关键词： 慢性肾脏病4期   健脾益肾活血泄浊   微炎症状态  

摘要： 目的:探讨健脾益肾、活血泄浊法治疗CKD4期(脾肾气虚、瘀浊内阻型)患者微炎症状态的临床疗效。方法:选取我院门诊及住院病房符合纳入标准的CKD4期(脾肾气虚、瘀浊内阻型)患者60例,并随机分为治疗组与对照组。对照组予常规治疗,治疗组在此基础上加用益肾排毒汤合益肾活血方,两组均连续治疗3个月。观察患者治疗开始及结束时微炎症指标(hs-CRP、IL-6、TNF-α)、肾功能指标(Scr、BUN、eGFR)、Hb、ALB、血脂指标(TG、TC、LDL-C、HDL-C)及中医证候积分的变化,然后据此进行统计学分析和疗效分析。结果:(1)微炎症指标的比较:治疗后,两组患者hs-CRP、IL-6水平均有下降,与治疗前相比结果具有统计学差异(P<0.01或P<0.05),两组组间比较结果具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。治疗后,两组患者TNF-α水平均有下降,治疗组结果具有统计学意义(P<0.01),对照组结果无统计学差异(P>0.05);两组组间比较结果具有统计学意义(P<0.01)。(2)肾功能指标的比较:与治疗前相比,治疗组患者Scr、BUN水平均有下降,结果具有统计学差异(P<0.05);对照组患者Scr、BUN值比较结果无统计学差异(P>0.05);两组组间比较结果有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与治疗前相比,治疗组患者eGFR升高,结果具有统计学意义(P<0.05);对照组患者eGFR无升高,结果无统计学意义(P>0.05);治疗后两组组间eGFR值比较具有统计学意义(P<0.05)。(3)血红蛋白和白蛋白的比较:治疗后,两组患者Hb、ALB水平均提高,与治疗前相比均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),两组Hb值组间比较结果无统计学意义(P>0.05),两组ALB水平组间比较结果有统计学意义(P<0.05)。(4)血脂指标的比较:治疗后,两组患者TC、TG、LDL-C水平均降低,结果均具有统计学意义(P<0.01或<0.05);两组组间比较,TC、TG水平相比具有统计学差异(P<0.05),LDL-C值相比无统计学差异(P>0.05)。治疗后,治疗组患者HDL-C水平明显升高,结果具有统计学差异(P<0.01);对照组HDL-C水平无显著升高,结果无统计学差异(P>0.05);两组HDL-C水平对比具有统计学差异。(5)中医证候积分的比较:治疗后,两组患者中医证候积分均有降低,结果均具有统计学意义(P<0.05);两组组间比较,治疗组的中医证候积分比对照组降低更明显,结果具有统计学意义(P<0.05)。(6)中医证候疗效的比较:治疗后,治疗组的中医证候疗效率为82.6%,对照组中医症候疗效率为66.67%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)健脾益肾、活血泄浊法可有效降低CKD4期(脾肾气虚、瘀浊内阻型)患者血清hs-CRP、IL-6、TNF-α水平,改善微炎症状态。(2)健脾益肾、活血泄浊法可改善CKD4期(脾肾气虚、瘀浊内阻型)患者肾功能、血脂、贫血及营养指标,减轻慢性肾脏病并发症,从而延缓CKD进展。(3)健脾益肾、活血泄浊法可有效改善CKD4期(脾肾气虚、瘀浊内阻型)患者临床症状,提高治疗有效率。

关键词： 大黄   蒽醌   LPS   炎症   药效学模型   量效关系   构效关系  

摘要： 目的基于TLR4介导的MyD88依.赖信号通路和TRIF依赖信号通路,并结合药效动力学模型和中位效应方程定量地评价大黄酸、大黄素、芦荟大黄素体外抗炎的分子机制与量效关系,进一步明确大黄蒽醌类化合物抗炎活性与分子结构关系的科学内涵。方法1.采用MTT法检测大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对RAW 264.7巨噬细胞活性的影响,从而明确三种药物在该细胞系中的安全浓度范围,并确定实验浓度。2.采用预给药实验方案。大黄酸（80μM、40μM、20μM）、大黄素（80μM、40μM、20μM）、芦荟大黄素（20μM、10μM、5μM）分别与RAW 264.7巨噬细胞预孵育30 min后,加入LPS（终浓度1μg/mL）刺激,以LPS加入时间为“零”时间点。在0、5、15、30、60、90、120 min后,取细胞裂解液采用Western blot检测IKKβ、TBK1蛋白及其磷酸化蛋白的表达;0、10、30、60、120、240min后取细胞裂解液,Western blot检测NFκB p65、PI3K、IRF3蛋白及其磷酸化蛋白的表达;0、1、2、4、8、12、24 h后,取细胞裂解液采用Western blot检测iNOS蛋白表达,取细胞上清液采用Griess法检测NO浓度以及采用Elisa试剂盒检测IL-6、TNF-α、IFN-β、IFN-γ。从而考察大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对LPS诱导的TLR4-MyD88/TRIF依赖信号通路中上游蛋白以及下游炎性因子与干扰素动态变化的调控作用。3.采用Monolix?2016R1软件建立药效学模型,定量地捕捉大黄酸、大黄素、芦荟大黄素体外抗炎的动态变化与分子机制;同时三个药物分别设置七个浓度剂量组,取上清液分别用于检测IL-6和NO,并计算中位效应方程。结合药效学模型与中位效应方程,明确三种化合物的体外抗炎的量效关系与效价强度。4.分析对比大黄酸、大黄素、芦荟大黄素分子疏水性系数（logP）、极性/非极性去溶剂化能、拓扑极性表面积、分子表面静电势以及穿透磷脂双分子层的过量自由能,与药效学研究关联分析对比,从而揭示大黄蒽醌类化合物体外抗炎与分子结构关系（构效关系）的实质。结果1.0.1μM100μM大黄酸、大黄素以及0.1μM40μM芦荟大黄素在RAW264.7巨噬细胞为安全浓度范围,确定大黄酸、大黄素实验浓度分别为80、40、20μM,芦荟大黄素实验浓度为20、10、5μM。***可激活RAW 264.7细胞中MyD88依赖信号通路和TRIF依赖信号通路,且所涉及的上游蛋白表达以及下游末端因子的生成均有各自独特的动态变化。IKK-β在LPS刺激5 min后快速磷酸化并达到最高表达水平;NF-κB p65磷酸化水平在LPS刺激后的10 min即可检测到升高,随后逐渐减弱,在120 min时其磷酸化水平再度升高,其磷酸化水平呈振荡曲线趋势;PI3K在LPS刺激后60min迅速升高,并随时间增加而升高;TBK1在LPS刺激后的30 min可检测其磷酸化水平升高,并随时间推移而持续升高;IRF3在LPS刺激后60 min磷酸化水平显著升高,且进入平台期,在60～240 min内其磷酸化水平趋于稳定;iNOS蛋白表达水平在LPS刺激后的8 h显著升高,且在8 h24 h内持续升高;细胞上清液中NO的浓度在LPS刺激后的8 h24 h持续升高;细胞上清液中IL-6浓度在LPS刺激后的2 h8 h内显著升高,在8 h24 h其浓度趋于稳定;细胞上清液中TNF-α在LPS刺激后的0 h2 h内陡然升高,在4 h24 h其浓度略有降低且趋于平稳;细胞上清液中未检测到IFN-γ、IFN-β。3.大黄酸、大黄素、芦荟大黄素均可抑制LPS刺激引起的MyD88依赖信号通路和TRIF依赖信号通路的激活,可剂量依赖地下调IKKβ、NFκB p65、PI3K、TBK1、IRF3磷酸化水平,抑制下游iNOS的表达,以及NO、IL-6的分泌。同时观察到大黄蒽醌类化合物对TNF-α的分泌略有上调作用,这与IKKβ的双向调节作用有关。4.中位效应方程的结果表明,三种药物在相同浓度下,芦荟大黄素对IL-6以及NO生成的抑制率均强于大黄素、大黄酸。大黄酸、大黄素、芦荟大黄素抑制LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞生成IL-6的IC50为100.92μM、39.81μM、18.84μM,而抑制NO生成的IC50为53.12μM、46.80μM、17.83μM;药效动力学模型结果表明,大黄蒽醌化合物治疗该体外炎症的药效动力学模型为双靶点抑制模型,对NF-κB p65磷酸化和iNOS蛋白表达均有抑制作用,其中对NF-κB p65磷酸化的对数线性抑制系数为0.0125、0.0208、0.0410,对iNOS蛋白表达的对数线性抑制系数分别为0.

关键词： 2型糖尿病   Goto-kakisaki大鼠   十二指肠空肠旁路术合并袖状胃切除   胰岛素抵抗   白色脂肪   炎症  

摘要： 目的:目前的研究表明,白色脂肪组织微炎症状态是2型糖尿病的致病因素之一。然而,代谢手术后白色脂肪组织炎症状态的改变状况仍不清楚,且术后循环中糖尿病相关细胞因子的改变可能与炎症的改变相关。本次研究旨在明确减重代谢手术后皮下脂肪和内脏白色脂肪组织炎症状态的改变情况、循环中糖尿病相关激素的改变情况,并研究相关激素对巨噬细胞炎症状态的直接影响。方法:对接受十二指肠空肠旁路术合并袖状胃切除术的2型糖尿病患者进行回顾性分析。分析术前3天、术后12月体重、体重指数、空腹血糖、血红蛋白、胰岛素抵抗的稳态模型和C肽的变化情况。分析术前3天、术后3天和12个月胰岛素、肠抑胃肽、瘦素、纤溶酶原激活物抑制剂-1、抵抗素、胰高血糖素样肽-1、内脂素、胰高血糖素和胃饥饿素的变化情况。继而,在Goto-kakisaki大鼠上进行DJB-SG手术造模。每2周测定手术组与假手术组体重、空腹血糖、胰岛素抵抗的稳态模型评估和胃饥饿素的变化情况,术前与术后8周进行口服葡萄糖耐量试验。术后8周处死老鼠,收集大网膜上的内脏脂肪以及腹股沟处的皮下脂肪,然后使用免疫组织化学技术分析内脏白色脂肪组织和皮下白色脂肪组织中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和CD68表达的变化情况。分析Ghrelin及其拮抗剂处理RAW264.7细胞后其细胞表面抗原CD11c、CD206以及分泌因子TNF-α、白介素-10(IL-10)的变化情况。结果:与术前相比,术后12月患者体重指数、空腹血糖、血红蛋白、胰岛素抵抗的稳态模型评估均显著降低(P<0.05),C肽无显著变化;术后12月循环中胃饥饿素、瘦素、纤溶酶原激活物抑制剂-1和胰岛素水平均显著降低(P<0.05),术后3天开始肠抑胃肽水平显著降低,并持续到术后12月。与假手术组相比,大鼠从术后4周开始,体重、空腹血糖、胰岛素抵抗的稳态模型评估均显著降低(P<0.05);胰岛素水平显著升高(P<0.05);术后8周口服葡萄糖耐量显著降低(P<0.05);循环中胃饥饿素水平从术后4周开始显著降低(P<0.05);大鼠内脏脂肪组织中TNF-α、CD68表达显著降低(P<0.05),皮下脂肪无显著改变。细胞实验证实胃饥饿素显著下调RAW264.7中TNF-α的分泌(P<0.05),且该效应可以被其拮抗剂阻断;CDllc、CD206、IL-10无显著改变。结论:回顾性分析与动物实验都确认了DJB-SG手术能够显著降低体重、血糖。手术显著降低患者血液循环中胃饥饿素、瘦素、纤溶酶原激活物抑制剂-1和胰岛素水平,显著降低大鼠胃周脂肪组织炎症状态与血液循环中Ghrelin水平。体外实验发现,高剂量胃饥饿素作用于其受体,显著减少RAW264.7分泌TNF-α,提示术后胃饥饿素水平降低不能直接作用巨噬细胞,降低其TNF-α的分泌,其不是代谢手术改善脂肪组织炎症状态的直接原因之一。

关键词： 糖尿病神经病理性疼痛   晚期糖基化   吡哆胺   辛伐他汀  

摘要： 背景糖尿病神经病理性疼痛(DNP)是一种常见的糖尿病并发症。蛋白质糖基化形成晚期糖基化终末产物(AGEs)可能与DNP的发生以及全身性炎症反应有关。吡哆胺是一种AGEs抑制剂,动物和临床研究已证实,吡哆胺可以抑制一系列糖尿病相关器官损伤的病理过程,缓解某些类型的神经病理性疼痛。他汀类药物主要用于高胆固醇血症的治疗,近年来有学者发现他汀类药物有一定的缓解疼痛的作用。此外,他汀类药物还有抗炎抗氧化的作用。课题组设计了两部分动物实验分别验证吡哆胺和辛伐他汀能否缓解DNP以及减轻全身性炎症反应,并探索其机制。方法在第一部分的研究中,将雄性SD大鼠随机分配到正常+无菌水(NW)组、糖尿病+无菌水(DW)组、糖尿病+吡哆胺(DP)组和正常+吡哆胺(NP)组。利用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型。成功建模后DP组和NP组大鼠每天接受200 mg/kg剂量的吡哆胺灌胃,其他组大鼠每天接受相应体积的无菌水灌胃。建模后在各个时间点记录各组大鼠的血糖、体重、机械痛阈和热痛阈,第28天取腰段脊髓背角和血清保存。采用蛋白印迹法(WB)检测各组大鼠脊髓背角中晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达以及核转录因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的激活程度,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠脊髓背角中白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化以及血清中晚期糖基化修饰的低密度脂蛋白(AGE-LDL)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的变化,免疫荧光法检测磷酸化NF-κB(p-NF-κB)和RAGE在糖尿病大鼠脊髓背角中的细胞定位。在第二部分的研究中,大鼠被随机分配到正常+介质(NV)组、糖尿病+介质(DV)组和糖尿病+辛伐他汀(DS)组。通过腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型,成功建模后DS组每天按照15 mg/kg的剂量接受辛伐他汀腹腔注射,NV组和DV组每天接受相应体积的溶剂腹腔注射。建模后在各个时间点记录各组大鼠的血糖、体重、机械痛阈和热痛阈,第28天取腰段脊髓背角和血清保存。WB检测各组大鼠脊髓背角中RAGE、蛋白激酶B(AKT)和MAPKs的表达或激活程度,免疫荧光法检测p-AKT在糖尿病大鼠脊髓背角中的细胞定位,ELISA检测各组大鼠血清中ox-LDL和IL-1β的浓度。结果第一部分的结果显示,吡哆胺可以在一定程度上抑制糖尿病导致的机械痛阈下降,可以抑制糖尿病大鼠脊髓背角中RAGE/NF-κB和细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路的激活,对p38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的激活无明显影响。三组大鼠脊髓背角中TNF-α和IL-1β的表达量无明显差别,糖尿病大鼠脊髓背角中p-NF-κB和RAGE都表达在神经元细胞中,在小胶质细胞和星形胶质细胞中无表达。此外,批哆胺可以抑制糖尿病大鼠血清中AGE-LDL和ox-LDL浓度的升高。第二部分的结果显示,辛伐他汀可以在一定程度上抑制糖尿病导致的机械痛阈下降,可以抑制糖尿病大鼠脊髓背角中RAGE/AKT和JNK的激活,对ERK和p38的激活无明显影响,糖尿病大鼠脊髓背角中p-AKT表达在神经元细胞中,在小胶质细胞和星形胶质细胞中无表达。辛伐他汀还可以抑制糖尿病大鼠血清中ox-LDL和IL-1β浓度的升高。结论吡哆胺可以通过抑制糖尿病大鼠脊髓背角神经元中RAGE/NF-κB通路和脊髓背角中ERK的激活缓解DNP,可能通过降低糖尿病大鼠血清中AGE-LDL和ox-LDL的浓度减轻全身性炎症反应,进而缓解DNP。辛伐他汀可以通过抑制糖尿病大鼠脊髓背角神经元中RAGE/AKT通路和脊髓背角中JNK的激活缓解DNP。同时,辛伐他汀可能通过降低糖尿病大鼠血清中ox-LDL和IL-1β的含量减轻全身性炎症反应,进而缓解DNP。

关键词： 脑出血   心功能损伤   脾切除术   免疫-炎症反应   氧化应激  

摘要： 背景:自发的、非创伤性脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一种严重危害生命安全的脑卒中亚型,在全世界范围内有较高的死亡率和发病率。脑出血患者的心血管并发症很常见,并且与脑出血早期的死亡率和晚期的不良预后密切相关。罹患脑卒中后,人体免疫系统被激活,全身氧化应激反应增加。免疫反应和氧化应激可能参与了心肌功能障碍和心力衰竭的病理级联反应过程。在既往不合并心脏疾病的情况下,脑卒中也可能会引起心脏损伤。在本实验中,我们旨在研究脑出血是否在没有合并心脏疾病的情况下能够诱发心脏功能损伤,并评估免疫-炎症反应在脑出血介导的心脏功能障碍中的作用。方法:为了验证脑出血是否在不合并心脏疾患的情况下引起心脏功能损伤,在成年雄性C57BL/6J小鼠基底节区注射自体血诱导脑出血模型,对照组不进行自体血的注射。为了探讨是否免疫-炎症反应介导脑出血引起的心脏功能损害,在实验小鼠中行脾脏切除术,随后立即诱导脑出血模型,实验组包括:1)假手术-对照组;2)脑出血组;3)脾切除术合并脑出血组;4)单独脾切除术组（每组8只动物）。在脑出血术后的第7天和28天分别行超声心动图以检测心脏功能。mNSS试验和足错步试验用于检测神经运动功能;气味辨别试验和新事物识别试验用于检测神经认知功能;流式细胞术、蛋白印迹法和免疫组化染色等方法用于探讨脑出血引起心脏功能损伤的机制。结果:与假手术-对照组小鼠相比,脑出血小鼠:1)不仅引起神经运动和认知功能的严重损害,而且引起心脏功能的损害。脑出血后第7和28天的左心室射血分数（LVEF）及左心室短轴缩短率（LVFS）均明显下降。2)脑出血后第28天心肌细胞凋亡增加、心肌细胞肥大及心肌间隙纤维化明显增加;3)炎症因子和氧化应激指示物在外周循环和心脏组织中表达明显增加;CD45+/CD11b+/F480+标记的巨噬细胞和CD45+/CD11b+/Ly6G+标记的中性粒细胞在脑出血7天后大量浸润到心脏组织中。与脑出血小鼠相比,脾切除的小鼠在脑出血后表现出:1)神经运动和认知功能明显改善,随着LVEF和LVFS增加,心脏功能障碍明显减轻;2)心脏纤维化和心肌肥大显著改善;3)心脏组织中免疫细胞浸润减少,炎症因子和氧化应激指示物在心脏中的表达减少。与假手术-对照组相比,仅行脾切除术在手术后7天或28天内均不会损害心脏功能。结论:我们的研究结果表明,在不合并心脏疾患的情况下,脑出血亦可引起心脏功能的损伤。脾切除术不仅可以缓解脑出血后引起的神经运动和认知功能缺陷,而且可以通过抑制免疫细胞向心脏组织的浸润及炎症因子在心脏中的表达,对脑出血后的心脏起到保护作用,从而减轻脑出血后心功能损伤和心脏结构的改变。总而言之:免疫-炎症反应在脑出血后引起的心脏功能损伤中发挥了重要作用。

关键词： 多巴胺   酚妥拉明   全身炎症反应综合征   小儿腹胀  

摘要： 目的探讨多巴胺、酚妥拉明联合用于全身炎症反应综合征所致小儿腹胀的临床治疗效果。方法选取2018年1月～10月我院收治的全身炎症反应综合征所致腹胀患儿100例作为研究对象,将其随机分为两组,各50例。对照组采用对症支持治疗,观察组采用对症支持治疗+多巴胺+酚妥拉明,分析患儿治疗效果以及治疗指标。结果观察组患儿治疗总有效率、症状消失以及住院时间等均优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论全身炎症反应综合征所致小儿腹胀应用多巴胺、酚妥拉明联合治疗,可加速康复,提高治疗效果。

关键词： Nursing   Public health   Health care management  

摘要： The reduction of hospital readmissions is an initiative that will be ongoing for many years to come. A readmission to the hospital not only impacts the hospital and the skilled nursing facilities (SNF) fiscally, but most importantly, can also cause harm to the patient long-term. Sepsis is a particularly difficult diagnosis to prevent hospital readmission due to the high risk of recurrence and complications that may arise. Morbidity and mortality of patients diagnosed with sepsis is grim. The long-term effects of sepsis include a high mortality and debilitating side effects. The older adult and individuals with chronic conditions is at an even greater risk due to the aging process. There are, however, warning signs and if recognized early nursing can prevent sepsis recurrence. The increased awareness and recognition of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) criteria will contribute to the reduction of hospital readmissions. Several factors play a key role in the improvement of care for the frail older adult. Clinical staff compliance and administrative engagement have been identified as opportunities for improvement. As a result of the author’s project, the change in the standard of care had no significant impact on readmission rates due to a small sample size, but the findings demonstrated compliance and awareness are key factors necessary to improve the quality of care for SNF patients with a recent diagnosis of sepsis.

关键词： NLRP3炎症小体   钙网织蛋白   人类抗原R   肿瘤坏死因子-α   类风湿关节炎   成纤维样滑膜细胞  

摘要： 目的 类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以慢性、侵袭性关节滑膜炎为主要特征的系统性自身免疫性疾病,多种促炎细胞因子表达增加,参与RA的发病机制,其中TNF-α可诱发和维持受累关节滑膜的炎症,是RA致病中最关键的细胞因子。此外,本课题组前期报道钙网织蛋白(Calreticulin,CRT)可能参与了RA的发病进程,CRT在RA患者体内表达升高,且血清CRT水平与RA患者疾病活动度呈显著正相关。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体是一种触发炎症的大分子复合物,能识别多种病原相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP),引起白细胞介素的分泌,已有研究表明,在RA患者外周血单核细胞中,NLRP3炎症小体活化产物胱天蛋白酶1(Caspase-1)和IL-1β、IL-18明显升高。目前NLRP3炎症小体活化的分子机制尚未完全阐明。本课题拟探究TNF-α/CRT双信号对RA成纤维样滑膜细胞和内皮细胞中NLRP3炎症小体的活化作用及其调控分子机制,为揭示RA的炎症机制和寻找新的治疗靶点奠定实验基础。方法 1.收集天津医院关节外科中心行关节镜及膝关节置换术患者的滑膜组织标本进行实验研究,其中RA患者12例,OA患者10例。采用免疫组织荧光法观察分析NLRP3分子和ASC分子在RA及OA滑膜中的表达和定位。2.体外分离培养RA患者滑膜组织中的成纤维样滑膜细胞(FLS)(胶原酶消化法)和原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)。采用免疫印迹法(Western Blot)检测细胞裂解液中NLRP3,pro-IL-1β和pro-IL-18的表达,细胞培养上清中Caspase-1 p20的表达,以及RA和OA滑膜组织中Hu R分子的表达。3.实时荧光定量PCR检测RA FLS和HUVECs中NLRP3,pro-IL-1β和pro-IL-18的m RNA水平。4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA FLS和HUVECs细胞培养上清中IL-1β和IL-18的表达水平。5.采用免疫组织化学染色法(IHC)检测Hu R分子在RA及OA滑膜中的表达。6.采用细胞免疫荧光法(ICC)分析RA FLS和HUVECs中Hu R分子的表达和定位。7.采用小干扰RNA介导的基因沉默技术下调RA FLS中Hu R的表达。结果 1.间接免疫荧光结果显示,NLRP3和ASC分子在RA滑膜组织中的表达(0.095±0.005;0.076±0.003)高于OA(0.075±0.002,t=3.450,p=0.003;0.060±0.004,t=3.544,p=0.002)。在RA滑膜中的FLS和血管内皮细胞中均观察到NLRP3、ASC和cleaved-IL-1β的表达。*** Blot结果显示,TNF-α上调RA FLS和HUVEC中NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达,pro-IL-18在HUVEC中的表达也增加,但在RA FLS中没有变化。q RT-PCR结果显示,在TNF-α刺激的RA FLS中,与对照组相比(0.687±0.148;0.727±0.119),NLRP3和pro-IL-1β的m RNA表达显著增加(3.123±0.263,p<0.05;3.697±0.142,p<0.001),但pro-IL-18的表达没有明显差异(0.430±0.079,0.390±0.137,p>0.05);在TNF-α刺激的HUVEC中,与对照组相比(0.707±0.148,0.0833±0.023,0.303±0.160),三者的m RNA表达均显著增加(1.920±0.271,p<0.05;0.993±0.153,p<0.001;1.107±0.222,p<0.01)。*** Blot结果显示,TNF-α/CRT双信号刺激促进RA FLS和HUVEC中Caspase-1 p20的产生。同时与对照组相比,TNF-α/CRT组引起RA FLS[(222.9±25.66)pg/ml;(502.3±28.40)pg/ml,p<0.05]和HUVEC[(221.8±14.47)pg/ml,335.9±25.87,p<0.05]分泌型IL-1β的显著增加,分泌型IL-18在HUVEC培养上清中也显著升高[(37.91±11.17)pg/ml,(246.3±37.21)pg/ml,p<0.05],但在RA FLS中没有显著差异[(36.13±10.71)pg/ml,(55.87±9.468)pg/ml,p>0.05]。4.免疫组化(0.19

关键词： 阿尔茨海默病   淫羊藿苷   T淋巴细胞   神经炎症   细胞因子  

摘要： 研究背景阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经系统变性疾病和导致痴呆的疾病。AD的主要临床特征是进行性的记忆力和认知功能减退。最新统计数据显示全世界平均3秒钟就有一个新发AD病例,预计到2050年全球将会有超过1亿5千2百万患病人群。AD的病理特征包括细胞外β淀粉样蛋白(β Amyloid protein,A β)沉积形成老年斑和细胞内过度磷酸化的tau 蛋白形成神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)。虽然目前导致AD发生的具体病理生理机制仍然未完全研究清楚,但是越来越多的研究证据提示A β的沉积能够通过激活脑内小胶质细胞导致脑内神经炎症反应的发生。尸检病理研究发现T淋巴细胞出现在AD病变脑组织内神经炎性斑块和活化的胶质细胞周围。这一结果提示外周免疫系统中的淋巴细胞在推动神经炎症反应及神经细胞退行性改变的过程中起着重要的作用。在脑脊液中的淋巴细胞分析显示大约80%的淋巴细胞为CD4+的淋巴细胞。研究显示AD病人中存在不断增加的CD4+淋巴细胞的脑组织渗透,并且参与与A β引起的神经炎症反应。因此调节CD4+T淋巴细胞的增殖和分化可能是影响AD病理生理改变的有效途径。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是一种存在于中药淫羊藿中的天然的黄酮甙类化合物。研究显示ICA有抗炎、神经保护等多种药理学作用。已有研究显示,在AD的动物模型研究中ICA能够减少A β沉积和神经凋亡的作用。并且研究发现ICA能够减少淋巴细胞活化及CD4+T淋巴细胞促炎性细胞因子的释放。这些研究证据均提示ICA存在抑制慢性神经炎症反应治疗潜能,可能对AD存在治疗作用。AD转基因动物模型能够模拟AD病人的行为学以及病理改变,因此被认为是研究AD治疗新方法的最优选择。APP/PS1小鼠模型首先由突变的淀粉样前体蛋白(APP)转基因株Tg2576和突变体(presenilin 1,PS1)转基因小鼠杂交而成。这种小鼠模型表现出明细的海马椎体细胞层中淀粉样蛋白沉积和神经元的缺失,在AD病理生理机制研究中应用广泛。在本研究中我们选择应用APP/PS1小鼠模型,并给予长时间的ICA处理(8个月),分析ICA对A 日沉积和CD4+T淋巴细胞介导的免疫炎症反应在外周和脑内的影响,分析ICA对AD的治疗潜能及其具体机制。研究方法1.试剂淫羊藿苷(高效液相色谱法鉴定纯度>98%),购自北京索莱宝科技有限公司。2.动物模型野生型C57BL/6小鼠(n=16,雄性,4月龄),转基因突变小鼠C57BL/6J-TgN(APP/PS1)(n=16,雄性,4月龄)购于北京华阜康生物科技公司实验动物研究所。所有小鼠饲养于12小时明暗交替的饲养环境中,并且可以自由获取水与食物。动物实验规程和程序已获批准,符合中华人民共和国山东大学动物实验伦理委员会的伦理标准。3.实验实施所有按照小鼠随机原则分为4组(每组8只):野生动物组(WT),野生型动物淫羊蕾苷处理组(WT+ICA),转基因动物组(Tg),转基因动物淫羊蕾苷处理组(Tg+ICA)。ICA在蒸馏水中溶解。实验动物经过2周适应性饲养后按照(60 mg/kg/d)给予ICA灌胃处理8个月,对照组给予蒸馏水灌胃。灌胃治疗结束后,排除严重虚弱和死亡动物,每组随机选择6只动物进入下一步实验。4.行为学检测采用莫里斯水迷宫实验评价实验动物的空间学习能力和记忆功能的损伤情况。在直径120厘米高50厘米的水池中注满水。水温控制在23土1℃,并且通过加入奶粉使得池水浑浊不透明。在实验动物结束灌胃药物处理结束1周后开始进行行为学实验。在前5天内实验动物每天在水池的4个不同象限的起点开始进行实验,探索位置固定在水面下约1厘米处的平台。实验动物在每个象限区域开始探索的时间为60秒。如果实验动物在60秒内不能找到水面下隐藏的平台,实验成绩记录为60秒,实验动物将被引导在平台上停留15秒钟。在实验的第6天,去除池水液面下的平台,记录实验动物在平台象限区域停留时间和穿越平台位置次数。使用Smart3.0自动摄影记录和分析系统跟踪和分析行为参数。***方法检测海马A β行为学检测后实验小鼠用水合氯醛麻醉(水合氯醛腹腔注射)。经内眦动脉采集完外周血后,立即将实验动物大脑分离取出,在冰上并分离海马。之后将海马组织保存于液氮中。检测在海马组织中可溶性和不可溶性A β 40和A β 42。A β分离和检测方法参照酶联免疫试剂盒(BioLegend)说明测定。每个实验样本检测重复2次。应用酶标仪检测(Biorad,USA),记录在620纳米波长各个样本分光光度数据。6.流式细胞检测T淋巴细胞亚型采用内眦动脉采血,用肝素钠抗凝管收集实验小鼠的外周血。在4°C下,1000 rpm离心30分钟,收集上清血浆进行细胞因子检测。离心后细胞成分用1640培养液重悬

关键词： 大鼠   椎间盘   退变   基因表达  

摘要： 目的:探讨白介素-9(IL-9)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在椎间盘退变鼠中的表达及对免疫炎症反应的影响。方法:选择60只成年健康雄性SD大鼠作为研究对象,所有SD大鼠均为SPF级,月龄为6个月,平均体重(312.52±22.36)g。应用随机数字表法将大鼠分为观察组和对照组,每组30只。观察组建立动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型,对照组采用假手术方式处理,术后3个月进行取材,将大鼠颈4-5椎间盘取下,制作石蜡标本。分别从观察组和对照组中随机选取20只大鼠,进行颈椎间盘组织形态学观察,并通过免疫组织化学法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-9(IL-9)含量,每个标本取5张石蜡切片,采用免疫组织化学SP染色法检测TNF-α、IL-9的表达,并进行平均光密度值(MOD)的计算,每组剩余的10只大鼠进行颈椎间盘超微结构观察。结果:观察组颈椎间盘组织形态学可见纤维环板层结构紊乱,软骨细胞呈列兵样向髓核区移动,胶原纤维呈网状排列,可见部分髓核组织皱缩,髓核细胞变小;观察组超微结构可见细胞膜缺损,细胞表面的指状突起减少甚至消失,粗面内质网有轻度扩张,线粒体嵴突出现变性肿胀、崩解及空泡化,细胞核核内出现异染色质边集;观察组大鼠标本TNF-α及IL-9表达明显高于对照组;观察组大鼠标本中TNF-α与IL-9的MOD值明显高于对照组(P<0.05)。结论:通过观察大鼠颈椎间盘的组织形态学及超微结构,说明动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型可成功诱导大鼠发生颈椎间盘退变,通过免疫组化染色法发现IL-9及TNF-α均在颈椎间盘退变中呈高表达状态,但需进一步研究两者之间属于协同作用或其中一种为体内炎症反应的启动因子。