关键词： 实验性自身免疫脑脊髓炎   双氢青蒿素   小胶质细胞   自身免疫炎症   分子机制   药效评价  

摘要： 背景及目的：　　本文结合DHA的药效特点和MS的病理特征,建立系统的EAE药效评价体系,开展全面的DHA药效活性评价。以中枢神经系统中的抗原递呈细胞小胶质细胞的浸润和激活为基础,建立基于小胶质细胞-T细胞相互作用的免疫活性研究策略,拓展DHA的炎症调节活性认识。并以中枢神经系统炎症中小胶质细胞的功能性改变为切入点,进行机制挖掘和研究,完善“点面集合”的分子药理机制揭示研究,明确分子机理和活性特征,探索DHA在EAE病理环境的重塑中发挥的作用。　　方法和内容：　　***治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究　　(1)建立MOG35-55实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型。包括复发缓解(RRMS)动物模型和继发进展(SPMS)动物模型,以DHA2mg/kg/d,10mg/kg/d,20mg/kg/d为给药低,中,高剂量,甲泼尼龙lmg/kg/d为阳性药。分别在小鼠造模第2天开始灌胃给药干预。正常对照组和模型组分别给予等剂量的溶剂。每日定时观N4,鼠的状态变化。　　(2)砌WS小鼠行为学检测后,取出脊髓和脑进行H&E染色,检测炎症细胞浸润的情况;分离中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR法检测MNCS中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达　　***对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究　　(1)分离小鼠中枢神经系统内的单个细胞,进行细胞质检,将细胞数目调整至浓度为1×106/mL;10X标记cDNA片段,建库,测序,得到测序数据。采用PCA降维度的方式来看细胞之间的相似性,针对PCA结果中解释方差最大的前10个主成分,采用T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding对单细胞群聚类进行可视化,进而得到与EAE疾病相关的细胞亚群和差异基因。　　(2)体外培养小鼠巨噬细胞株Raw264.7311小鼠小胶质细胞株BV2,并且体外分离小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)。分别以DHA1,49M为给药低,高剂量和LPS50ng/ml为造模浓度,细胞经过药物处理24h。首先,RT-PCR(Reverse *** Chain Reaction)的方法在转录水平上检测Raw264.7和PM细胞中负性免疫共刺激分子PDL1的表达;间接免疫荧光技术检测Raw264.7,BV2和PM三种细胞表面免疫共刺激分子PDL1的蛋白表达水平;采用人外周血白血病T细胞JWkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,通过流式细胞技术检测在共培养体系中,DHA对JurkatT细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。　　(3)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测CCL5的表达;ELISA法检测EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量;趋化实验中,ELISA法检测BV2培养上清中CCL5的含量;transwell法验检测CCL5对小胶质细胞趋化能力变化。　　(4)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测AXL的表达;Western Blot法检测BV2细胞AXL的蛋白表达情况;吞噬试验中,先诱导PC12细胞凋亡,Annexin V-FITC双染法检钡UPC12细胞的凋亡率;间接免疫荧光方法检测BV2细胞对凋亡的PCI2宝m胞的吞噬能力,并且采用荧光显微镜观察BV2细胞对凋亡PC12细胞的吞噬情况。　　3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究　　(1)为了在分子机制水平上验证DHA对AXL的依赖性,我们使用AXL的阻断剂SGl7079(0.2μM)阻断AXL的激活,我们首先采用BV2细胞吞噬凋亡PC12细胞的方法检测BV2细胞吞噬能力的变化;transwell法验检沏JJCCL5对小鼠小胶质细胞BV2趋化能力变化;最后采用Jwkat T与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,间接免疫荧光法检测DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。　　(2)Western Blot法检钡,,UBV2细胞经过DHA和LPS处理后AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达。在上述研究的基础上加入SGI7079作用后,同样检测AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达情况。　　(3)BV2细胞用DHAl和4μM作用24h后,间接免疫荧光方法检测BV2细胞的PDL1,FOXP3,CYSE/F480的表达量,ELISA法检测BV2细胞上清中CCL5的含量,transwe

关键词： 髋部骨折   全身性炎症反应综合征   死亡率   出血量  

摘要： 目的对老年髋部骨折患者全身性炎症反应综合征进行临床分析。方法研究对象为300例患者老年髋部骨折患者,根据是否患有全身性炎症分为sirs组和非sirs组,其中sirs组96例,非sirs组204例,对2组患者的临床症状、死亡率等进行对照观察,并且统计患者失血量和出现全身性炎症反应综合征的关系。结果通过对比2组患者,sirs组患者的死亡率明显较高,并且患者骨折后的出血量和患者出现全身性炎症反应综合征的几率呈正比。结论老年髋部骨折患者全身性炎症反应综合征具有较高的死亡率,并且其发病和患者失血量有一定的关系。

关键词： 类风湿关节炎   滑膜成纤维细胞   Forkhead box C1   Wnt   β-catenin  

摘要： 类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎为主要病理特征,同时伴有关节软骨破坏和软骨下骨侵蚀的全身性自身免疫性疾病。RA滑膜成纤维细胞(RA synovial fibroblasts,RASFs)的活化是上述病理过程的重要参与者。有证据表明Wnt/β-catenin信号通路在RA中处于激活状态,参与了RASFs的活化。活化的SFs具有增殖,侵袭力增强,炎症因子分泌异常,类肿瘤样生长特性。转录因子Forkhead box C1(Fox C1),近年来发现在多种肿瘤的发生机制中异常表达且在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭方面发挥重要作用。尽管在肿瘤中已有关于Fox C1的报道,但目前在RA中还缺少关于Fox C1表达及功能的相关研究。因此,本研究着重探讨Fox C1在RA滑膜组织和RASFs中的表达情况以及Fox C1对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响的相关分子机制。本实验共分为四个部分。一、Fox C1和β-catenin在RA滑膜组织及RASFs中高表达获取RA和正常创伤组(Control)患者的滑膜组织,通过免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、蛋白质印记(western blot,WB)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)等方法检测Fox C1和β-catenin的表达情况。结果发现:RA滑膜组织中的Fox C1,β-catenin基因和蛋白的表达明显高于Control患者。另外,从滑膜组织中提取原代SFs后进行检测,结果同样显示:Fox C1和β-catenin在RASFs中的表达高于Control SFs。滑膜组织的IHC和SFs的免疫荧光检测结果显示:Fox C1和β-catenin在SFs的细胞质和细胞核中均有表达,并且在细胞核中Fox C1和β-catenin的表达量明显高于Control组。这部分结果提示Fox C1和β-catenin在RA病理中异常表达。二、Fox C1调控RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌为了进一步探究Fox C1在RA中的功能,提取原代RASFs并通过转染过表达Fox C1的慢病毒,观察其对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响。结果发现:在体外过表达Fox C1的RASFs的增殖、迁移、侵袭能力明显增强;通过酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)发现:过表达Fox C1能够增加RASFs上清中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌,同时降低白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)的分泌。通过转染抑制Fox C1表达的si RNA片段,观察其对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响。结果发现:在体外抑制Fox C1的RASFs的增殖、迁移、侵袭能力明显减弱;通过ELISA检测发现:抑制Fox C1可降低RASFs上清中的IL-1β、IL-6及TNF-α分泌,同时促进IL-10的分泌。三、Fox C1通过调控β-catenin激活Wnt/β-catenin信号通路影响RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌结合上述结果,我们推测Fox C1调控RASFs的增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌,很有可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路。因此,我们应用WB和q RT-PCR方法对与Wnt/β-catenin通路相关,以及RA病理相关的基因进行检测,结果发现在RASFs中过表达Fox C1后可促进Wnt/β-catenin通路重要的信号分子β-catenin的表达,同时与Wnt/β-catenin通路相关的基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、原癌基因(c-Myc),以及RA相关的基因纤连蛋白(fibronectin)和基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3)的表达都升高。然而这一现象在抑制Fox C1的表达后出现了相反的结果。为了进一步明确Fox C1可能是通过调控β-catenin来影响Wnt/β-catenin通路并实现上述功能。接下来我们进行正反验证。首先在过表达Fox C1的情况下同时抑制β-catenin,发现cyclin D1,c-Myc,fibronectin和MMP3的基因和蛋白表达都降低;RASFs的增殖、迁移、侵袭以及促炎症因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)分泌抑制,抗炎因子(IL-10)的分泌增加。其次我们在抑制Fox C1的情况下过表达β-catenin,发现cyclin D

关键词： 交感神经   肌筋膜扳机点   炎症   肌卫星细胞  

摘要： 研究背景:肌筋膜疼痛综合征(myofascial pain syndromes,MPS)又被称为肌筋膜炎,是指肌肉及其筋膜的慢性无菌性炎症引起的疼痛,是中医骨伤科门诊的常见病。肌筋膜扳机点(myofascial trigger points,MTrPs)是其特发症状,表现为骨骼肌中可触及的坚硬、散在的肌紧张带,通常会引起自发性疼痛,也可在受压时产生痛觉。MPS的主要病理改变是病变局部炎性因子和致痛递质浓度的升高,表现为肌肉的慢性无菌性炎症。肌卫星细胞(muscle satellite cells,MuSC)是肌肉损伤后修复的储备细胞,MuSC与局部炎症状态有密切联系。而交感神经既能影响MPS患者骨骼肌的修复,又能影响肌肉的炎症状态。但交感神经和MuSC在MTrPs的发展和预后过程中发挥怎样的作用,尚缺乏相关研究证实。研究目的:探讨交感神经是否影响MPS大鼠中MuSC的增殖以及交感神经和MuSC是否能协同影响MPS大鼠的局部及整体炎症状态。研究方法:1、将30只大鼠随机分5组,分两阶段造模:A组:注射生理盐水+正常饲养;B:注射神经损毁剂+左侧MPS造模;C:注射生理盐水+左侧MPS造模;D:正常饲养+左侧MPS造模;E:注射神经损毁剂+正常饲养。采用触诊及肌电图形式筛选造模成功个体。2、在行MPS造模前后不同时间段测量打击部位及对侧相同部位肤温。3、行HE染色观察肌肉局部肌纤维形态及炎症状态,采用炎性细胞计数评估局部炎症状态。4、采用ELISA法检测大鼠血浆中5-HT、NE和TNF-α的浓度。5、采用Realtime-PCR法测量大鼠股四头肌中MyoG、MyoD基因表达水平,评估肌筋膜扳机点局部MuSC的表达。结果:1、第2次测量时A、E组大鼠左侧肤温显著低于B、C、D组大鼠左侧肤温。第3次测量时B组大鼠左侧肤温显著高于其余各组;B组大鼠左侧肤温在第6次测量时显著高于A、C、E组大鼠左侧肤温。2、A、E组双侧骨骼肌肌纤维均排列规则、整齐,肌间隙小,且均匀一致,E组较A组轻微萎缩;B、C、D组肌纤维出现不同程度萎缩,肌纤维间隙增宽且大小不一,肌纤维排列紊乱、出现不同程度的断裂、扭曲,横截面积明显缩小。3、大鼠肌肉切片可见:B、C、D组大鼠左侧炎性细胞计数显著高于对侧;B组大鼠左侧炎性细胞计数显著高于其余各组,C、D组大鼠左侧炎性细胞计数显著高于A、E组;B组大鼠右侧炎性细胞计数显著高于A、D、E组。4、不同组大鼠血浆中平均TNF-α浓度无差异;A组大鼠血浆中NE浓度高于其余各组;A、D组大鼠血浆中5HT浓度大于B、E组,B组大鼠血浆中5HT浓度小于C、D组,E组大鼠血浆中5HT浓度小于D组。5、A组大鼠左侧大腿肌肉中的Myog相对表达量大于B、C组,右侧肌肉中的MyoD相对表达量大于B、D、E组大鼠;C组大鼠左侧肌肉中的MyoD相对表达量大于D、E组大鼠;A组大鼠双侧肌肉中的MyoD相对表达量均大于E组大鼠。结论:1、损毁交感神经能导致扳机点局部肤温在一定时间内升高;2、损毁交感神经能影响扳机点肌纤维生长,并影响大鼠局部及整体炎症状态;3、损毁交感神经对扳机点局部MuSC的增殖无影响;4、无法证实交感神经可通过影响MuSC的增殖来影响大鼠炎症状态。

关键词： 16s rDNA测序   肠道菌群   黄芩   网络药理学   炎症性肠病  

摘要： 目的:利用16s rDNA测序技术检测黄芩治疗前后肠道菌群的变化,网络药理学预测黄芩治疗炎症性肠病的潜在作用靶点及代谢通路,通过现代生物学技术验证网络药理学预测结果,探讨黄芩治疗炎症性肠病的分子机制。方法:采用化学试剂诱导法建立炎症性肠病小鼠模型,造模成功后将小鼠随机分组,即空白组、模型组、阳性药组、黄芩高浓度组、黄芩中浓度组和黄芩低浓度组,给药治疗28d,收集小鼠治疗前后的肠道内容物,利用16s rDNA测序技术对样品16S V3V4区进行扩增,通过OTU聚类统计、Alpha多样性、Beta多样性及群落组成等方法进行分析,研究黄芩治疗前后炎症性肠病小鼠肠道菌群结构的差异。通过TCMSP、TCM Database@Taiwan等数据库筛选得到黄芩有效成分及对应的潜在作用靶点,OMIM、Drugbank等数据库检索得到炎症性肠病对应的潜在靶标,利用C ystoscape3.6.0软件将二者进行映射,拓扑分析得到黄芩治疗炎症性肠病的潜在作用靶点及相关信号通路。最后利用Western blot技术检测黄芩治疗前后小鼠结肠组织中相关蛋白因子的表达水平。结果:肠道菌群检测结果显示模型组中Parasutterella、Parabacteroides、Citrobac ter等丰度明显减少,Akkermansia、Saccharibacteria、Acetatifactor、Turicibacter等丰度明显上调;黄芩给药组中Saccharibacteria、Acetatifactor等丰度明显下降,Parasut terella、Citrobacter等丰度呈上升趋势,且菌群丰度与黄芩浓度呈正比。利用网络药理学相关数据库筛选得到黄芩主要活性分子21个、成分对应靶点157个、疾病对应靶点320个;将成分靶点和疾病靶点映射,拓扑分析得到黄芩治疗炎症性肠病的潜在靶点29个,包括RELA、TNF、JUN、IL6、MAPK14、CASP3、IKBKB等;KE GG通路富集分析得148条信号通路,包括NF-κB、TNF信号通路等。Western blot技术检测结肠组织TNF、JUN、RELA和IL-6的蛋白表达水平,与空白组比较模型组中蛋白表达量明显上调,具有显著性统计学差异(P<0.01);与模型组比较阳性药组及黄芩高浓度组蛋白表达水平明显下降,有显著性统计学差异(P<0.01);阳性药组与黄芩高浓度组比较JUN和RELA表达水平无统计学差异(P>0.05),TNF和I L-6表达水平有统计学差异(P<0.05);阳性药组与黄芩中浓度组比较TNF、JUN、IL6表达水平有统计学差异(P<0.05),RELA表达水平有显著性统计学差异(P<0.01);阳性药组与黄芩低浓度组比较蛋白表达水平有显著性统计学差异(P<0.01)。结论:利用16s rDNA测序技术、网络药理学和Western blot技术证实黄芩可能通过调节肠道微生物的结构,增加有益菌的丰度,降低有害菌的丰度,进而缓解炎症反应,同时抑制炎症信号通路中RELA、TNF、JUN、IL6蛋白因子的表达水平,最终发挥治疗炎症性肠病的作用。

关键词： 二甲双胍   高迁移率族蛋白1   牙周炎   脂多糖  

摘要： 背景:牙周炎是一类以牙龈炎症和牙槽骨吸收为主要特征的慢性炎症性疾病。然而,现有的治疗方法如牙周基础治疗、引导组织再生术等,均不能满足病人和口腔医生对牙周炎治疗的期待。二甲双胍(Metformin,MET)是临床II型糖尿病首选的口服降糖药物。近年来的研究发现二甲双胍除了降血糖作用外,在多囊卵巢综合征、肿瘤、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、衰老和青春期早熟等诸多方面显示出显著疗效。有文献显示,这些作用与二甲双胍的抗炎作用相关。然而,二甲双胍对于牙周炎的作用尚不清楚。高迁移率族蛋白(High Mobility Group Protein,HMG)属于非组DNA结合蛋白,广泛分布于高等真核生物的细胞核内,包括HMGA,HMGB,HMGBN三个亚群;HMGB亚群中进一步分为HMGB1,HMGB2,HMGB3。其中,HMGB1的含量最多,因在进化过程中其序列高度保守,几乎存在于所有的真核细胞中,同源性高达99%,是唯一能够被释放到细胞外发挥其胞外生物学活性的蛋白质。人类的HMGB1基因位于13号染色体长臂上的1区2带,其相对分子量为25 KD,普遍分布于机体的各项器官,除在肝、脑组织中主要存在于胞浆外,在大多数组织中存在于胞核。在正常生理情况下,HMGB1在细胞核内与DNA的结合是松散的,但当细胞受到机械损伤或坏死的时候,HMGB1易于从受损的细胞核内释放到细胞外,继而诱发炎症反应。由于HMGB1在炎症性疾病的发病机制中发挥重要作用,因此亦被认为是机体坏死细胞发出的内源性危险信号。目的:体内实验中利用丝线(Ligature)结扎建立动物实验性牙周炎模型,在体外实验中建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导人牙周膜细胞(h PDLCs)炎症模型。观察Met对实验性牙周炎的作用,初步探索其作用机制。同时观察在炎症刺激和Met的作用下HMGB1的表达及作用。方法:1、Met对小鼠牙周炎模型骨吸收情况的影响:用6-0丝线置于小鼠上颌第一、第二磨牙牙间隙9天,建立实验性牙周炎模型,同时200mg/kg Met灌胃处理14天每天1次,14天后处死小鼠。采用Micro-CT观察小鼠上颌第一第二磨牙牙槽骨吸收水平;在上颌第一磨牙根分叉处测量骨体积分数(BV/TV),骨小梁厚度(***);计算釉牙骨质界至牙槽骨嵴顶(cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距离,监测牙槽骨的吸收。2、Met对小鼠牙周炎模型炎症因子的影响:将小鼠上颌骨脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后,H&E染色观察其牙槽骨炎症细胞浸润水平;IL-6、IL-8免疫组化观察Met对小鼠实验性牙周炎的抗炎作用;HMGB1免疫组化检测其在炎症和Met共同作用下的表达和定位。3、LPS体外诱导h PDLCs炎症模型:分别用0μM,0.5μM,1μM,5μM,10μM,20μM的LPS处理h PDLCs,采用细胞计数kit-8(CCK-8)检测细胞活力;采用real-time PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测炎症细胞因子IL-6、IL-8的表达,以筛选出未明显抑制h PDLCs活性且炎症因子明显升高的的最适LPS浓度。4、HMGB1在h PDLCs炎症模型的表达和定位:用上述相同浓度的LPS处理h PDLCs后,采用real-time RT-PCR和ELISA检测h PDLCs在不同浓度LPS作用下HMGB1的表达及细胞外的释放量;Western blot测定HMGB1在细胞内的定位。5、Met对h PDLCs炎症模型的影响:分别用0μM,50μM,100μM,150μM,200μM的Met处理h PDLCs,采用细胞计数kit-8(CCK-8)检测细胞活力;h PDLCs经过不同浓度Met预处理24h,再加入最适浓度的LPS处理24h后,进行RT-PCR和ELISA检测,检测IL-6、IL-8炎性因子表达量变化。6、HMGB1和AMPK/NF-?B通路在Met抗h PDLCs牙周炎症模型中的机制研究:用上述相同浓度的Met和LPS处理h PDLCs后,real-time RT-PCR和ELISA检测HMGB1的基因表达变化及胞外的释放量;核内和核外Western blot测定HMGB1在细胞内的定位;免疫荧光法明确HMGB1细胞内定位。通过Western blot实验来检测AMPK/NF-?B相关蛋白的表达。结果:1、Met灌胃处理丝线诱导牙周炎模型,Micro-CT观察到牙槽骨吸收水平明显减少,骨小梁骨量和厚度明显增加,CEJ-ABC距离显著变小。2、取小鼠上颌骨脱钙、包埋、切片免疫组化染色后,Met+Ligature组IL-26、IL-8的表达减少,HMGB1在胞外和胞

关键词： NLRP3   炎症小体   HDAC10   去乙酰化  

摘要： 研究目的NLRP3(Nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor protein 3)炎症小体是研究最多也最深入的炎症小体,由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和前体半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(pro-caspase-1)组成。由NLRP3炎症小体所导致的炎症反应失调,与多种人类疾病密切相关,这些疾病包括自身炎症综合征、心血管疾病、神经退行性疾病及肿瘤等。因此,NLRP3炎症小体活动的精确调控可能为治疗多种炎症性疾病提供潜在靶标。蛋白翻译后修饰对NLRP3炎症小体的活化有重要的调控效应,而NLRP3炎症小体的乙酰化与去乙酰化调控机制尚未阐明。组蛋白去乙酰化酶10(Histone deacetylase 10,HDAC10)作为组蛋白去乙酰化酶家族成员之一,对NLRP3炎症小体激活的作用机制仍不清楚。本课题研究了 HDAC10对于NLRP3炎症小体活化的调控效应与作用机制。这对于阐明NLRP3相关性疾病的发生发展以及根据其机制探究免疫调节治疗的新途径有重要的临床意义。材料和方法***3的乙酰化检测1.1检测组蛋白乙酰转移酶对NLRP3的乙酰化效应在HEK293T细胞系中过表达NLRP3、CBP、P300和Tip60后,应用蛋白印迹(Western Blot)方法,检测细胞内源性的CBP、P300和Tip60对于NLRP3的乙酰化效应。并应用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)方法,检测细胞外源性CBP、P300和Tip60对于NLRP3 的乙酰化效应。1.2检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对NLRP3乙酰化的调控效应在HEK293T细胞系中转染NLRP3表达载体,加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA),另设单加TSA的溶剂甲醇的细胞作为对照组。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法,检测TSA对于NLRP3乙酰化的调控效应。***10对NLRP3的作用效应检测2.1与NLRP3发生结合效应的HDAC家族成员的筛选应用脂质体Lipofectamine2000向HEK293T细胞系中分别转染NLRP3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC8、HDAC10 表达载体和空白载体。转染质粒24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP方法筛选出与NLRP3发生结合的HDAC家族成员分子。2.2检测HDAC10与NLRP3的结合情况在筛选出HDAC10与NLRP3结合的基础上,应用Co-IP和Western Blot方法进一步验证HDAC10与NLRP3的结合情况。2.3构建HDAC10和NLRP3各结构域缺失的截短突变体应用 KOD-Plus-Mutagenesis 试剂盒分别构建 NLRP3(△ PYD、△NACHT、△LRR)和HDACI0(△DAC、△LRD)各结构域缺失的截短突变体,以及NLRP3各个结构域的表达载体(1-93aa、220-536aa、742-991aa)。2.4检测介导NLRP3与HDAC10结合的NLRP3蛋白结构域应用脂质体Lipofectamine2000在HEK293T细胞系中共转染HDAC10与NLRP3或其结构域缺失的截短突变体(△PYD、△NACHT、△LRR)以及空白载体。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法检测HDAC10与NLRP3的各截短突变体的结合情况。2.5检测介导NLRP3与HDAC10结合的NLRP3结构域表达载体应用脂质体Lipofectaminc2000在HEK293T细胞系中共转染HDAC10与NLRP3或其各结构域表达载体(1-93aa、220-536aa、742-991aa)以及空白载体。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法检测HDAC10与NLRP3各结构域表达载体的结合情况。2.6检测介导HDAC10与NLRP3结合的HDAC10蛋白结构域应用脂质体Lipofectamine2000在HEK293T细胞系中共转染NLRP3与HDAC10或其结构域缺失的截短突变体(△DAC、△LRD)以及空白载体。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法检测NLRP3与HDAC10各截短突变体的结合情况。2.7在疾病模型中探究HDAC10的生理意义小鼠腹腔源性巨噬细胞被LPS和ATP刺激后,诱导NLRP3炎症小体的激活。Western Blot检测NLRP3、HDAC1

关键词： 缺血性脑损伤   神经炎症   CXCL1   miR-181c-3p   外泌体  

摘要： 中风,即脑卒中,排在心脏病和癌症之后,是世界第三大死亡原因,其中缺血性中风占87%。除了死亡,绝大多数中风幸存者出现了不同程度的永久性残疾,给患者家庭和社会带来了极大的负担和痛苦。缺血性中风也称缺血性脑卒中或缺血性脑损伤,其造成脑损伤区域的大小和程度主要取决于具体闭塞的脑动脉。脑动脉发生闭塞后,神经内分泌激素和促炎介质的级联反应,先后造成多种炎症细胞和免疫细胞向缺血区域内浸润并聚积,进而产生不同程度的神经炎症。目前认为,尽管具体的分子机制尚不完全清楚,神经炎症的进程可直接影响中风患者的大脑损伤程度及其愈后的临床表现。大脑主要由皮质神经元细胞和神经胶质细胞构成,其中神经胶质细胞包括星型胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞,各种细胞在大脑的不同区域各司其职。无论是正常生长发育或新陈代谢,还是发生特殊病理事件,细胞间的交互通讯都起着至关重要的作用。细胞间通讯主要由细胞直接接触和细胞外囊泡介导。外泌体是最重要的细胞外囊泡,直径为30-150 nm,由细胞膜衍生的微泡样结构。细胞外囊泡主要包括外泌体和微泡,作为细胞间通讯的重要媒介,广泛参与原核生物和高等真核生物细胞间的信号传递,并调节多种生物过程。二十年来,细胞外囊泡在包括癌症、传染病和神经退行性疾病在内的疾病中的病理生理作用逐渐被认识。由于其结构的特殊性,无论是未修饰的还是人工合成的细胞外囊泡都有可能在大分子药物传递中得到应用,成为治疗干预的潜在新靶点。近年来,随着互联网在全世界全行业内快速的发展,出现了许多权威的科研工具网站,科研工作者可以通过这些网站进行科研数据的分享、在线分析和设计等多种便捷的操作,大大加快了各领域科研工作的协作效率和未知科学问题的解读速度。本研究,通过对互联网权威的数据库进行分析,发现缺血性脑损伤区域内炎症趋化因子CXCL1的表达明显增加,CXCL1及其下游炎症因子NF-κB、IL-8、IL-6和TNF-α很可能直接参与了神经炎症的病理过程。众所周知,大脑主要由皮质神经元细胞和星型胶质细胞构成,两种细胞之间存在频繁而持续的交互作用。那么,缺血性中风发生后,过量表达的CXCL1与哪些细胞或因子有关?这些细胞或因子又通过何种方式参与调控了CXCL1的表达及神经炎症的进程?为此,我们进一步通过生物信息学分析网站,科学推断出CXCL1上游可能的调控因子miR-181c-3p。接下来,分别诱导了IBI动物模型和OGD细胞模型,通过形态学和分子生物学方法充分验证了上述数据和分析结果,并阐明了皮质神经元细胞-外泌体-星型胶质细胞间,通过miR-181c-3p来调控CXCL1表达并参与缺血性脑损伤神经炎症的具体分子机制。为研发对抗缺血性脑损伤神经炎症的有效药物提供新靶点,开辟新途径。第一部分缺血性脑损伤后,趋化因子CXCL1与炎症因子表达有关,受miR-181c-3p调控目的:从缺血性脑损伤模型中找到与神经炎症相关的重要因子,以及可调控该因子表达的micro RNA,并在MCAO模型中验证。方法:1.通过GEO数据库进行差异分析,采用MCAO法制备IBI大鼠模型,利用Morris水迷宫实验和术后脑形态学验证造模是否成功。2.通过RT real-time PCR和Western Blot方法分别检测假手术组和MCAO手术组大鼠脑组织miR-181c-3p和CXCL1的表达,通过ELISA法检测血清中NF-κB、IL-8、IL-6和TNF-α的水平。3.通过生物信息学预测网站预测可调控CXCL1的miRNA,用双荧光素酶报告基因分析法在HEK293细胞中验证。4.通过RT real-time PCR和Western Blot方法检测miR-181c-3p模拟物对星型胶质细胞CXCL1的m RNA和蛋白表达的影响。结果:***1在缺血性脑损伤组织中高表达,可能受miR-181c-3p调控我们对GEO数据库中,缺血性脑损伤相关的GSE61616和GSE78731微阵列数据(MCAO模型)进行了差异分析。结果发现,缺血性脑损伤部位CXCL1均呈现高表达状态。我们通过生物信息学在线预测网站DIANA TOOLS、miR Walk和miR Search分别预测了可能与CXCL1结合的潜在miRNA,miR-181a-1-3p、miR-181c-3p和miR-711可能与CXCL1有结合位点。我们推测miR-181c-3p可能通过调节星型胶质细胞CXCL1的表达而影响IBI的神经炎症。采用大脑中动脉阻断(MCAO)法制备缺血性脑损伤(IBI)大鼠模型,利用Morris水迷宫实验和术后脑形态学观察,验证IBI大鼠模型的建立是否成功。从术后脑形态学观察比较24小时后脑梗死面积,可见假手术大鼠左右脑大小相等,无白色缺血痕迹,而MCAO大鼠右侧脑肿胀,右侧脑缺血明显。同样,Morris水迷宫实验

关键词： 炎症   MVI   预测模型  

摘要： 目的:评估术前全身性炎症指标[中性粒细胞/淋巴细胞(NLR)、血小板/淋巴细胞(PLR)、系统免疫炎症指数(SII)、预后营养指数(PNI)]和肝脏炎症指标[甲胎蛋白(AFP)、门冬氨酸氨基转移酶/血小板(APRI)、γ-谷氨酰转肽酶/丙氨酸氨基转移酶(γ-GT/ALT)]与乙型肝炎病毒(HBV)相关肝细胞癌(HCC)患者微血管侵犯(MVI)之间的相关性。并基于此建立HBV相关HCC患者MVI的早期预测模型。方法:回顾性分析2015年1月至2020年2月于福建医科大学附属第一医院肝胆胰外科245例行肝切除术的HBV相关HCC患者的术前临床资料,其中205例数据作为建模组,40例数据作为验证组。基于建模组资料,以是否合并MVI作为二分类因变量,先对各临床维度进行单因素及多因素分析,筛选HBV相关HCC合并MVI的独立危险因素;以上述独立危险因素构建HBV相关HCC患者的MVI早期预测模型和以包含全身性/肝脏炎症指标构建的子模型,在验证组中通过受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve,ROC)检验各模型的预测效能。结果:单因素分析结果:年龄、BMI、白蛋白、ALT、AST、γ-GT、AFP、肿瘤数目、肿瘤位置、肿瘤最大径、NLR、PLR、SII、PNI、APRI、γ-GT/ALT是HBV相关HCC患者合并MVI的危险因素。多因素分析结果显示:NLR、APRI、AFP、白蛋白、肿瘤最大径是HBV相关HCC患者合并MVI的独立危险因素。我们基于上述独立危险因素建立MVI预测模型P1以及仅以NLR、APRI、AFP3个炎症指标建立子模型P4。预测模型如下:P1=1/[1+e^(2.53-1.91X1-2.36X2-1.70X3-2.57X4+1.41X5)];P4=1/[1+e^(2.62-2.37X1-1.73X2-1.82X3)](X1-X5代表NLR、AFP、APRI、肿瘤最大径、白蛋白的赋值)。建模组中P1、P4的曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)分别为0.906、0.868(P=0.072);验证组中P1、P4的AUC分别为0.928、0.881。(P=0.124)结论:术前全身性炎症指标(NLR)和肝脏炎症指标(AFP、APRI)是HBV相关HCC患者合并MVI的独立危险因素。基于全身性和肝脏炎症指标建立的早期预测模型可用于HBV相关HCC患者MVI的预测,有助于指导个体化治疗,具有一定临床实用价值。

关键词： 镉   脂多糖   炎症   自噬   TLR4  

摘要： 镉(Cadmium,Cd)是我国最严重的重金属污染元素,其毒性被广泛研究,但镉暴露对免疫应答和炎症作用的研究还不够深入,其影响免疫反应的作用机制也不清楚。因此,本文主要研究免疫激活条件下镉对小鼠脾脏原代细胞免疫反应的作用,并探究镉促进炎症反应的作用机制。本实验室前期研究发现镉在刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)免疫激活模型中,能影响自噬和Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路,从而抑制免疫激活。相比于ConA,脂多糖LPS是一种更广泛的免疫激活剂,因此本文选用LPS来研究镉对LPS激活炎症的作用和分子机制。我们采用能被LPS激活的炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)作为免疫变化指标进行检测,结果显示在原代脾脏细胞中,镉暴露能促进LPS诱导的炎症反应。在LPS激活条件下,镉处理BALB/c小鼠脾脏原代细胞,western blotting显示LC3B-II和p62蛋白表达均增加,说明镉抑制了自噬过程;进一步使用双荧光自噬指示系统(m RFP-GFP-LC3)转染小鼠脾脏原代细胞,观察到在LPS激活下镉处理组绿色荧光增多,斑点呈黄色,表明自噬小体与溶酶体不能正常融合,镉暴露抑制自噬流。采用自噬诱导剂Rapamycin处理细胞促进自噬,发现镉暴露对炎症反应的促进得到缓解。上述实验结果表明镉暴露促进免疫炎症反应可能是通过抑制自噬介导的。为探索自噬在免疫炎症中的作用以及与LPS的作用靶点Toll样受体4(tolllike receptor 4,TLR4)的关系,在LPS激活时,使用自噬调节剂改变自噬,检测TLR4蛋白及其下游通路的变化。结果显示镉促进TLR4蛋白表达,其下游信号通路中的磷酸化蛋白P-IκBα和P-p65表达量也一致上调,同时,自噬诱导剂能减轻镉的作用。实时荧光定量PCR检测显示TLR4在m RNA水平无变化。TLR4蛋白半衰期的检测结果显示镉促使TLR4蛋白半衰期变长,说明镉能抑制TLR4蛋白的降解。本研究还研究了铜、锌、锰、镍四种金属离子对LPS诱导炎症的作用,发现铜、锰和镍能够促进LPS诱导的TNF-αmRNA表达水平,这表明在重金属对免疫的毒性中具有共性。综上所述,在免疫激活剂LPS激活时,镉通过抑制自噬途径减缓TLR4蛋白降解,促进免疫炎症反应。这为今后寻找重金属镉对免疫系统的作用靶点奠定基础,也为镉和其它重金属免疫毒性的预防、治疗提供理论依据。