均被上调。结论:（1）差示扫描量热法和X-射线粉末衍射法结果表明成功制备出托伐普坦固体分散体。建立的高效液相色谱方法简单、可靠,主药峰出峰时间较快,峰形较好,适合测定固体分散体中托伐普坦的含量。（2）生化指标、病理切片结果表明建立了炎症状态下托伐普坦致药物性肝损伤C57BL/6小鼠动物模型,胆汁酸浓度变化显示,炎症状态下托伐普坦扰乱胆汁酸稳态。（3）转录组学结合分子生物学手段研究炎症状态下托伐普坦致药物性肝损伤机制可能有两种:LPS与TLR4结合,触发TNF-α、IL-6、IL-1β的释放,这些促炎性细胞因子一方面抑制核受体Fxr,改变胆汁酸转运体及其合成酶、酰胺化酶表达;另一方面调控TLR4→My D88→NF-κB→Pxr/Car信号通路,下调药物代谢酶表达,从而抑制胆汁酸转运体。综上所述,托伐普坦破坏胆汁酸稳态并在炎症状态下通过Fxr与TLR4介导的信号通路诱发药物性肝损伤。
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