关键词：
巨噬细胞
Toll样受体2
NOD样受体含CARD结构域-5
过敏性气道炎症
炎症小体
摘要：
Toll样受体(TLRs)是一类I型膜结合蛋白,参与天然免疫反应,可以识别和防御入侵的病原体和微生物。至今为止,在哺乳动物中已经发现的TLRs家族成员有11个,其中,TLR2是一种关键的天然免疫受体,主要表达于多种免疫细胞和气道上皮细胞中,并被报道参与多种炎症性和免疫性疾病的发病过程。NLRC5是NOD样受体家族新发现的一种蛋白,能够调节炎症反应和细胞死亡。人与小鼠NLRC5均在肺、脾和胸腺中高度表达。大量研究表明,NLRC5在天然免疫中起着调节体内平衡的作用。在本论文中,我们主要针对NLRC5在TLR2介导的炎症反应和过敏性气道炎症中的参与调节作用进行探讨。一、NLRC5通过TLR2/NF-κB信号通路对脂磷壁酸(LTA)诱导的巨噬细胞炎症反应进行调节的分子机制研究研究背景NOD样受体(NLRs)是一类胞内模式识别受体(PRRs),在宿主对病原相关分子模式(PAMPs)的防御中起作用。NOD样受体含CARD结构域-5(NLRC5)是其家族中最大的成员,它于2010年被首次发现,并相继证明能够在天然免疫及多种炎症反应中起关键性调节作用;此外,它亦能参与肿瘤的发生发展,并在其中起免疫监视作用。有可靠性研究表明,在体外,NLRC5可以负性调节TLR4介导的NF-κB的激活和I型干扰素的产生。TLR2与TLR4均为跨膜蛋白,能够参与多种炎性反应的发生发展,并起到调节作用,而NLRC5在体外是否亦能够参与TLR2介导的炎症反应,对其反应过程有着怎样的调节作用,目前尚未可知,仍需进行探究。研究目的1.探究在LTA诱导下,NLRC5在TLR2介导的巨噬细胞炎症反应过程中的变化情况。2.探讨NLRC5对TLR2介导的细胞炎症反应的调节作用,及其下游信号通路中可能存在的炎症调节潜在靶点。研究方法1.不同时间点LTA刺激巨噬细胞,观察TLR2、NLRC5及炎症相关信号分子的表达水平分别用相同浓度的LTA刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7:0h、4h、8h、12h、24h。采用Western Blot方法检测TLR2、NLRC5及多种炎症相关信号分子的表达水平。2.通过siRNA在巨噬细胞中对TLR2进行干扰,并观察对LTA诱导的巨噬细胞炎症反应的影响,以及NLRC5表达水平的变化情况。在RAW264.7巨噬细胞中,行TLR2 siRNA干扰的同时,用LTA刺激细胞12h。采用Western Blot方法检测siRNA的敲减水平、NLRC5蛋白表达水平及巨噬细胞炎症反应水平在对TLR2敲减后的变化情况。通过对细胞行免疫荧光染色的方法,激光共聚焦显微镜观察NF-κB的入核分布情况及其表达水平的变化。3.通过siRNA对巨噬细胞中NLRC5进行靶向干预,观察其对LTA诱导下,TLR2介导的巨噬细胞炎症反应的调节作用,及TLR2表达水平的变化情况。用NLRC5 siRNA干扰RAW264.7巨噬细胞,对NLRC5靶向敲减后,用LTA刺激细胞12h。采用Western Blot方法检测siRNA的敲减水平、TLR2蛋白表达水平及巨噬细胞炎症反应水平在对NLRC5敲减后的变化情况。通过对细胞行免疫荧光染色的方法,激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞行NLRC5敲减后,对NF-κB的入核分布情况及表达水平变化的影响。研究结果***在RAW264.7细胞中诱导炎症反应和NLRC5的激活RAW264.7细胞在LTA刺激作用下,通过Western Blot检测发现炎症反应相关蛋白P-NF-κB p65、NLRP3、ASC的表达显著增加,同时,NLRC5的表达水平也在LTA的刺激下呈时间依赖性方式升高;与此同时,我们发现NLRC5的蛋白表达水平在12小时时达到峰值。***诱导NLRC5的激活是TLR2依赖的使用TLR2 siRNA对RAW264.7细胞进行敲减后,在LTA诱导下,巨噬细胞炎症反应显著减弱,Western Blot示炎症相关蛋白P-NF-κB p65、NLRP3、ASC的表达显著下调,同时,NLRC5的表达水平也随之降低。为了进一步证实这一结果,通过免疫细胞化学对NF-κB p65和P-NF-κB p65的表达水平进行检测,荧光成像结果显示,在对细胞进行TLR2敲减后,NF-κB p65的磷酸化水平明显减弱,P-NF-κB p65入核数量减少。***5在TLR2介导的巨噬细胞炎症反应中能够负性调节炎症反应和NF-κB的激活在RAW264.7细胞中行NLRC5 siRNA敲减后,经LTA刺激细胞12h,免疫印迹分析显示,TLR2表达水平没有明显变化,但NF-κB p65的磷酸化水平在缺乏NLRC5的细胞中显著升高。此外,炎症小体相关蛋白质的表达,如NLRP3显著增加,然而ASC则显示表达降低。为了进一步进行验证,对NF-κB p65和P-NF-κ
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