关键词：
低频脉冲超声
脂多糖
牙周膜细胞
细胞凋亡
Yes相关蛋白
摘要：
目的:初步探索低频脉冲超声（Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS）对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）凋亡与自噬的影响,其分子机制是否与Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）有关。方法:1.应用组织块酶消化法分离培养人牙周膜细胞。分离出牙周膜组织,培养3-5d后待细胞爬出,融合度达到80%进行传代培养,从而分离出hPDLCs,用于后续实验。2.检测LPS对hPDLCs活性的影响,并筛选LPS浓度。实验分组为对照组、低浓度LPS（1μg/mL）组和高浓度LPS（10μg/mL）组。当细胞融合度达到80%时,CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化,流式细胞术检测细胞周期以及细胞凋亡变化。电镜检测观察自噬小体的形成。3.检测LIPUS是否影响hPDLCs的增殖或凋亡,以及炎症状态下LIPUS作用后hPDLCs增殖或凋亡的变化。将hPDLCs根据细胞状态不同（正常状态、不佳状态）分为两组,细胞融合度达到70%时,每天超声（90mW/cm2）处理30min,处理2天,当细胞融合度达到80%,流式细胞术检测hPDLCs增殖、凋亡水平。另将正常状态细胞分为四组:对照组,LIPUS处理组,LPS处理组,LPS+LIPUS处理组。在hPDLCs融合度达到70%时,运用高浓度LPS处理,12h后LIPUS辐照30min,当细胞融合度达到90%时,流式细胞术、TUNEL染色、WB检测细胞凋亡。4.检测LIPUS通过YAP对炎症状态下hPDLCs产生凋亡/自噬的影响。当hPDLCs细胞融合度达到40%时,LPS处理,12h后,进行LIPUS处理,然后在细胞融合度达到70%时,进行免疫荧光检测YAP蛋白定位变化;当hPDLCs细胞融合度达到70%时,LPS处理,12h后,进行LIPUS处理,细胞融合度达到90%时,提取蛋白,WB检测LPS与LIPUS对YAP、凋亡相关蛋白以及自噬相关蛋白的影响。电镜观察LIPUS及LPS对hPDLCs中自噬小体的影响。结果:1.应用组织块酶消化法,成功获得了人牙周膜细胞。2.牙周膜细胞经过CCK-8检测细胞生长发现,应用不同浓度的大肠杆菌来源的LPS（1μg/mL、10μg/mL）刺激hPDLCs,未能明显影响细胞的增殖。流式细胞术检测发现,应用不同浓度的大肠杆菌来源的LPS（1μg/mL、10μg/mL）刺激hPDLCs,对于hPDLCs的细胞周期的影响均不明显。采用流式细胞仪检测细胞凋亡发现,应用不同浓度的大肠杆菌来源的LPS（1μg/mL、10μg/mL）刺激hPDLCs,高浓度的LPS促进细胞早期凋亡。电镜观察高浓度LPS能够促进hPDLCs形成自噬小体。***对于状态不佳的hPDLCs的促进增殖效果明显,而对状态良好的hPDLCs没有明显积极作用。LIPUS辐照后,流式细胞术检测发现LIPUS明显抑制了hPDLCs的早期凋亡。流式细胞术检测、TUNEL细胞染色以及caspase-3蛋白检测发现,LIPUS能够一定程度地减少炎症状态下凋亡hPDLCs的数量。4.通过免疫荧光以及WB检测,LIPUS处理组明显增加YAP表达,且YAP转运入核;LPS则有抑制作用,但能促进磷酸化YAP表达。电镜观察到LPS促进自噬小体形成,WB检测LPS促进LC3-Ⅱ表达,而LIPUS能减弱这种对自噬的促进作用。敲低YAP基因后,LIPUS对hPDLCs凋亡的抑制作用明显减弱,并且能恢复LPS促进自噬的作用。结论:高浓度LPS促进hPDLCs凋亡,LIPUS则抑制细胞凋亡。LPS能够抑制YAP活性,促进YAP磷酸化,而LIPUS激活YAP,抑制YAP磷酸化。LIPUS可能通过提高YAP蛋白表达并转运入核从而抑制在炎症环境中的hPDLCs凋亡与自噬。
欢迎来到三峡大学图书馆！
中文科技期刊
详细信息
