关键词： OCTN1/2   ASP+   炎症   慢性阻塞性肺疾病   玉屏风  

摘要： 玉屏风在哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的治疗方面有着积极表现,临床上常采用与化药协同治疗的方式改善肺部炎性疾病患者缓解期的症状,然而这种联合用药的分子机制仍不清楚。课题从转运蛋白的角度出发,监测玉屏风对OCTN1/2的干预作用,探讨玉屏风与支气管扩张药物联用的分子机制。实验以Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549代替人原代上皮细胞,使用Western Blot和q RT-PCR检测OCTN1/2蛋白和m RNA的表达;以ASP+作为探针检测OCTN1/2的底物转运活性,计算米曼常数（Km）;采用Transwell小室体外培养的方法建立单层肺泡上皮细胞模型,观测ASP+的双向跨膜转运过程并计算表观渗透系数(Papp)。结果发现,与LPS诱导的炎症模型组相比,玉屏风及其单味药组能够在不同程度上降低炎症因子IL6和TNF-α的分泌,提高OCTN1/2的表达;各组Km值分别为NC（577.37±82.53μM）、LPS（649.46±88.21μM）、LPS+AR（489.49±101.08μM）、LPS+AMR（581.38±76.22μM）、LPS+SR（601.99±57.75μM）和LPS+YPF（452.81±38.77μM）。与LPS组相比,玉屏风及其单味药组的Km值均存在下降趋势;由A to B方向的ASP+跨膜转运实验发现,玉屏风组的表观渗透系数为(30.22±1.87×10-6 cm/s),其次分别为白术组(27.79±2.44×10-6 cm/s)、防风组(25.80±3.53×10-6 cm/s)和黄芪组(25.56±2.86×10-6 cm/s),均大于LPS组(22.80±0.94×10-6 cm/s)。以上结果表明,LPS诱导的炎症会降低肺泡上皮细胞中OCTN1/2的表达和功能。作为一种中药复方,玉屏风在降低细胞炎症反应的同时,能够提高转运蛋白OCTN1/2的表达及活性,促进底物跨单层肺泡上皮细胞膜的转运吸收。炎症状态下玉屏风对OCTN1/2表达及功能的调节作用,有助于阐明玉屏风、转运蛋白和体内药物递送之间的关系,揭示玉屏风在用于哮喘和COPD治疗时可能存在的药物相互作用,为新药研发提供了潜在的目标靶点。

关键词： 百日咳毒素   2型固有淋巴细胞   白介素-33   脑卒中  

摘要： 目的:脑卒中后脑内炎症反应参与损伤级联扩大及神经功能恶化,但其特点与直接作用尚不明确。本研究通过注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTx)增强脑缺血或出血后脑内炎症反应,观察脑内炎症特点、病理变化及临床结局,明确脑卒中后脑内炎症的直接作用。在细胞调节水平,具有获得性免疫功能的固有淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)亚群对脑卒中的免疫调节作用与机制尚不明确。因此我们研究以2型为代表的ILC及其调节因子白介素(interleukin,IL)-33对脑卒中的影响,以明确脑卒中后免疫细胞介导的炎症反应特征与机制,为免疫调节治疗提供实验依据。方法:第一部分:野生型C57BL/6小鼠100只,雄性,予以分为5组,假手术组(Sham组)、脑缺血组(MCAO组)、PTx处理脑缺血组(20μg/kg PTx+MCAO组)、脑出血组(ICH组)、PTx处理脑出血组(20μg/kg PTx+ICH组)(随机数字法),每组20只。采用线栓法对野生型C57BL/6小鼠建立60分钟大脑中动脉缺血再灌注模型。采用胶原酶微量泵注射法制备野生型C57BL/6小鼠脑出血模型。应用改良的神经功能缺损评分量表、转棒疲劳实验检测第1-3天各组小鼠的神经功能损伤情况;用流式细胞术对第3天各组小鼠的病灶侧脑组织免疫细胞浸润情况进行分析,包括小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD4T细胞、CD8T细胞;小动物活体成像技术对第3天各组小鼠中枢活性氧进行标记示踪;免疫荧光染色的方法对内皮细胞与紧密连接蛋白ZO-1、内皮细胞与紧密连接蛋白Claudin-5共染,观察第3天各组小鼠的血脑屏障通透性。第二部分:野生型C57BL/6小鼠40只,雄性,予以分为2组,假手术组(Sham组)与脑缺血组(MCAO组)(随机数字法),每组20只。流式细胞分析比较各组小鼠MCAO模型制备后第3天脑、脾、外周血的ILC2计数;免疫荧光染色法分析少突胶质细胞、星形胶质细胞中IL-33表达水平。应用药理学干预和转基因动物,研究删除、转输或活化ILC2细胞对神经功能评分和梗死体积的影响:分组1)野生型C57BL/6小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组(Vehicle组)与删除ILC2组(anti-CD90.2组)(随机数字法),每组10只。2)应用免疫缺陷的Rag2γc小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组(Vehicle组)与ILC2转输组(ILC2组)(随机数字法),每组10只。3)野生型C57BL/6小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组(Vehicle组)与IL-33处理组(IL-33组)(随机数字法),每组10只。应用小动物磁共振成像仪T2成像比较各组小鼠MCAO模型制备后第1、3、7天脑梗死病灶体积;改良的神经功能缺损评分量表、转角实验比较各组小鼠MCAO模型制备后第1、3、7天神经功能损伤情况。结果:第一部分:(1)各组小鼠神经功能损伤情况:与MCAO组相比,第1-3天20μg/kg PTx+MCAO组小鼠改良的神经功能缺损评分明显增高(*P<0.05),转棒疲劳实验小鼠停留的时间明显减少(*P<0.05)。与ICH组相比,20μg/kg PTx+ICH组小鼠改良的神经功能缺损评分明显增高(*P<0.05),转棒疲劳实验的时间明显减少(*P<0.05)。(2)各组小鼠中枢免疫细胞浸润分布:与Sham组相比,MCAO组与ICH组小鼠脑内小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD4T细胞、CD8T细胞显著增多(*P<0.05)。分别与MCAO组、ICH组相比,20μg/kg PTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组小鼠中枢内B细胞、CD4T细胞、CD8T细胞明显增多(*P<0.05)。此外,分别与MCAO、20μg/kg PTx+MCAO组相比,ICH、20μg/kg PTx+ICH组小鼠中枢内中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD8T细胞明显减少(*P<0.05)。(3)各组小鼠脑氧化应激对比:与Sham组相比,MCAO组、ICH组第3天的活性氧产生显著增多,氧化应激水平显著增高(*P<0.05)。20μg/kg PTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组的氧化应激水平较未处理组明显增高(*P<0.05)。(4)各组小鼠血脑屏障染色:与Sham组相比,MCAO组、ICH组第3天的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5表达显著减少。分别与MCAO组、ICH组相比,20μg/kgPTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5表达进一步减少。第二部分:(1)与Sham组相比,MCAO组野生型C57B

关键词： 内脂素   原核表达   Raw264.7   蛋白生物活性   断奶仔猪   免疫应激   LPS  

摘要： 内脂素(Visfatin)是一种新型脂肪细胞因子,与机体炎症和免疫应答反应密切相关。断奶仔猪免疫应激是影响仔猪生产性能的重要原因之一,其主要的病理变化是炎症反应,但最终导致仔猪生长的受阻,给畜牧业生产造成巨大经济损失。本实验室前期研究表明,在脂多糖(LPS)诱导的断奶仔猪免疫应激动物模型中,脾脏白髓和红髓中的内脂素阳性表达产物显著增多,推测内脂素作为炎性介质可能参与了断奶仔猪免疫应激炎症反应的发生和发展。为了获得大量内毒素含量低、并具有生物活性的猪内脂素重组蛋白,并明确其在断奶仔猪免疫应激反应中的作用。本研究首先利用原核表达,蛋白质纯化,生物活性验证,Western Blot,q RT-PCR和ELISA技术制备猪内脂素重组蛋白。然后在利用LPS诱导成功构建的断奶仔猪免疫应激模型基础上,通过q RT-PCR,ELISA,免疫组织和TUNNEL法研究内脂素在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用。具体研究结果如下:1猪内脂素重组蛋白的原核表达及纯化条件优化以猪肝脏组织总RNA为模板,利用PCR技术,扩增猪内脂素基因,转入p EASY-T1载体后,再转化Trans5α。进行质粒提取,并与p ET-28a和p ET-30a同时进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切;将胶回收得到的Visfatin目的基因片段分别连接到p ET-28a和p ET-30a载体上,转化DH5α,对含有目的基因的表达载体进行克隆;提取重组表达质粒分别转入大肠杆菌Trans BL21和Transetta,经IPTG诱导表达、蛋白经纯化系统AKTAprime10纯化后,采用SDS-PAGE和Western Blot技术进行检测。结果表明,Visfatin-p ET28a-Transetta在16℃诱导16h条件下,能稳定表达出大量高纯度的猪重组内脂素蛋白,为最优表达菌株。2猪内脂素重组蛋白中内毒素去除及检测各国对生物制品的内毒素含量都有严格的要求,为保证生物制品使用的安全性,必须加以去除。本试验选用内毒素去除试剂进行猪内脂素重组蛋白中内毒素的去除,并使用内毒素检测鲎试剂盒检测去除效果。结果表明,去除内毒素后的猪内脂素重组蛋白残余量低于1EU/m L,在安全范围内,防止了其可能对后续试验结果判断产生的影响。3猪内脂素重组蛋白生物活性验证将去除内毒素后的猪内脂素重组蛋白作用于Raw264.7细胞。CCK-8结果显示,随着内脂素浓度的增加,细胞存活率先升高后降低,均高于阴性对照组,当浓度为700 ng/m L时,细胞存活率最高,且差异极显著(p?0.0001),提示内脂素具有促进Raw264.7细胞存活的作用。随后分别设置PBS组、Visfatin组和Visfatin+Poly.B组,并与细胞共孵育6h。q RT-PCR和ELISA结果显示,与PBS组相比,Visfatin组炎症因子IL-1β、TNF-α和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均差异极显著上调;而Visfatin+Poly.B组与Visfatin组相比,炎症因子的m RNA和蛋白表达水平却均没有明显差异。上述结果表明,猪内脂素重组蛋白促进Raw264.7细胞的炎症活动,而残留的内毒素不起作用,证明猪内脂素重组蛋白具有生物学活性。4猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪炎症因子表达的影响利用LPS诱导构建断奶仔猪免疫应激模型,测定每头猪的体重及脾脏重量,并计算脾脏指数(脾脏重量(g)/体重(kg)),结果显示:与PBS组相比,LPS组脾脏重量和脾脏指数明显上升,且均差异极显著(p?0.001),Visfatin组的则无显著变化;而LPS+Visfatin组脾脏重量和脾脏指数与LPS组的相比,明显降低,且均差异极显著(p?0.01)。采用q RT-PCR和ELISA技术检测各组脾脏组织中炎症因子IL-1β、IL-6和MCP-1表达变化,结果显示,与PBS组相比,Visfatin组IL-1β、IL-6和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均没有明显差异,而LPS组的却均显著升高。与LPS组相比,LPS+Visfatin组IL-1β、IL-6和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均显著降低。以上结果表明:LPS激活脾脏免疫系统,诱使淋巴细胞合成大量的炎性细胞因子,致使脾脏功能亢进肿大,而内脂素能通过下调炎症因子的表达,降低LPS引起的脾脏组织炎性损伤。5猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪抗氧化功能的影响采用ELISA检测各组猪外周血清中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达量变化。结果显示:与PBS组相比,Visfatin组的MDA表达量无显著差异,GSH-Px和SOD均明显升高,而LPS组的MDA的表达量却明显升高,且差异极显著(p?0.01),但GSH-Px无明显变化,而SOD和

关键词： 腹腔镜   肝癌切除术   免疫功能   炎症反应  

摘要： 目的:研究腹腔镜肝癌切除术对患者的免疫功能、炎症反应的影响.方法:选择2017年7月-2018年7月医院收治的肝癌患者104例,随机分为对照组和观察组,每组52例.对照组采用传统开腹肝癌切除术治疗,观察组采用腹腔镜肝癌切除术治疗.比较两组患者手术前后的免疫功能及炎症反应.结果:手术前,两组免疫功能指标无显著差异(P>0.05);手术后,观察组IgA(2.32±0.32)g/L、IgM(1.94±0.22)g/L、IgG(9.80±1.11)g/L,均高于对照组(P<0.05).手术前,两组炎症反应指标无显著差异(P>0.05).手术后,观察组PCT(6.08±0.56)ug/L、IL-6(12.28±1.56)pg/L,均低于对照组(P<0.05).结论:采取腹腔镜肝癌切除术的方法治疗肝癌,对患者免疫功能影响更小,患者术后炎症反应更轻,对于患者术后康复更为有利.

关键词： 没食子酸   断奶仔猪   炎症反应   小肠上皮细胞   屏障功能  

摘要： 仔猪在断奶等因素影响下产生免疫应激,引发肠道炎症发生,从而导致出现腹泻等一系列健康问题,植物源生物活性物质可通过调节免疫信号通路来改善畜禽肠道健康。没食子酸（Gallic acid,GA）作为一种植物源生物活性物质的多酚类化合物具有抑菌、抗氧化和抗炎等多种生物功能。目前对没食子酸调控断奶仔猪肠道免疫功能的作用及其具体机制知之甚少。本研究拟通过体内动物试验、体外细胞培养试验相结合来探究没食子酸对仔猪肠道黏膜炎症反应的调控作用及其分子机制。本研究主要包括以下4个部分:（1）研究日粮中不同水平没食子酸添加量对断奶仔猪生长性能及腹泻率的影响。挑选96头初始体重相近的杜?长?大三元杂交断奶仔猪,随机分为4个处理:对照组（基础日粮）、GA 100组（基础日粮+100 mg/kg GA）、GA 200组（基础日粮+200mg/kg GA）、GA 400组（基础日粮+400 mg/kg GA）。每个处理设6个重复（栏）,每个栏放置4头仔猪。试验周期为21天。（2）研究日粮中不同水平没食子酸添加量对攻毒断奶仔猪抗氧化和免疫功能的影响。在动物试验第21天,每栏各选取1头体重中等的仔猪,腹腔注射脂多糖（LPS）刺激4小时以诱导肠道炎症反应。（3）研究外源添加没食子酸对损伤IPEC-J2细胞的保护作用。体外培养猪小肠上皮细胞IPEC-J2,使用H2O2或LPS刺激细胞建立应激模型,测定相关氧化和免疫指标。（4）研究没食子酸对IPEC-J2细胞免疫功能的影响。使用NF-κB通路特异性抑制剂bay11-7082,抑制NF-κB信号通路,明确没食子酸调控IPEC-J2细胞免疫功能和屏障功能的关键靶点。试验结果表明:日粮添加没食子酸对仔猪的生长性能以及LPS攻毒前/后的抗氧化状态无显著影响（P>0.05）;但日粮添加400 mg/kg的没食子酸能显著降低仔猪腹泻率（P<0.05）。添加不同剂量的GA可通过提高绒毛高度、降低隐窝深度以及提高两者的比值（P<0.05）,来改善仔猪肠道的形态,其中对空肠的作用优于对回肠的作用。此外,GA还能通过增加肠黏膜sIgA的分泌以及降低各类促炎性细胞因子的表达（P<0.05）,来调节攻毒断奶仔猪的免疫功能。体外细胞试验表明,外源添加GA可通过抑制NF-κB-IκBα-IκKα/β通路活化,显著降低IPEC-J2细胞中LPS诱导的IL-8、TNF-α等促炎性因子的表达以及炎症酶COX-2的水平（P<0.05）,并且GA有提高细胞内过氧化氢酶活性和上调mRNA水平的趋势。此外,GA还能通过上调紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达来提高细胞的屏障功能。本研究结果表明日粮添加没食子酸可通过调节断奶仔猪的肠道免疫功能来降低仔猪的腹泻率,阐明没食子酸通过抑制NF-κB信号通路调控肠道炎症反应的分子机制,这对没食子酸在断奶仔猪上的应用提供了研究基础。

关键词： 急性缺血性卒中   炎症   全身免疫炎症指数   卒中相关性肺炎   预后  

摘要： 背景中风是全世界致残和死亡的主要原因,缺血性脑卒中是其主要的类型,约占所有中风的80%-85%。卒中相关性肺炎(stroke-associated pneumonia,SAP)是急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者入院期间最常见的并发病之一,它可增加AIS患者的致残致死率,造成严重的经济负担。因此,寻找可能与AIS患者发生SAP及预后不良的标记物具有重要的临床意义。目前有越来越多的研究证据表明炎症机制在缺血性脑卒中发生发展及转归中扮演重要角色。中性粒细胞、淋巴细胞等外周血液细胞也已在众多研究报道里被证明与卒中后感染及缺血性卒中患者预后相关。全身免疫炎症指数(systemic immune-inflammation index,SII),作为一种新型经济的,结合中性粒细胞、血小板和淋巴细胞外周三种血液细胞的研究因素,近年来成为探究的热点,目前已在各种肿瘤疾病预后预测中被广泛应用,然而,其在AIS中的研究尚少。目的本研究旨在探讨SII与SAP的关系,同时进一步分析该值对AIS患者预后的预测价值。方法1.本研究为前瞻性队列研究:前瞻性纳入2015年1月至2017年12月就诊于郑州大学第一附属医院发病24小时内的AIS患者,收集患者人口学特征和临床资料,抽取患者入院24小时内血样进行血常规测定,计算SⅡ值(×109/L),SⅡ=P(×109/L)×N(×109/L)/L(×109/L),其中 P、N 和 L 分别是外周血小板、中性粒细胞和淋巴细胞计数。研究结局包括:入院期间是否发生SAP,3月及1年预后。2.SⅡ与SAP的关联分析:采用SPSS24.0进行数据分析。应用单因素及多因素Logistic回归分析SⅡ与SAP的关系。应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价 SⅡ 对 SAP 的预测价值。3.SⅡ与AIS患者预后的关联分析:预后结局指标采用改良的神经功能评分(modified Rankin scale,mRS)进行评估,包括中重度残疾(mRS 3-5分)、死亡(mRS 6分)和联合预后不良(mRS 3-6分)。采用SPSS24.0和MedCalc.19.04软件进行数据分析。应用单因素及多因素logistic回归分析SII与AIS患者3月及1年预后的关系。应用ROC曲线评价SII对AIS患者预后的预测价值。应用MedCalc.19.04软件使用Delong检验比较基线NIHSS单个指标和SⅡ+NIHSS两者联合指标对AIS患者预后结局事件预测价值的差异。采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析,以Log-Rank法进行检验。所有统计均采用双侧检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.将SII按三分位数分组,以低三分位数SII组为参考,多因素Logistic回归分析示高三分位SⅡ组与SAP相关(P<0.001)。ROC曲线的曲线下面积(Area Under Curve,AUC)为 0.762(95%CI 0.736-0.787;P<0.001),当 SⅡ 处于最佳截断点901.06时,预测SAP的敏感度为68.67%,特异度为78.00%。2.在3月及1年随访中,校正年龄、性别,多因素Logistic回归分析示高三分位数SII组与中重度残疾、死亡、联合预后不良均相关(P<0.001);校正年龄、性别、既往病史、基线NHISS等危险因素,多因素Logistic回归分析示高三分位数SII组仍与死亡、联合预后不良相关(P<0.05),而与中重度残疾无统计学意义上的相关性(P>0.05)。***曲线分析表明SⅡ预测3月死亡(AUC=0.765)较预测3月中重度残疾(AUC=0.557)和联合预后不良(AUC=0.612)诊断效能高;同样SII预测1年死亡(AUC=0.725)也较预测1年中重度残疾(AUC=0.575)和联合预后不良(AUC=0.662)诊断效能高。4.SⅡ+NIHSS联合后较单用NIHSS评分预测3月死亡(0.783vs0.756;P=0.088)差别虽无统计学意义,但从趋势上来说,预测价值更好。而预测1年死亡两者差别存在统计学差异(0.758vs0.732;P=0.0437)。***-Meier生存曲线显示:SⅡ值较高组(SⅡ≥887.25×109/L)的生存率低于SⅡ值较低组(P<0.0001)。结论1.入院SⅡ值是SAP的独立危险因素。2.入院SⅡ值可预测AIS患者早期及长期预后,SⅡ水平越高提示预后不良的风险越大;相比中重度残疾、联合预后不良,SⅡ对早期及长期死亡预测效果更好。3.将SⅡ值与NHISS评分两者联合后,其预测死亡较单用NHISS更优。

关键词： NLRP3炎症小体   KDM4   转录调控   表观遗传  

摘要： 固有免疫,又称为天然免疫,是机体抗感染和抗肿瘤的“第一道防线”;通过多种模式识别受体介导的信号通路而激活。NLRP3炎症小体是由模式识别受体NLRP3、接头蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)组成的多聚蛋白复合体,感受来自病原微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)以及细胞自身释放的损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs),在人体多种生理、病理进程中发挥重要作用。NLRP3炎症小体活化失衡将导致多种疾病的发生,如感染性疾病、痛风、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病及癌症等。因此,揭示NLRP3的表达调控机制,对于阐明NLRP3炎症小体相关疾病发生、发展的机理,寻找免疫调节治疗的新途径具有重要意义。近年来,表观遗传调控越来越多的被发现参与固有免疫和炎症反应的调控。组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰,可调控生理和病理过程中多种信号通路的活化。表观遗传修饰中组蛋白甲基化修饰主要发生在机体组蛋白H3或H4的赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R)残基上,起到基因调节的目的。H3K9me3(H3第9位赖氨酸(H3K9)的三甲基化修饰)和H3K27me3(第27位赖氨酸(H3K27)的三甲基化修饰),被认为是转录抑制的异染色质的标志[1];而H3K9me3和H3K27me3的去甲基化是基因表达所必需的。已有报道,组蛋白去甲基化酶JMJD3的抑制剂通过去除H3K27me3的去甲基化酶活性抑制人原代巨噬细胞中促炎基因的激活,进而抑制炎性细胞因子TNF-α的分泌[2]。因此,组蛋白的甲基化修饰对炎症反应的动态调控可能是炎症相关疾病的潜在治疗方法。然而,H3K9的去甲基化在炎症和固有免疫反应中的作用,尚不清楚。组蛋白去甲基化酶KDM4B(lysinedemethylase 4),又称为JMJD2B,可特异性去除H3K9甲基化修饰。KDM4B可通过其组蛋白去甲基化酶活性参与多个生理和病理过程的调控。比如,KDM4B通过调控靶基因的H3K9去甲基化促进乳腺癌发生[3].通过结合AR(雄激素受体)促进前列腺癌的进展[31]。因此,我们推测KDM4B是否通过其去甲基化酶活性调控组蛋白H3甲基化状态,调控固有免疫和炎症反应?因此,我们重点研究了组蛋白去甲基化酶KDM4B对炎症反应的调控,特别是KDM4B对NLRP3炎症小体的调控效应和分子机制。本研究旨在通过阐明NLRP3在转录水平的分子调控机制,从表观遗传调控的角度揭示NLRP3炎症小体的活化调控机制,为NLRP3炎症小体活化异常所引发的机体相关疾病的治疗提供新的靶点。材料和方法***4特异性抑制剂ML324对NLRP3炎症小体活化及NLRP3表达的影响1.1用DMSO和KDM4特异性抑制剂ML324(20mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞 2h,再用 LPS(200 ng/ml)刺激 6-7h,进而用 ATP(5mM),Nig(50μM)和poly(dA:dT)(200ng/ml)刺激45～60min,收集细胞培养上清。ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平变化。1.2用不同剂量的ML324(5mM,10mM,20mM,50mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激6-7h,然后用ATP刺激45～60min,收集细胞培养上清。ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平变化。1.3用DMSO和ML324(20mM)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h后,用LPS(200ng/ml)刺激不同的时间点(0h,4h,8h),再用ATP刺激45～60min。收集腹腔巨噬细胞细胞培养上清和腹腔巨噬细胞裂解液,超滤浓缩管将细胞上清进行浓缩,Western blot检测细胞培养上清中Caspase-1 p20/p10、IL-1β p17的分泌,以及细胞裂解液中 Caspase-1 p45、IL-1βp31、NLRP3、ASC、AIM2、NLRC4 等的表达情况。1.4用不同剂量的ML324(5mM,10mM,20mM,50mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h后,再用LPS(200 ng/ml)刺激6-7h,再分别用ATP刺激45min～60min,收集细胞培养上清和细胞裂解液,超滤浓缩管将细胞上清进行浓缩,,Western blot检测细胞培养上清中Caspase-1 p20/p10、IL-1β p17的分泌,以及细胞裂解液中Caspase-1 p45、IL-1βp31、NLRP3、ASC、AIM2、NLRC4 等的表达情况。1.5分别用DMSO和ML32

关键词： 重症急性胰腺炎   肝功能保护   早期免疫生态肠内营养   p-STAT3   Cleaved Caspase-3  

摘要： 研究目的:1.探讨早期免疫生态肠内营养对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠肝功能及炎症反应研究。2.探讨早期免疫生态肠内营养(early immune enteral nutrition,EIN)对重症急性胰腺炎患者肝功能及炎症反应的影响,从血液相关指标、炎症反应、营养状况、肝功能等方面了解早期免疫生态肠内营养在SAP患者中的疗效及其可行性。研究方法:1.将健康雄性SD大鼠120只采用随机数字表法分为4组:正常对照组(SO组),重症急性胰腺炎模型组(SAP组),早期肠内营养组(EEN组),生态免疫营养组(EIN组)。将每组再分为12h、24h、48h三个亚组(n=10)。SAP组、EEN组及EIN组大鼠采用逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠法制备SAP模型(0.1mL/100g),SO组给予假手术,胰胆管注射等量生理盐水。各组大鼠经胃十二指肠置管行肠内营养,制模后12h起EEN组给予百普素(1Omin/次,5mL/2h),EIN组在EEN组肠内营养乳剂中加入三联活菌、谷氨酰胺和精氨酸制剂,SAP组和SO组给予等量生理盐水。分别于营养支持后各时间点处死大鼠,采集大鼠腹主动脉血检测血清AMY、LPS、ALT、AST水平;采用ELISA法检测血清中TNF-a、IL-6、IL-10水平;取胰腺和肝脏组织进行HE染色,观察组织病理改变并对其进行病理评分;western blotting方法观察肝脏组织内p-STAT3及Cleaved Caspase-3的蛋白表达情况。2.采用便利抽样法选取2018年12月至2019年12月某三级甲等医院ICU病区62例SAP患者作为研究对象,所有患者均符合中华医学会外科学分会胰腺外科组重症急性胰腺炎诊断标准。按照治疗方法不同将患者分为早期肠内营养组(EEN)和早期免疫生态肠内营养组(EIN)各31例。EEN组经空肠营养管给予液态短肽型要素膳--百普素,EIN组在EEN组肠内营养液基础上添加三联活菌,同时予精氨酸和谷氨酰胺制剂,持续营养支持14天。比较两组患者入院营养支持前(Od)、治疗后第7天和第14天血清酶学指标AMY、LPS及uAMY水平;营养状态指标ALB、PAB、TRF水平;测量炎症指标CRP、PCT及WBC计数水平;以及检测肝功能酶谱ALT、AST和TBil水平;比较APACHE Ⅱ评分变化、总并发症发生率。研究结果:1.早期免疫生态肠内营养对SAP大鼠肝功能及炎症反应的影响12h、24h和48h的EEN组、EIN组大鼠胰腺组织及肝组织病理评分较SAP组明显降低,且EIN组低于EEN组,差异有统计学意义(P<0.05)。AMY、LPS、ALT和AST水平均高于SO组,但EEN组、EIN组均明显低于SAP组,且EIN组均低于EEN组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清TNF-a、IL-6和IL-10水平均高于SO组,但EIN组与EEN组、SAP组相比,大鼠血清TNF-a、IL-6水平显著降低,血清IL-10水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。12h、24h和48h的EIN组与相同时间点EEN组、SAP组比较,大鼠肝脏p-STAT3及Cleaved Caspase-3蛋白表达明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。2.早期免疫生态肠内营养对SAP患者肝功能及炎症反应的影响治疗后7d、14d的EIN组患者AMY、LPS、uAMY水平较EEN组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。TBil、ALT和AST水平显著低于EEN组,差异有统计学意义(P<0.05)。CRP、PCT及WBC水平低于EEN组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后7d、14d的EIN组患者ALB、PAB及TRF水平高于EEN组,差异有统计学意义(P<0.05)。EIN组患者APACHE Ⅱ评分及总并发症发生率显著低于EEN组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论:1.早期应用免疫生态肠内营养改善SAP大鼠胰腺及肝脏病理损伤,减轻炎性反应,对SAP大鼠胰腺及肝功能损伤具有一定保护作用。可抑制SAP大鼠肝脏组织p-STAT3的激活和Cleaved Caspase-3蛋白表达,进而抑制肝细胞凋亡可能是其预防和治疗SAP肝功能损伤的机制之一。2.早期应用免疫生态肠内营养减轻SAP患者全身炎症反应,改善机体营养状态,对胰腺及肝功能损伤具有保护作用。

关键词： 维生素D   肥胖   垂直袖状胃切除术   慢性炎症   体重指数   直肠癌   腹腔镜直肠癌根治术   血清白蛋白  

摘要： 第一部分维生素D控制治疗对肥胖小鼠减肥术后代谢及慢性炎症状态的影响目的:目前关于机体维生素D水平、肥胖与机体炎症状态三者之间的内在联系并不十分清楚。本课题旨在通过建立维生素D饮食诱导的肥胖小鼠模型,进而通过袖状胃切除术(VSG),探讨维生素D对袖状胃切除术后机体代谢以及炎症状态的影响。方法:给予36只4周龄雄性C57BL/6J小鼠分别喂于含维生素D和不含维生素D的标准饲料联合高脂饲料喂养14周,从而建立维生素D缺乏(VDD)以及肥胖小鼠模型,共分为四组:对照组(Ctrl,n=6),维生素D缺乏组(VDD,n=6),高脂饮食组(HFD,n=12)以及高脂饮食+维生素D缺乏组(HFD+VDD,n=12)。与Ctrl组小鼠相比,饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠(包括HFD小鼠和HFD+VDD小鼠)的体重显著增加,HFD+VDD小鼠的血浆VD3浓度显著低于HFD小鼠的血浆VD3浓度,DIO小鼠的血糖水平也明显升高,确认肥胖小鼠造模成功。将HFD小鼠和HFD+VDD小鼠再随机分为两组体重匹配组,对其进行VSG手术或Sham手术。术后给予相同饲料继续饲养12周,然后将小鼠处死。所有小鼠每周记录体重,以及食物摄取量。在14周时,经小鼠眼球取血,测定血浆维生素D浓度。处死前一天,经小鼠尾静脉取血,测定血糖以及胰岛素浓度,同时进行OGTT试验。处死小鼠后收集血液并测定血液中维生素D、甘油三酯、谷丙转氨酶、谷草转氨酶浓度以及血浆炎症因子LPS、IL-1β、IL-10的分泌。取内脏脂肪称重并切片,进行HE染色。结果:在手术后的前6周,与sham组小鼠相比,HFD组小鼠和HFD+VDD组小鼠的体重减轻情况相似;与sham组小鼠相比,VSG术后小鼠的食物摄入减少,第7周以后所有小鼠食物摄入量基本相似。HFD-VSG组小鼠和HFD+VDD-VSG组小鼠在VSG术后体重均减轻。与对应的sham组小鼠相比,VSG术后小鼠的内脏脂肪重量显著下降(P<0.01),而HFD-VSG组小鼠的内脏脂肪重量较HFD+VDD-VSG组小鼠的内脏脂肪重量进一步降低(P<0.05)。与sham组相比,VSG手术显著改善了高脂饮食喂食的小鼠脂肪细胞的肥大及脂肪变性(P<0.05),但这种变化在HFD+VDD组小鼠中不明显。VSG术后小鼠血清甘油三酯、ALT和AST水平均下降,与HFD+VDD-VSG组小鼠相比,HFD-VSG组小鼠的ALT和AST水平进一步降低。在VSG手术之前,HFD组和HFD+VDD组小鼠空腹血糖水平及葡萄糖耐量没有显著差异;VSG术后小鼠空腹血糖和胰岛素水平明显降低,胰岛素抵抗明显下降,糖耐量得到改善,而HFD-VSG组小鼠的空腹血糖水平明显低于HFD+VDD-VSG组小鼠(P<0.05)。HFD-VSG组小鼠表现出更好的胰岛素抵抗降低以及糖耐量的改善。VSG术后小鼠血浆中LPS、IL-1β水平明显降低,而IL-10水平升高,与HFD-VSG组相比,HFD+VDD-VSG组小鼠回肠组织中炎症因子的改变更加明显。结论:维生素D对于VSG术后代谢紊乱的改善具有一定的调节作用,包括维持体重减轻、减轻胰岛素抵抗、减轻肠道炎症、改善肠道通透性、改善肠道菌群紊乱。这些结果提示,维持血液循环中维生素D的正常浓度对于VSG术后代谢紊乱的调节具有十分重要的临床意义。第二部分不同体重指数对患者行腹腔镜直肠癌根治术后临床效果的影响目的:通过回顾性分析行腹腔镜辅助直肠癌根治术患者的临床资料,对比分析不同体重指数患者在围手术期的临床效果、相关营养状况及炎症指标的差异,探讨不同体重指数对患者行腹腔镜直肠癌根治术后临床效果的影响。方法:选取了 2014年1月至2019年1月于某大学附属医院行腹腔镜辅助直肠癌根治术的病人110例,其中排除病理结果不完整、低体重指数、合并其他部位手术、既往有恶性肿瘤或化疗病史、既往有胃大部切除手术史的病人,最终将71例病人按照BMI(Body mass index)分为超重组(BMI≥25kg/m2)27例,正常体重组(BMI<25kg/m2)44例,就两组病人手术前后血清白蛋白值、白细胞、淋巴细胞百分比、手术时间、术中出血量、术后并发症的发生率、淋巴结获取量、术后病理结果等指标进行比较。结果:所有患者均顺利完成手术,无中转开腹及术中死亡病例。两组患者在年龄,性别,合并症的发生情况、肿瘤距肛缘距离、以及腹部手术史等方面无显著差异(P>0.05)。正常体重组手术时间为(247.84±62.96)min,超重组手术时间为(261.29±52.48)min。正常体重组手术中出血量为(87.27±96.84)ml,超重组为(95.55±88.80)ml,两组间差异无统计学意义。两组患者病灶术后病理结果显示,两组大体标本类型、环周切缘阴性率、肿瘤侵犯肠壁深度、平均肿瘤直

关键词： 双氢青蒿素   多发性硬化症   实验性自身免疫脑脊髓炎   自身免疫炎症   小胶质细胞   AXL  

摘要： 1.研究背景及目的多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种以髓鞘脱失和神经元变性为特点的中枢神经系统(central nervous system,CNS)自身免疫炎症性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)是一种以CNS内小血管周边大量单个核细胞弥漫浸润及脱髓鞘为特点的MS动物实验模型。MS的致病因素多样,疾病进展的驱动机制复杂。近年来对中枢神经系统免疫微环境的研究结果表明,小胶质细胞在MS的疾病诱发和进展中起重要作用[1]。因此,聚焦中枢神经系统小胶质细胞的调控,改变中枢神经系统免疫微环境的属性和状态,对于包括MS在内的多种中枢神经系统疾病的治疗具有核心且共通性的研究价值。目前,MS的临床治疗处于“能缓不能治,治标不治本”的状态,在MS“高发与难治”的强烈对比下,MS的疾病机理认识与治疗手段拓展成为现代免疫学、神经生物学与新药研发的共同关注热点与应用焦点,具有明确的科学创新意义与实践应用价值。倍半萜类化合物双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)分子式为:C15H24O5分子量为284.35,物化性质为白色结晶或结晶性粉末[2]。随着对DHA研究的不断深入,DHA的药效药理学优势不仅仅只局限在治疗疟疾,其在抗炎免疫调节方面也显示出极大的应用前景。前期研究发现其在治疗免疫性疾病,特别是针对自身免疫病具有明确的有效性,并且初步明确了DHA能够通过调控Th17/Treg细胞平衡机制进而抑制自身免疫炎症性肠病(IBD)[3]。但目前上述研究仍存在关键科学问题的研究空白:(1)DHA调控免疫炎症的共通基础不明,疾病谱不清,特别是其在中枢神经系统自身免疫炎症调控中的应用有效性缺乏系统研究;(2)DHA调控T细胞平衡的免疫过程不明,其对免疫炎性微环境的调控活性缺乏系统的阐释和实验描述;(3)DHA发挥免疫调控活性的潜在分子机制不明,具体分子靶点和相关信号通路缺乏精细化的分析和揭示;基于上述分析,从药效评价、免疫功能揭示、分子机制探索三个方面开展DHA的全面系统研究,是提升DHA药物认识水平,促进DHA合理有效应用的关键研究内容。众所周知,T细胞的平衡调控是一个复杂而庞大的体系,而“抗原递呈细胞-T细胞”的整合作用单元在T细胞的免疫功能平衡调控中发挥着重要的作用,是自身免疫炎症损伤启动和持续激活的核心病理基础。而基于上述理论的DHA药物研究仍为空白。因此,本文结合DHA的药效特点和MS的病理特征,建立系统的EAE药效评价体系,开展全面的DHA药效活性评价。以中枢神经系统中的抗原递呈细胞小胶质细胞的浸润和激活为基础,建立基于小胶质细胞-T细胞相互作用的免疫活性研究策略,拓展DHA的炎症调节活性认识。并以中枢神经系统炎症中小胶质细胞的功能性改变为切入点,进行机制挖掘和研究,完善“点面集合”的分子药理机制揭示研究,明确分子机理和活性特征,探索DHA在EAE病理环境的重塑中发挥的作用。2.研究方法和内容***治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究(1)建立MOG35-55实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型。包括复发缓解(RRMS)动物模型和继发进展(SPMS)动物模型,以DHA2mg/kg/d,10mg/kg/d,20mg/kg/d为给药低,中,高剂量,甲泼尼龙1mg/kg/d为阳性药。分别在小鼠造模第2天开始灌胃给药干预。正常对照组和模型组分别给予等剂量的溶剂。每日定时观测小鼠的状态变化。RRMS动物模型:连续给药23天后,小鼠步态仪进行步态行为检测小鼠机能动态变化。行为学检测后,一部分取出脑和脊髓组织进行组织学(LFB,透射电镜)检测;另一部分小鼠分离血清和脑脊液。SPMS动物模型:连续给药53天后,开始进行步态行为学检测小鼠机能动态变化。行为学实验结束后,采用脊髓和脑组织进行Olig 2的免疫组织化学检测。(2)RRMS小鼠行为学检测后,取出脊髓和脑进行H&E染色,检测炎症细胞浸润的情况;分离中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR法检测MNCS中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达***对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究(1)分离小鼠中枢神经系统内的单个细胞,进行细胞质检,将细胞数目调整至浓度为1 × 106/mL;10X标记cDNA片段,建库,测序,得到测序数据。采用PCA降维度的方式来看细胞之间的相似性,针对PCA结果中解释方差最大的前10个主成分,采用T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding对单细胞群聚类进行可视化,进而得到与EAE疾病相关的细胞亚群和差异基因。(2)体外培养小鼠巨噬细胞株Raw