关键词： 银杏内酯B   氧化型低密度脂蛋白   活性氧   炎症蛋白  

摘要： 本文通过文献研究和实验研究两部分来探讨银杏内酯B(Ginkgolide B,GB)抑制氧化性低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导脐静脉内皮细胞炎症损伤的分子机制,对中医药防治动脉粥样硬化炎症反应的机理揭示有重要的临床意义和理论价值。 文献研究 1.中药银杏叶文献研究 银杏叶为银杏科银杏属植物的干燥叶,用作药物在我国已经有五千年的历史。首载于《本草品汇精要》,书中记载银杏叶“归肺经,能敛肺平喘,益心止痛”。从对历代文献的整理以及查阅中概括银杏叶的性味归经、功效主治等,为本课题提供了理论依据。 2.中药银杏叶近代化学和药理研究 中药银杏叶中含有多种化学成份,主要有24%的黄酮甙(flavonoid glycosides)和6%特有的萜烯(terpenes)。黄酮类化合物主要具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用。而萜类化合物则为强效血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)受体拮抗剂,具有抑制血小板聚集,抗血栓等作用。其中以银杏内酯B(以下简称GB)对PAF的拮抗性最强,具有广泛的临床应用前景因而近几年倍受关注。 3.有关动脉粥样硬化的研究 从分子生物学角度阐明动脉粥样硬化始动环节及其发生机理,明确其信号转导通路中的若干重要环节,进而有针对性地选取实验指标。 4.中医药对动脉粥样硬化的研究 从中医辩证论治的角度归纳动脉硬化的症型、病机、治则,并对近几年用于治疗动脉粥样硬化的药物进行简单综述。 实验研究 1. GB抗氧化损伤作用: 方法:用DCFH-DA荧光标记内皮细胞,流式细胞仪检测HUVEC内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;用Western blot方法检测ox-LDL诱导HUVEC上游p38MAPK磷酸化的水平;用硫代巴比妥法(TBARS)检测LDL的氧化程度。 结果:GB小剂量(25μg/ml)显著抑制LDL氧化,MDA氧化程度与未氧化组比较基本相同,但大剂量GB(200μg/ml)抑制作用不显著。活性氧测定表明300μg/ml ox-LDL刺激细胞明显增加了细胞内ROS含量,GB剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的ROS产生。300μg/ml ox-LDL刺激内皮细胞使p38MAPK磷酸化水平增加,300μg/ml GB有效抑制了ox-LDL诱导的p38MAPK磷酸化。 2. GB抑制炎症蛋白表达: 方法:免疫荧光染色观察NF-kB的活化。用Western blot方法检测ox-LDL诱导ICAM-1和COX-2的表达以及IkB磷酸化的水平。 结果:荧光显微镜下观察细胞经ox-LDL(1mg/ml)刺激后,NF-kB活化进入到核内,GB(500μg/ml)有效地抑制NF-kB的活化。同样结果也可以间接通过IkB的磷酸化水平趋势得以证实。ox-LDL(1mg/ml)作用于HUVEC,增强p38MAPK磷酸化以及增强了ICAM-1胞膜上表达,GB有效抑制了p38MAPK磷酸化以及ICAM-1的表达,但对炎症蛋白COX-2没有抑制作用。

关键词： 哮喘   气道反应   气道重塑   丝裂原活化蛋白激酶   信号传导   转录激活因子  

摘要： 研究背景和目的： 慢性气道炎症、气道重塑和气道高反应性是慢性哮喘共有的特征。与传统Th2/Th1平衡理论相驳，最近众多研究均显示Th1炎症可能在慢性变应性哮喘发展过程中发挥了重要的作用。因此，本实验利用能够在体示踪气道平滑肌细胞和肌纤维母细胞增殖活化的SMA-Cre/R26R转基因报告小鼠，通过慢性尘螨暴露建立慢性哮喘模型研究Th1炎症在气道重塑和气道高反应性(AHR)当中的地位。天龙咳喘灵是根据我院广东省名中医邱志楠教授临床验方研制的中药复方制剂，临床和体外实验提示其具有治疗气道高反应及抗肌纤维母细胞活化的作用。本研究在建立慢性哮喘小鼠模型及气道反应性体积描记法无创动态监测技术平台基础上，深入探讨并评价了该中药方剂抗重塑效应的特点，以及与表面激素发挥疗效的不同控制环节和可能的临床意义。 研究内容和方法： 第一部分小鼠气道反应性检测方法的建立、应用和比较 第一节小鼠有创和无创气道反应性检测方法对小鼠进行连续18天的OVA雾化激发制造慢性哮喘动物模型，分别使用有创和无创两种方法对小鼠气道反应性进行检测，从中分析两者及其相应参数R1和Penh在反映气道阻力当中的相关性。 第二节小鼠运动激发实验平台跑步机的建立制造小鼠跑步机，为研究哮喘运动激发试验搭建相应平台。 第二部分慢性尘螨变应原暴露诱导小鼠气道炎症的性质、及相关的气道重塑和气道高反应性的研究 1．使用本实验室建立的能够在体示踪气道平滑肌细胞和肌纤维母细胞增殖活化的SMA-Cre/R26R转基因报告小鼠，连续经鼻滴入尘螨溶液60天制作慢性变应原暴露小鼠模型;2．末次滴鼻24小时后利用有创性方法检测气道反应性，支气管肺泡灌洗(BALF)，计算BALF中细胞总数、分类计数;3．肺组织病理切片分别进行HE和LacZ染色，观察各组小鼠肺组织的病理变化;4．提取小鼠肺脏蛋白，Western Blot检测α-SMA表达变化;5．分离培养各组小鼠脾脏淋巴细胞，以佛波酯、离子霉素刺激培养的脾细胞，莫能霉素作为阻断剂，流式细胞术检测分泌IL-4和IFN-γ的CD3<'+>CD4<'+>脾细胞比例，检测肺匀浆上清细胞因子IL-4和IFN-γ的水平。 第三部分中药天龙咳喘灵水煎剂对支气管哮喘小鼠气道重塑的影响及其机制 1．小鼠随机分为盐水对照组，模型组，天龙咳喘灵水煎剂治疗组和BUD治疗组。除正常对照组，其它各组小鼠分别于第0、14日以OVA液腹腔注射致敏，第24天始每天给予雾化OVA溶液作激发，连续18天。每次激发后6小时，天龙咳喘灵水煎剂治疗组小鼠接受雾化3％中药天龙咳喘灵生理盐水治疗，激素治疗组接受1.67mg/ml BUD雾化作治疗;2．采用无创小鼠体积描记仪分别对最后一次激发后24小时(第41天)和96小时(第44天)小鼠的气道反应性进行测定;3．分别收集第41天和第44天小鼠BALF，细胞总数计算和分类计数;4．肺组织病理切片HE和免疫组织化学检查α-SMA染色;*** Blot检测肺组织当中α-SMA、磷酸化ERK和STAT3水平。 结论： 1．成功利用有创和无创方法对小鼠气道反应性进行检测。经分析，对于本实验所采用的Balb/c小鼠和造模方式，两种方法具有较高的相关性，无创方法适合于本实验当中对气道反应性的动态检测;2．慢性尘螨变应原暴露诱导了小鼠气道Th1炎症相关的气道重塑和气道高反应性;3．天龙咳喘灵水煎剂雾化能有效防治哮喘小鼠的气道重塑，本方剂当中可能存在某些天然化合物分子通过阻断ERKs和STAT3信号通路发挥其效应。

关键词： 肿瘤坏死因子   活性氧   MCF-7   肿瘤迁移   Snail   表达调控   EMT  

摘要： 恶性肿瘤是人类死亡的第二大主要因素,而且有逐渐上升的趋势,在有些发达国家,恶性肿瘤甚至以成为危害人类生命安全的头号杀手。而其中,乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,发病率位于女性恶性肿瘤之首。肿瘤生长的微环境是促进肿瘤进展和活化休眠的癌细胞的潜在致癌因素。许多实体肿瘤中都可以发现炎症细胞浸润,如肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和巨噬细胞。这些炎症细胞在肿瘤的发展中具有重要的作用:细胞转化、血管生成、转移。的确,在人乳腺癌和结直肠癌中的巨噬细胞浸润与肿瘤的血管生长之间有着密切联系,然而,肿瘤细胞原位产生的细胞因子发挥功能的重要性还不清楚。许多肿瘤的另一种特性是肿瘤细胞的低氧状态和活性氧产物的生成。 前人的研究表明,TNF-α,活化的NFκB和ROS均可以在某些细胞引起EMT,但该效应在乳腺癌细胞尚未见报道,而且TNF-α和ROS导致EMT的机制也不清楚。而TNF-α可以活化NFκB以及产生ROS,因此我们认为很有必要研究活化的NFκB和ROS如何导致EMT以及各自在TNF-α诱导EMT中的作用。 在发生EMT的过程中,特定区域的上皮细胞基因表达发生彻底改变,其中E-钙粘蛋白(E-cadherin)的下调似乎是关键事件。发生EMT的细胞失去细胞极性和细胞间连接,细胞外基质成分发生降解,细胞变得具有迁移性,可以从上皮上游离下来并迁移到不同的部位。EMT可由Snail从不同途径得到启动。Snail在这个过程中发挥核心作用,协调不同的信号途径。 因此,本实验首先观察了TNF-α对乳腺癌细胞系MCF-7迁移能力的影响,在此基础上观察了TNF-α和ROS对重要的转录因子Snail以及其下游分子E-cadherin的表达的影响,探讨了其中的可能机制。尽管MCF-7细胞的侵袭能力较低,我们发现经过TNFα处理后其侵袭能力增强,迁移的细胞数目达到对照组的两倍。与此一致,细胞表达的E-cadherin水平下降,而Vimentin水平升高。在此过程中Snail的表达增加。 此外,我们的实验发现NFκB的抑制剂阿司匹林可以阻止TNFα诱导EMT的发生,这表明在TNFα引发肿瘤转移的过程中,NFκB扮演着重要作用。NFκB的抑制剂阿司匹林和mIκBα可以抑制Snail的表达增加以及Snail启动子的活性。相反,我们的实验发现活性氧在TNFα促进细胞转移时扮演着次要作用,因为单纯清除TNFα产生的ROS并不明显抑制EMT的发生。但是,我们的实验发现H2O2自身可以促进EMT,其作用通路与TNFα诱导的EMT不同,其中NFκB仅发挥了次要的作用。 简言之,我们的实验涉及了TNFα在刺激细胞发生EMT时所起的重要作用,其中NFκB的作用主要是通过转录上调Snail和E-钙粘蛋白的表达,而在活性氧引起的EMT中,NFκB的作用不十分重要,这为肿瘤转移的预防过程中在不同的情况作用之下选择不同的药物提供了依据。事实也是如此,实验中我们发现Aspirin和NAC可以明显降低TNFα和H2O2处理后迁移的细胞数,即可分别有效的抑制TNFα和H2O2诱发的EMT。 基于前面的实验结果,我们可以发现ROS可以诱导Snail的表达,促进EMT的发生。而ROS的形成贯穿于很多生理病理过程。如表皮生长因子(EGF),成纤维细胞生长因子(FGF),转化生长因子β(TGFβ),肝细胞生长因子(HGF),这些生长信号刺激下均有ROS的产生。这些信号分子已经证实可以在不同的细胞背景下诱导Snail基因。所有这些提示ROS参与了多种信号条件下的EMT的发生。但是,前面的实验提示ROS下游分子NFκB在过程中并不扮演决定性作用。这使我们联想到转录后水平的调控。 除了转录水平之外,转录后调控,如mRNA转运和翻译,在基因的表达中也有重要的作用。尽管决定mRNA转运的机制仍然不清楚,但大家普遍认为可能涉及到RNA结合蛋白识别特殊的RNA序列。近来大家较为关注一种调节mRNA稳定性,由富含AU元件(AREs)介导的特殊途径,这一般发生于生存期短的mRNAs的3端非翻译区。HuR蛋白可以结合携带AREs的靶mRNA通过其RNA可识别区,从而调节许多靶mRNA的表达,包括编码c-fos,血管内皮生长因子,肿瘤坏死因子α,β-连环蛋白(?-catenin),c-myc,还氧化酶2(cyclooxygenase 2),肌细胞生成素(myogenin),MyoD,多种细胞周期调节蛋白,粒-巨噬细胞集落刺激因子,多种白细胞介素,p21, p27, p53和热休克蛋白70。有趣的是,H2O2能够增强HuR的细胞浆定位,进而增强HuR的功能。对Snail的mRNA的结构进行分析,我们发现Snail分子含有多个HuR结合元件

关键词： 肺炎链球菌   不可分型流感嗜血杆菌   肺组织急性感染模型   HOPE溶液   炎症反应   天然免疫   呼吸道上皮细胞   肺泡巨噬细胞   Toll样受体   丝裂原活化蛋白激酶   核因子-κB   凋亡  

摘要： 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, Spn）和不可分型流感嗜血杆菌（nontypcable Haemophilus influenzae, NTHi）是成人下呼吸道感染（包括社区获得性肺炎和慢性阻塞性肺病急性发作）中最常见和最重要的病原体。 Spn和NTHi的发病复杂，疾病的转归涉及细菌毒力因子和宿主免疫反应的平衡。各种宿主细胞、受体和信号传导通路在宿主抵抗Spn和NTHi的过程中起到重要作用。然而呼吸道上皮细胞、肺泡巨噬细胞在上述细菌所致肺部炎症反应中的作用以及它们与细菌相互作用的分子机制并未得到充分阐明。 Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）是近年发现的一个受体家族。TLR通过病原相关的分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMP）广泛且特异性地识别各种病原微生物，激活人体天然免疫，在感染早期发挥重要作用。在TLR受体家族中，TLR2，4与细菌发病的关系较为密切。TLR下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）通路是调控真核细胞反应的重要信号系统，参与了细胞对外界刺激的多种反应，包括细胞生长、死亡、细胞周期、炎症和应激反应等。 我们目前所掌握的关于上述病原菌发病和肺部宿主免疫反应的资料大多来自于动物模型，体外细胞模型研究以及临床标本的横断面剖析，而对于病原菌在人肺脏组织如何与宿主细胞相互作用以及动态转归，我们所知甚少。考虑到急性肺炎患者的肺组织标本很难获取，我们从胸科手术的肺组织标本中获取正常的肺组织，建立Spn和NTHi的肺组织体外急性感染模型（Acute lung infection model,ALIM），作为连接细胞和整体动物模型的桥梁，在组织水平研究肺部疾病的病理生理变化。利用该模型进行组织、分子病理学研究以及功能研究可以展示肺部感染性疾病发生发展的连续横断而（snapshot）。另外，ALIM模型与COPD慢性持续性病原感染者的肺组织标本相比较，将有助于我们阐明细菌定植和肺部慢性炎症持续存在的可能机制。 耐药菌株的涌现和疫苗预防效果的局限性使得Spn和NTHi发病机制的深入研究迫在眉睫。阐明Spn和NTHi感染的细胞和分子发病机制（如关键的受体和信号传导通路）将为呼吸道细菌感染性疾病的预防和控制开辟新的思路，提供新的干预靶标。 第一部分：人肺组织体外急性感染模型的建立 建立Spn和NTHi的人肺组织体外急性感染模型（ALIM）：从胸科手术标本中切取距肿块或结节5cm外的正常肺组织，肺组织块（1cm3）与不同浓度的Spn和NTHi共孵育4h，24h，48h后，收集上清，并取组织块置于羟乙基哌嗪乙磺酸-谷氨酸介导的具有保护作用的有机溶剂（HOPE）中固定。组织上清乳酸脱氢酶（LDH）结果提示：Spn和NTHi肺组织感染模型可在体外存活48h以上。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清白介素（IL）-8显示：Spn和NTHi以细菌浓度依赖的方式诱导ALIM炎症反应。经HOPE溶液处理的肺组织，抽提的RNA完整，无明显降解，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）显示：ALIM中IL-8 mRNA的表达较未予细菌刺激组明显增高。Immunoblot法可检测到ALIM组织中β-actin蛋白的表达。这提示：HOPE溶液对肺组织的核酸和蛋白质有着良好的保护作用。ALIM，作为连接人体细胞和整体动物模型的桥梁，使我们可以在组织水平研究肺部感染性疾病发生发展的连续横断面变化。ALIM和HOPE固定技术的结合为肺部疾病的细胞和分子发病机制研究提供了一个新的功能研究平台。 结论： 1．初步建立了Spn和NTHi的人肺组织体外急性感染模型。 ***-solution对肺组织核酸和蛋白质有很好的保护作用，可用于组织形态学和分子病理学的研究。 第二部分：肺炎链球菌致人肺组织炎症反应的细胞和分子机制研究 利用人肺组织体外急性Spn感染模型（ASIM）和体外细胞培养研究Spn诱导肺组织炎症反应的细胞和分子机制。原位杂交（ISH）结果显示：Spn感染离体肺组织24-48h后，在80-90％的肺泡巨噬细胞和15-30％的Ⅱ型肺泡上皮细胞内可检测到Spn-DNA，而支气管上皮细胞Spn的感染率极低（＜1％）。用抗生素杀死胞外细菌，取组织匀浆涂抹羊血琼脂培养板过夜后，可见Spn生长。免疫组化（IHC）结果显示：与对照组比较，氯膦酸盐／

关键词： 胃肠癌   肠粘膜通透性   营养状态   免疫功能   炎症反应  

摘要： 目的研究胃肠癌患者肠粘膜通透性与营养状态、免疫功能及炎症反应之间关系。 方法将124例胃肠癌患者对象按营养危险指数(NRI)分为三组:正常营养组(NN组)、临界或轻度营养不良组(BMM组)和重度营养不良组(SM组)。分别检测各组的营养、免疫、炎症指标及乳果糖/甘露醇(L/M)比值,观察肠粘膜通透性与营养状态、免疫功能、炎症反应之间的相互关系。 结果SM组PAB、ALB均较BMM组、NN组低(P<0.01),SM组TF较NN组低(P<0.01),SM组TF较BMM组低(P<0.05),BMM组ALB较NN组低(P<0.01),BMM组PAB、TF较NN组低(P<0.05)。SM组、BMM组IgA均较NN组低(P<0.01),SM组TLC、CD3、CD4、CD4/CD8较NN组低(P<0.01),SM组CD3、CD4较BMM组低(P<0.01),SM组TLC较BMM组低(P<0.05),BMM组TLC、CD4较NN组低(P<0.05)。SM组CRP均较BMM组、NN组高(P<0.01),BMM组CRP较NN组高(P<0.05)。SM组L/M比值较BMM组高(P<0.05);SM组L/M比值较NN组高(P<0.01);BMM组L/M比值较NN组高(P<0.01)。SM组L/M比值与其自身的ALB、TF、IgG、IgA、CD3、CD4、CD4/CD8直线负相关(P<0.01),与其自身的PAB、TLC直线负相关(P<0.05),与其自身的CD8、CRP直线正相关(P<0.01);BMM组L/M比值与其自身的TF、IgG、IgA、TLC、CD4、CD4/CD8直线负相关(P<0.01),与其自身的PAB、ALB、CD3直线负相关(P<0.05),与其自身的CD8、CRP直线正相关(P<0.01);NN组L/M比值与其自身的PAB、ALB、TF、IgG、IgA、TLC、CD3、CD4、CD4/CD8直线负相关(P<0.01),与其自身的CD8、CRP直线正相关(P<0.01)。 结论胃肠癌合并严重营养不良患者肠粘膜屏障损害较胃肠癌合并临界或轻度营养不良患者严重;胃肠癌合并营养不良患者肠粘膜屏障损害程度与其自身的营养状态、免疫功能呈负相关,与其自身的炎症反应呈正相关。

关键词： 大肠杆菌   感染   免疫应答  

摘要： 尿路致病性大肠杆菌(UPEC)所致的泌尿系感染临床表现是不同的,这不仅与菌株的毒力因子相关,而且与宿主的免疫应答密切相关,文中综述了近期UPEC感染的免疫应答和炎症反应机制的研究进展。

关键词： 丙烯醛   气道炎症   气道黏液高分泌   基质金属蛋白酶-9   p38丝裂原激活蛋白激酶   SB203580  

摘要： [目的]探讨p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路及其特异性抑制剂SB203580在气道炎症、黏液高分泌中的作用，阐明p38MAPK、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在黏液高分泌与黏蛋白基因转录中的相互作用机制。 [方法]成年雄性小鼠64只，实验随机分为4组：生理盐水对照组(NS组)、SB203580对照组(SB组)、丙烯醛模型组(Acro组)、丙烯醛＋SB203580干预组(Acro+SB组)，每组16只。模型组雾化吸入丙烯醛21天，干预组在吸入丙烯醛同时给予SB203580腹腔注射，采用生理盐水及单纯SB203580作为对照组。每组于第7天、第21天分别处死动物8只，应用HE、AB-PAS、免疫组织化学、RT-PCR和Western-Blot等方法分别观察气道炎症、黏液高分泌改变及检测磷酸化p38 MAPK、总p38MAPK、MMP-9和MUC5AC的表达情况。 [结果]小鼠吸入丙烯醛7天后出现气道炎症和黏液分泌增多，21天达到高峰，SB203580干预组炎性细胞浸润减少、杯状细胞增生改善、黏液分泌明显减轻；两组AB-PAS阳性着色面积分别为15.54±0.93％、9.82±0.56％，差异具有统计学意义(P<0.01)；免疫组化实验结果发现，生理盐水吸入和单纯SB203580对照组MUC5AC和MMP-9阳性表达较少，吸入丙烯醛21天时表达量分别为0.153±0.017、0.236±0.038，丙烯醛+SB203580干预组阳染明显较少，与模型组比较具有统计学差异(P<0.01)；同时，21天时丙烯醛模型组与同时相对照组比较，MUC5AC和MMP-9 mRNA(1.180±0.054、1.270±0.048)明显升高，应用SB203580治疗后二者表达均显著下调(P<0.01)，MMP-9与AB-PAS阳染面积、MUC5AC mRNA之间呈正相关；免疫印迹实验发现丙烯醛组总p38MAPK(1.016±0.06)和pp38 MAPK(1.004±0.039)蛋白激活，经SB203580干预后pp38 MAPK表达量下降(0.844±0.014)，与支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数、气道上皮黏液物质AB-PAS阳性染色面积及MUC5AC、MMP-9 mRNA比较呈正相关； [结论]丙烯醛吸入可刺激小鼠早期产生气道炎症，随着炎症进展，出现明显气道黏液高分泌，MMP-9可能参与对气道黏液高分泌的调控；p38MAPK是丙烯醛致小鼠气道黏液高分泌形成的重要信号转导途径，SB203580可抑制p38 MAPK蛋白磷酸化，在转录水平调节MMP-9，最终下调MUC5AC基因转录，揭示p38 MAPK／MMP-9通路可能是引起气道黏液高分泌新的分子机制和有效的治疗靶点。

关键词： 多囊卵巢综合征   慢性低度炎症   体重指数   胰岛素抵抗   甘油三酯   炎症因子  

摘要： 研究背景:多囊卵巢综合征(PCOS)患者存在慢性低度炎症状态，主要表现为炎症因子如c反应蛋白(CRP)、白细胞介素、白细胞总数的增高。这种炎症状态与心血管疾病的远期发病密切相关，目前对其产生机制尚存争议：内分泌异常、中心型肥胖、胰岛素抵抗等都是可能的诱因。治疗PCOS的常用药物如二甲双胍、口服避孕药对这种炎症状态的作用尚不明确，还待研究。 研究目的: 1)PCOS患者，尤其在体重指数正常的情况下，是否存在慢性低度炎症状态。 2)这种炎症状态与身体参数、性激素、血脂、血糖、空腹胰岛素、胰岛素敏感指数中的哪些指标相关，找出其影响因素。 3)观察不同药物治疗对PCOS患者身体参数、代谢指标、炎症指标的影响，找出慢性低度炎症的干预措施。 材料与方法:共纳入2006年7月．2007年1月到北京妇产医院内分泌科就诊的PCOS患者74名，和与之年龄、体重指数相匹配的健康妇女51名。 1)测量每个研究对象的身体参数(身高、体重、腰围、臀围、血压)、白细胞总数、CRP、性激素(睾酮、促黄体生成素、卵泡刺激素)、空腹胰岛素和糖脂代谢指标，并计算体重指数、腰臀围比值、腰围/身高比值和胰岛素敏感指数。 2)PCOS组随机予二甲双胍或复方醋酸环丙孕酮片治疗，3个月后复查基本身体参数、白细胞总数、CRP、空腹胰岛素和血糖。 结论: 1)本研究提示PCOS患者，无论体重指数正常与否，均存在慢性低度炎症状态。 2)这种炎症状态与胰岛素抵抗、体重指数和甘油三酯相关，与PCOS内分泌异常以及中心型肥胖无关。 3)二甲双胍可以改善PCOS患者慢性低度炎症状态，而复方醋酸环丙孕酮片可能使之激化。 4)建议使用复方醋酸环丙孕酮片治疗PCOS的同时，给予一定量二甲双胍，以减轻被复方醋酸环丙孕酮片激化的慢性低度炎症。

关键词： 一氧化碳   内皮细胞   炎症   白细胞   NF-κB   CLP   肝脏  

摘要： 脓毒症(Sepsis)是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中,是机体对感染的一种全身性炎症反应(SIR),表现为不能控制的炎症反应,脓毒症和SIRS在性质和临床表现上基本是一致的,只是病因不同而已。炎症反应是感染或非感染因素如细菌感染、外伤、烧伤、较大外科手术等,刺激宿主免疫系统,释放细胞炎症介质,发生的一种临床病理过程。以细胞因子为代表的多种炎症介质的失控性释放,产生过度炎症反应,不仅不能去除机体的致病因素,反而会抑制免疫系统。其继续发展则可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症和多器官功能不全。其共同病理生理特征是自身的免疫失控、体内白细胞大量激活,产生过量的炎症介质而引起全身多个脏器损伤。 一氧化碳(carbon monoxide,CO)在机体内由血红素加氧酶(HO)催化血红素产生,CO过去曾被认为是破坏细胞呼吸作用的有害物质。最近的研究发现CO是一种气体信号分子的,在损伤诱导的各种机体应激中具有保护组织的作用,并且CO在心血管、神经和免疫的生理和病理过程中都起着重要的调节作用。我们研究发现CO对炎症反应也具有抑制作用,但其机制尚未明确。 在本研究中,我们利用可以在机体内释放CO的一种新型金属—羰基化合物,一氧化碳释放分子(tricarbonyldichlororuthenium(Ⅱ)dimer,CORM-2),通过体外预处理和在体实验研究是否外源性CO对炎症反应具有抑制作用及其有效浓度范围,并且探讨CO的作用机制。 目的血管内皮细胞(VEC)是机体中一类重要的细胞群体,在体内广泛分布形成血液和组织之间的界面,构成机体的天然免疫屏障,具有重要的分泌、合成、代谢和免疫功能。由于新生儿脐带方便、易取,而且是同种细胞,排异性小,通过扩增可获得大量的内皮细胞,因此,我们采用HUVEC进行炎症机制的研究。在各实验室中,HUVEC培养条件也各异。本实验即为了创建本实验室HUVEC标准化模型并对此模型进行验证而进行了详细的研究。 方法人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)来源于6小时内新生胎儿脐带,宜在37℃,含5%CO、95%湿度的环境中培养,采用M199培养基。培养基中应含20%热灭活的小牛血清,10IU/ml肝素,抗生素(100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素),1.5μg/ml两性霉素B和80μg/ml内皮促有丝分裂剂,在75cm培养瓶中培养,24h后更换培养液,以后每隔2d换液1次,6-8天后细胞生长达融合。用1ml 0.25%胰蛋白酶和0.025%EDTA混合液(V=1/1)在37℃条件下消化,按1:3的比例传代。观察HUVEC的形态,并且需要对细胞形态、细胞内Ⅷ因子相关抗原表达进行检验。倒置显微镜下观察细胞形态并摄片,运用免疫组化法检测细胞内Ⅷ因子相关抗原的表达。 结果本实验室成功建立了HUVEC模型,实验细胞生长良好;经验证,该模型细胞生长融合后呈典型的铺路石状排列,细胞内Ⅷ因子相关抗原阳性率达95%,绿色的颗粒均匀地分布在整个细胞浆内。 结论本实验室培养的HUVEC在细胞形态、生长情况和特异性分泌抗原上符合实验要求。实验条件稳定易控,因而在本实验室条件下生长的HUVEC模型可以用于体外实验。 目的为了探讨机体脓毒症时的炎症反应机制,我们采用LPS对HUVEC进行刺激建立细胞脓毒症模型,在离体方面研究炎症反应的机制。CO是一种可扩散性气体信息分子,具有细胞保护作用,抗氧化的功能及抗炎作用。但是外源性CO抗炎作用的机制并未有明确的研究,为了评价CORM释放的CO对LPS诱导的内皮细胞活性的作用及潜在的机制,本课题也将进一步进行阐明。 方法取传代后生长达到融合的HUVEC,弃去细胞培养基,加入10μg/ml的LPS孵育液200μl,置入培养箱培养4h,空白对照组加入200μL M199液后也置入培养箱培养,培养箱条件均为37℃、5%CO和95%相对湿度。运用50μM、100μM剂量的CORM-2对HUVEC预处理2h,再进行LPS刺激4h,或者与LPS共同培养4h后,观察炎症反应过程当中,多种细胞因子、黏附分子、转录因子,以及参与炎症反应放大与延续的多种酶的变化。 结果HUVEC脓毒症模型的建立过程规范,各种条件易于控制,且模型的检测指标明确;损伤后PMN粘附率明显增高,NO、ROS活性明显增加,iNOS、ICAM-1、HO-1蛋白的表达明显增加,NF-κB活性也显著增高。相比与LPS共同培养,CORM-2的预处理对于炎症反应具有更加明显的抑制作用。 结论对脓毒症临床研究发现,阻断炎症介质的作用或应用LPS单克隆抗体效果并不明显。因此,阐明LPS激活内皮细胞的分子调控机制显得十分必要。HUVEC的脓毒症模型可以用于在细胞水平研究炎症的反

关键词： 烧伤   炎症反应   一氧化碳   内皮细胞   白细胞   CORM-2   抑制作用   分子机制  

摘要： 研究背景和目的： 炎症反应是感染或非感染因素如细菌感染、外伤、烧伤、较大外科手术等，刺激宿主免疫系统，释放细胞炎症介质，发生的一种临床病理过程。以细胞因子为代表的多种炎症介质的失控性释放，产生过度炎症反应，不仅不能去除机体的致病因素，反而会抑制免疫系统。其继续发展则可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症和多器官功能不全。SIRS共同的病理生理特征是自身的免疫失控、体内白细胞大量激活，产生过量的炎症介质而引起全身多个脏器损伤。 一氧化碳(carbon monoxide，CO)在机体内由血红素加氧酶(HO)催化血红素产生，CO过去曾被认为是破坏细胞呼吸作用的有害物质。最近的研究发现CO是一种气体信号分子的，在损伤诱导的各种机体应激中具有保护组织的作用，并且CO在心血管、神经和免疫的生理和病理过程中都起着重要的调节作用。我们研究发现CO对炎症反应也具有抑制作用，但其机制尚未明确。 在本研究中，我们利用可以在机体内释放CO的一种新型金属一羰基化合物，一氧化碳释放分子(tricarbonyl dichlororuthenium(II)dimer，CORM-2)，通过在体和体外实验研究是否外源性CO对炎症反应具有抑制作用及其有效浓度范围，并且探讨CO的作用机制。 方法： 体外实验： 1.内皮细胞的分离培养及鉴定：足月健康新生儿脐带6小时内以胶原酶酶消化，分离人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)，接种于M199培养液内，并根据细胞的生长状态、形态特征及检测膜上特异性抗原(VIII因子)进行内皮细胞鉴定。 2.不同浓度LPS刺激对HUVEC活性的影响：用终浓度10,50,100ug/ml的内毒素(1ipopolysaccharide，LPS)刺激培养细胞4小时，观察细胞形态学变化并进行活性检测(MTT法)，确定实验浓度，建立LPS刺激的HUVEC脓毒症模型。 3.粘附分子ICAM-1，E-selectin蛋白的表达的检测：采集有和无CORM-2干预后LPS刺激的细胞，胞浆蛋白提取，Western-blotting法测定ICAM-1，E-selectin的蛋白表达。同时测定HUVEC iNOS，HO-1的蛋白表达。 4.观测核因子NF-KB的活性：采集有和无CORM-2干预后LPS刺激的细胞，进行核蛋白提取，凝胶电泳分析法(EMSA)检测NF-KB的活性。 5.多形核白细胞(PMN)粘附实验：标准右旋糖昔沉淀法和梯度离层(分离)法从健康成人静脉血中分离出PMN。Na51CrO4放射标记，与HUVEC共孵育lh，液体闪烁仪进行核素计数，计算PMN粘附率。 6.细胞一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)测定：采集有和无CORM-2干预后LPS刺激的HUVEC，用DAF-FM和双氢罗丹明123(DHRl23)作为荧光探针，流式细胞仪检测细胞内NO和ROS的水平。 7.数据以mean±sd表示，采用SAS6.02统计软件进行t检验。 在体实验： 1.严重烧伤动物模型建立：烧伤组小鼠造成1 5％TBSA全层皮肤烧伤，CORM-2(8mg/kg;i-v.)在烧伤后立即进行干预。 2.肝功能和细胞因子测定：小鼠处死后立即左心室穿刺采血，全自动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性。血清、肺泡灌洗液ELISA法测定TNF-a和IL-1B水平。 3.肝肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测：取肝肺组织匀浆，胞浆蛋白提取，加入反应液，分光光度计(460nm)记录30秒至90秒吸光度值之差。 4.粘附分子ICAM-l，VCAM-1蛋白的表达的检测：采集有和无CORM-2(8mg/kg;i.v.)干预烧伤小鼠肝肺组织，进行胞浆蛋白提取，Western-blotting法测定ICAM-1，VCAM-1的蛋白水平。 5.观测核因子NF-Kb的活性：采集有和无CORM-2干预后烧伤小鼠肝肺组织，进行核蛋白提取，凝胶电泳分析法(EMSA)检测NF-Kb的活性。 6.在体显微镜观察肝窦和窦后血管内白细胞黏附：利用在体显微镜观察10个视野，每个视野至少包含一条窦后静脉，和8-10个肝窦，记录滚动和黏附的细胞数。 结果： 体外实验： 与对照组比较，LPS刺激HUVEC后，细胞形态随LPS浓度增加改变明显，活性降低，10ug/ml浓度比较适合用于研究。10ug/ml LPS刺激后细胞内ROS、NO产生增加，NF-Kb活性增高，黏附分子ICAM-1蛋白表达、PMN与HUVEC的粘附比例均显著增加，E-selectind蛋白表达无显著改变。利