关键词： 糖尿病肾病   单核/巨噬细胞   茯菟丹   金丝桃苷   骨髓来源巨噬细胞  

摘要： 目的:首先,通过比较2型糖尿病肾病患者在不同病程中外周血的单核细胞M1、M2型的极化水平,探讨单核/巨噬细胞系统极化失衡与2型糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)病情进展有无关联。其次,利用糖尿病肾病小鼠模型(db/db),给予茯菟丹及金丝桃苷(菟丝子单体)进行灌胃治疗,观察药物对db/db小鼠的体重、糖脂代谢及尿蛋白排泄率的影响,研究药物对肾组织、腹腔、脾脏中M1、M2型巨噬细胞亚型活化的作用,为茯菟丹和金丝桃苷治疗DKD提供实验依据。最后,利用高糖刺激下的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)模拟体外高糖状态,并且,以M2型巨噬细胞和脾脏T淋巴细胞共培养两种细胞模型,从细胞和分子水平,观察金丝桃苷对巨噬细胞M1/M2表型的极化作用及其相应的免疫学机制。方法:1.2型糖尿病肾病患者外周血M1/M2的极化状态的临床研究:采用横断面研究方法,选取广东省中医院住院或者门诊就诊的2型糖尿病肾病(T2DN)患者63例,并在我院体检中心随机选取与之年龄相匹配的健康志愿者为对照组(NC组)共7例。采集研究对象的一般情况及相应的生化指标,于清晨空腹留取受试者肘静脉血,使用单个核细胞分离液提取外周血中的原代单个核细胞,采用流式细胞术及酶联免疫吸附试验方法,检测研究对象外周血中单核细胞的相关指标。此外,根据24h尿白蛋白排泄率(UAER)将糖尿病肾病患者分为三个亚组,探讨单核巨噬细胞系统极化失衡与糖尿病肾病病情发展的关系。2.茯菟丹及金丝桃苷(菟丝子单体)对db/db小鼠巨噬细胞极化影响的研究:选择35只8周龄健康雄性db/db小鼠和和6只正常健康雄性db/m小鼠,根据体重将35只db/db小鼠随机分成5组,分别为模型组(db/db)、茯菟丹低剂量组(db/db+FTD,40mg/kg/day),茯菟丹高剂量组(db/db+FTD,80mg/kg/day),金丝桃苷低剂量组(db/db+LHPS,40mg/kg/day),金丝桃苷高剂量组(db/db+HHPS,80mg/kg/day),每组各7只。Real-time PCR检测茯菟丹及金丝桃苷对各组小鼠肾组织中巨噬细胞极化的影响;流式细胞术(FCM)检测茯菟丹及金丝桃苷对各组小鼠腹腔及脾脏来源的巨噬细胞极化的作用;电镜下观察各组小鼠肾组织中药物对足细胞数目及形态的改变。3.金丝桃苷的体外研究:采用高糖刺激骨髓来源巨噬细胞的体外高糖模型,细胞分组如下:正常对照组(Control)、高糖组(HG)、HG+金丝桃苷高剂量组(HPS 50uM,HHPS)、HG+金丝桃苷中剂量组(HPS 25uM,MHPS)、HG+金丝桃苷低剂量组(HPS 12.5uM,LHPS)。qPCR检测各组巨噬细胞的M1型、M2型标记物的表达。此外,应用Transwell小室构建M2型巨噬细胞和小鼠脾脏T淋巴细胞共培养的模型,给予不同浓度的金丝桃苷进行干预。实验分组如下:T淋巴细胞单培养(T)、M2型巨噬细胞、T淋巴细胞共培养(M2+T),M2+T+HPS 50uM(HHPS)、M2+T+HPS 12.5uM(LHPS)。采用流式细胞术检测Th2细胞(IL-4+CD4)、Tregs(Foxp3+CD4)免疫细胞亚群的表达情况,探讨金丝桃苷的免疫学机制。结果:1.2型糖尿病肾病患者外周血M1/M2的极化状态的研究结果相比起健康对照组,早期糖尿病肾病患者的外周血单核细胞中M0(P<0.001)、M2(P<0.0001)水平都显著升高;相比起早期患者,M1水平在临床期显著上升(P<0.05),具有显著差异,但M2水平在临床期和尿毒症期均呈现下降的趋势,其中临床期较早期的CD206水平下降63.85%(P<0.0001),尿毒症期较早期的CD206下降72.55%(P<0.001)。与健康对照组相比,尿毒症期患者血浆中TNF-α(M1型)水平明显升高(P<0.0001);与早期患者相比,尿毒症期患者血浆中TNF-α(M1型)水平均显著升高(P=0.0002,P<0.001);与临床期相比,尿毒症期患者血浆中TNF-α(M1型)水平均显著升高(P=0.0018,P<0.01)。与健康对照组相比,早期患者外周血血浆中IL-4(M2型)水平升高,但无统计学差异(P>0.05);随着糖尿病肾病病程的进展,与早期DN相比,临床期患者IL-4水平下降了 47.1%(P=0.0035,P<0.01),尿毒症期患者IL-4水平下降了 56.25%(P=0.0037,P<0.01)。早期患者血浆中IL-4浓度较正常对照组升高但无统计学差异(P>0.05)。由此可见,相比起健康人,糖尿病肾病患者体内存在明显的炎症状态;并且随着病情进展,TNF-α浓度逐渐升高,而IL-4浓度逐渐下降。Spearman相关分析表明,糖尿病肾病患者

关键词： 儿童肝移植   全身炎症反应综合征   移植物体重比  

摘要： 目的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)可由感染或非感染因素引起,感染是肝移植术后住院死亡的常见原因,而非感染因素也不能忽视。在移植前消除可引起SIRS发生的风险,并及时干预是非常重要的。本研究目的是分析儿童肝移植术后发生早期SIRS的影响因素及对预后的影响,同时探讨GRWR对SIRS发生的作用机制。方法回顾性分析2017年7月至2019年11月广西医科大学第一附属医院实施的73例儿童肝移植患者资料,根据肝移植术后2周内有无SIRS,分为肝移植术后早期全身炎症反应综合征组(SIRS组)和肝移植术后早期未发生全身炎症反应综合征组(无SIRS组)。对两组患者术前、术中及术后临床资料行基线比较,通过多因素logistic回归分析,探究肝移植术后早期发生SIRS的独立危险因素,同时使用受试者工作特征(Receiver operating characteristics,ROC)曲线计算其最佳临界值。结果73例患者中有39例[53.4%,95%置信区间(Confidence interval,CI)(41.7%-65.1%)]肝移植术后早期发生SIRS。与无SIRS组相比,SIRS组移植物体重比(Graft to body weight ratio,GRWR)更高(3.68±1.21 vs.3.05±1.04%;P=0.020),输红细胞体重比(Red cell concentrates transfusion to body weight ratio,RCWR)更高[60.0(39.6,75.6)vs.39.6(25.2,72.0)ml/kg;P=0.049],术后机械通气时间(Mechanical ventilation time,MVT)更长[63.6(35.0,105.3)vs.38.5(15.0,65.0)h;P=0.039]。SIRS组累计生存率低于无SIRS组(84.6%vs.100%;P=0.018),差异在统计学上具有显著性。ROC曲线分析可知GRWR=3.08%[ROC曲线下面积(Area under the curve,AUC)=0.672;P=0.008],其敏感性82.1%,特异性52.9%。多因素分析确定GRWR>3.08%[优势比(Odds ratio,OR)=3.65,95%CI(1.05-12.66),P=0.042]为肝移植后早期SIRS的独立危险因素。结论肝移植术后早期SIRS的儿童生存较差,移植后早期SIRS的发生与GRWR较大有关,GRWR>3.08%预测移植后早期SIRS有一定的敏感性。对移植前患者应充分做好移植物的评估,选取合适比值的GRWR,以取得较好的手术效果,尤其对移植前存在高风险的患者更应该慎重。

关键词： ML355   脂多糖   巨噬细胞   12-羟基二十碳四烯酸  

摘要： 目的:研究12-脂氧合酶(12-Lipoxygenase,12-LOX)抑制剂ML355对小鼠经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的炎症反应的拮抗效应及其分子机制。方法:1.将24只成年雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为4组,对照组、LPS组(腹腔注射 LPS 20mg/kg)、ML355 预治疗组(30mg/kg、15mg/kg 的 ML355 提前1h腹腔注射+LPS)。建模后12h处死小鼠,收集外周血、腹腔灌洗液和腹腔巨噬细胞,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆和腹腔灌洗液中12羟基二十碳四烯酸(12-HETE)含量,测定腹腔灌洗液中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL-1β、IL-6、IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平及血清中IFN-y、IL-1β水平,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中IFN-y、IL-1β及花生四烯酸-15-脂氧合酶(Alox-15)的 mRNA 表达。2.体外培养小鼠原代腹腔巨噬细胞(PMs),随机分为4组,对照组、LPS组(LPS 20mg/L)、ML355 预处理组(25μmol/L、50μmol/L 的 ML355 提前干预 1h+LPS)。于LPS作用不同时间点收集各组的细胞上清和细胞团块。用qRT-PCR检测细胞中IFN-γ、IL-1β 及 Alox-15 的 mRNA 表达,ELISA 检测细胞上清液中 12-HETE、IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10水平,通过蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测12/15-LOX及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路蛋白的表达。结果:***模型组血浆和腹腔灌洗液中12-HETE的含量较对照组显著增高。与LPS模型组比较,ML355预处理后可明显减少血浆和腹腔灌洗液中12-HETE含量,明显降低血清和腹腔灌洗液中IFN-γ水平,qRT-PCR结果显示ML355明显下调IFN-γ、IL-1β及Alox15基因表达。2.在体外实验中,与对照组比较,LPS刺激腹腔巨噬细胞后,上清中12-HETE含量呈升高趋势,但没有统计学差异,予以ML355预处理后12-HETE含量明显降低。与LPS组比较,ML355预处理后细胞上清IFN-γ水平显著下降,细胞内IFN-γ、IL-1β的基因表达明显下调,p38 MAPK的磷酸化水平差异无显著变化,而细胞外信号调控蛋白激酶(ERK)、c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化水平及12/15-LOX蛋白表达减少。结论:(1)ML355可抑制小鼠经LPS诱导的炎症反应。(2)ML355能明显降低LPS刺激下炎性巨噬细胞中炎性因子IFN-γ的生成,其机制可能是通过抑制12/15-LOX、p-ERK、p-JNK 蛋白来实现的。

关键词： 烟雾病   免疫炎症反应   白细胞计数   淋巴细胞绝对值   中性粒细胞绝对值-淋巴细胞绝对值比率  

摘要： 背景和目的:脑卒中相关的免疫炎症反应可通过多种生化标记物进行监测。越来越多的证据表明免疫炎症机制在烟雾病(MMD)的发生发展机制相关,多项研究认为在多基因异常的背景下,自身免疫反应、感染/炎症反应等多种环境因素可能是触发MMD的必要条件。我们的研究集中在探讨MMD的发生是否与全身低级别炎症反应有关,并推测MMD患者血液生物标志物可能具有诊断鉴别价值。方法:回顾性分析104例MMD患者(男性47例,平均年龄49.52±12.97岁)和64例健康对照者的临床资料。收集总白细胞计数(WBC)、中性粒细胞绝对值(ANC)、淋巴细胞绝对值(ALC)、和单核细胞绝对值(AMC),同时计算中性粒细胞绝对值-淋巴细胞绝对值比率(NLR)、淋巴细胞-单核细胞比率(LMR)、血小板-淋巴细胞比率(PLR)。采用单因素分析和Logistic回归分析来描述各参数的与MMD相关性。根据概率绘制的受试者工作特征曲线(ROC)评价各参数的诊断效率。若存在统计学意义,则进一步行亚组比较。结果:在我们的研究中,MMD组与对照组比WBC、ANC、ALC、AMC较高,有显著性差异(均P<0.01)。分别为WBC(7.9±2.28 vs.6.2±1.5,p<0.001)、ANC(4.81±2.16 vs.3.71±1.18,P<0.001)、ALC(2.23±0.96 vs.1.89±0.6,P=0.006)、AMC(0.65±0.47vs.0.45±0.15,p<0.001)。Logistic回归分析显示WBC[比值比(OR)1.416,95%可信区间(CI)1.120-1.791,P=0.004]和AMC(OR 17.972,95%CI 1.454-222.116,P=0.024)是MMD的独立危险因素。在将MMD组分为出血组和缺血组进一步亚组比较,单变量分析结果显示:ANC(5.67(3.78-7.17)vs.3.89(3.18-5.135),P=0.002)、ALC(1.78(1.49-2.18)vs.2.23(1.74-2.84),p=0.002)、NLR(2.95(2.14-4.29)vs.1.65(1.30-2.34),P<0.001)、PLR(132.4(111.2-205.1 vs.110.7(87.4-146.8),p=0.011)、LMR(3.06(2.04-3.82)vs.4.07(3.20-5.15),P<0.001)。logistic回归分析显示ANC(OR 1.382,95%CI1.095-1.743,p=0.006)是出血型MMD的独立危险因素,而ALC(OR 0.451,95%CI 0.237-0.859,P=0.015),表明淋巴细胞是保护因素。结论:我们的研究结果提示MMD患者存在全身低度炎症,免疫细胞与MMD的发生发展具有一定的相关性。WBC和AMC升高是MMD患者的独立危险因素;ANC是出血型MMD的独立危险因素,而ALC是保护因素。

关键词： 血液透析   动静脉内瘘   带隧道带涤纶套导管   微炎症  

摘要： 研究背景:目前,慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)已经成为了让全世界公共健康受到威胁的主要疾患之一。每年至少240万人因CKD致死亡,是目前全球死亡率中排第11位的疾病。大部分患者CKD患者最终会进展至终末期肾病(End stage renal disease,ESRD),进而需要接受肾脏替代治疗(Renal replacement therapy,RRT)。其中血液透析是全球应用最为普遍的肾脏替代治疗手段之一,极大地提高了ESRD患者的生存率,但长期透析患者也会存在诸多并发症,严重影响患者的生活质量。维持性血液透析患者普遍存在微炎症状态,微炎症状态可促使血管钙化,导致心脑血管疾病发生,增加贫血和营养不良发生。大多数维持性血液透析(MHD)患者治疗期间其C反应蛋白(CRP)水平均普遍上升,而C反应蛋白与矿物质一骨代谢、营养不良、心脑血管疾病及贫血密切相关。血管通路是血液透析患者的生命线,但血管通路并发症导可增加MHD患者感染风险等,从而增加患者的经济负担和死亡风险。而同时MHD患者的微炎症状态也可能会导致内瘘血管狭窄、导管血栓形成,进而增加血管通路失功,两者可相相互影响。目前关于不同的血管通路类型对血液透析患者炎症状态影响的关系仍有争论。因此,评价不同血管通路类型对维持性血液透析患者炎症水平变化和是否增加其感染风险具有重要临床意义。目的:探讨不同血管通路类型(自体动静脉内瘘与带隧道带涤纶套导管)对维持性血液透析患者患者微炎症状态和感染的影响。方法:选取2018年9月至2019年9月的256例维持性血液透析患者作为研究对象,其中176例来自西南医科大学附属医院,80例来自遂宁市第一人民医院,按照患者所使用的血管通路将其分为两组,一组为内瘘组(自体动静脉内瘘),另一组为导管组(带隧道带涤纶套导管),其中内瘘组204例,其中男129人,女75人,平均年龄53.56±13.13岁;导管组52例,其中男26人,女26人,平均年龄59.55±11.97岁。留取患者血标本,采用血球分析仪检测人血红蛋白,全自动生化仪检测血尿素、尿酸、肌酐、血清白蛋白、磷、钙,电化学分析仪检测全段甲状旁腺激素(PTH),计算患者尿素清除分数(KT/V)及尿素清除指数(URR),免疫比浊法检测血清C反应蛋白,ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)和IL-6。同时记录3个月内患者发生感染事件的情况。采用倾向性匹配分析法,探讨内瘘组与导管组两组间血红蛋白、常规生化指标、炎症标志物和感染事件发生的差异,并分析各炎症因子与生化指标间的相关性。结果:对内瘘组与导管组进行倾向性评分匹配后,两组患者性别构成和年龄无差异,组间具有可比性。在血常规方面,与导管组相比,内瘘组血红蛋白水平明显更高,差异有统计学意义(p<0.05)。在生化指标方面,与导管组相比,内瘘组血尿素、尿酸、血清白蛋白、尿素下降率、KTV和尿素清除指数明显更高,内瘘组总钙较低,差异有统计学意义(p<0.05),两组患者血磷及PTH无显著差异(p>0.05)。在炎症指标方面,与导管组相比,内瘘组血清CRP和IL-1明显更低,而血清TNF-α较高,差异有统计学意义(p<0.05);两组患者的IL-6无显著性差异(p>0.05);在感染事件方面,两组感染发生率无差异(p=0.841)。秩相关分析发现:尿素氮与血清CRP呈负相关,血清白蛋白与IL-1呈正相关,尿素氮与IL-1呈负相关;TNF-α与血清白蛋白呈负相关。多重线性回归分析结果可知:血管通路类型是血清CRP及IL-1水平的独立影响因素,导管组患者的CRP比内瘘组平均高7.632mg/ml,导管组患者的IL-1比内瘘组平均高10.877ng/ml;血管通路类型对患者的血清IL-6及TNF-α水平无明显影响。结论:(1)不同血管通路可以影响维持性血液透析患者血清CRP、IL-1及TNF-α水平。(2)在维持性血液透析患者中,带隧道带涤纶套导管可能是导致炎症指标进一步升高的原因。(3)内瘘组和导管组患者发生临床显性感染的无差异。

关键词： 重症脑梗死   肠道粘膜屏障损伤   细菌内毒素   免疫炎症反应  

摘要： 目的通过检测重症脑梗死患者外周血清肠道粘膜损伤标志物、外周血清细菌内毒素、外周血T淋巴细胞亚群、炎性标志物及血清炎症因子等,来探讨重症脑梗死患者第三天肠道粘膜的损伤与外周免疫炎症反应之间的相关性。方法1.纳入2018年8月到2019年10月在苏北人民医院脑卒中中心住院治疗的重症脑梗死患者20例（重症脑梗死组）和社区脑卒中筛查人群20例（对照组）为研究对象,收集基本临床资料;重症脑梗死患者均于发病24小时内入院,排除其他系统的感染,于病程第三日清晨采集外周静脉血。2.检测外周静脉血清中肠道粘膜损伤标记物D-乳酸（D-lactic acid,D-LA）、肠型脂肪酸结合蛋白（Intestinal fatty acid binding protein,I-FABP）;外周血清细菌内毒素（Endothelin,ET）;炎症因子白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）;炎性标志物超敏C-反应蛋白（High-sensitivity C-reactive proteinhs-CRP,hs-CRP）,以及外周血T淋巴细胞亚群（CD3+CD4+T淋巴细胞比例、CD3+CD8+T淋巴细胞比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值）。3.比较重症脑梗死组和对照组外周血清肠道粘膜损伤标记物、血清细菌内毒素、血清炎症因子及T淋巴细胞亚群是否存在差异。4.探讨重症脑梗死组外周血清肠道粘膜损伤标记物与血清细菌内毒素、血清炎症因子及T淋巴细胞亚群等是否具有相关性。5.探讨重症脑梗死组血清细菌内毒素与外周血炎症因子、外周血T淋巴细胞亚群是否具有相关性。6.探讨重症脑梗死组外周血清有差异的炎症因子与外周血T淋巴细胞亚群是否具有相关性。结果1.重症脑梗死患者第三天外周血清肠道粘膜损伤标记物D-乳酸38.48±4.94umol/L明显高于对照组30.57±3.12 umol/L,差异有统计学意义（P<0.01）,而重症脑梗死组和对照组的外周血清肠型脂肪酸结合蛋白水平分别为191.37±22.99 ng/ml和199.91±16.98 ng/ml,未见统计学差异（P>0.05）。2.重症脑梗死患者第三天,外周血清炎症因子IL-6水平为3.43±6.26pg/ml明显高于对照组1.57±0.70 pg/ml,超敏C-反应蛋白水平为18.93±16.01 mg/L高于对照组0.34±0.49 mg/L,差异均有统计学意义（P<0.01）。重症脑梗死组和对照组血清炎症因子TNF-α水平分别为0.76±4.14 pg/ml和0.76±1.38 pg/ml,未见统计学差异（P>0.05）。重症脑梗死组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞比例55.52±8.24%低于对照组65.03±10.84%,CD3+CD8+T淋巴细胞比例40.63±10.99%高于对照组30.46±10.50%,具有统计学差异（P<0.05）,且CD3+CD4+/CD3+CD8+的数值在重症脑梗死组为1.33±0.67,对照组为2.52±1.19,差异有统计学意义（P<0.01）。3.重症脑梗死第三天外周血清肠道粘膜损伤标记物D-乳酸水平与血清细菌内毒素、血清炎症因子IL-6、T淋巴细胞亚群及炎性标志物超敏C-反应蛋白相关性分析显示,外周血清D-乳酸与血清细菌内毒素（r=0.368,P=0.110）、血清炎症因子IL-6（r=0.115,P=0.629）、CD3+CD4+T淋巴细胞比例（r=0.157,P=0.508）、CD3+CD8+T淋巴细胞比例（r=-0.182,P=0.442）、CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值（r=0.140,P=0.556）、炎性标志物超敏C-反应蛋白（r=0.001,P=0.097）,均未见明显相关性。4.重症脑梗死第三天外周血清细菌内毒素15.04±1.22 pg/ml,显著高于对照组13.59±0.95 pg/ml,差异有统计学意义（P<0.01）。Spearman相关性分析表明,外周血清细菌内毒素水平与外周血清IL-6水平具有相关性（r=0.533,P=0.016）,而与血清TNF-α（r=0.227,P=0.336）、炎性标志物超敏C-反应蛋白（r=0.425,P=0.062）、CD3+CD4+T淋巴细胞比例（r=0.084,P=0.724）、CD3+CD8+T淋巴细胞比例（r=0.050,P=0.833）、CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值（r=0.084,P=0.723）未见明显相关性。5.重症脑梗死第三天外周血清IL-6水平与外周淋巴细胞亚群相关性分析结果显示,外周血清IL-6与CD3+CD4+T淋巴细胞比例（r=0.049,P=0.838）、CD3+CD8+T

关键词： 慢性肾脏病   继发性甲状旁腺功能亢进   炎症状态   矿物质骨代谢紊乱   成纤维细胞生长因子23  

摘要： 背景最新研究表明,截止2017年全球慢性肾脏病(Chronic Kidney Diseases,CKD)患者约有6.975亿,占全球人口的9.1%,而中国患者1.323亿,居世界首位。矿物质骨代谢异常是CKD 2-3期即可出现的并发症,表现为钙、磷、甲状旁腺激素(Parathormone,PTH)、成纤维细胞生长因子-23(Fibroblast Growth Factor-23,FGF-23)等代谢异常,骨转化、矿化以及血管和异位钙化等。继发性甲状旁腺功能亢进(Secondary Hyperparathyroidism,SHPT)则是其中的主要组成部分,持续进展不仅可导致转移性钙化,出现狮面脸、身高矮小、骨痛等症状,还增加患者心血管事件风险以及全因死亡率。甲状旁腺切除术(Parathyroidectomy,PTX)是目前临床上对于难治性SHPT患者主要的治疗措施。近年的研究提示,微炎症状态普遍存在于CKD患者体内。其主要标志物C反应蛋白(C-Reactive Protein,CRP),白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)等常随CKD进展而逐渐增加,并且常与很多并发症有直接或间接的关系。已有的研究主要针对CKD不同分期或者已进入透析治疗阶段患者矿物质骨代谢异常指标和微炎症状态之间的关系进行分析,而针对难治性SHPT患者行PTX手术治疗前后围手术期炎症因子的变化尚未见有报道。本研究旨在观察难治性SHPT患者围手术期矿物质骨代谢相关指标与炎症因子的变化及其相关性,并通过体外细胞实验进一步验证矿物质骨代谢相关指标是否参与炎症因子的调节。目的观察SHPT患者围手术期矿物质骨代谢相关指标及炎症因子水平变化,分析矿物质骨代谢相关指标与炎症因子间的相关性;观察人肝脏细胞LO2(人体分泌炎症因子CRP的主要细胞),在不同浓度甲状旁腺激素相关蛋白(Parathyroid Hormone-Related Protein,PTHrP)、FGF-23 刺激下产生超敏 C 反应蛋白(High Sensitivity C-Reactive Protein,hs-CRP)的水平,进一步探索 iPTH、FGF-23 是否是调控炎症因子hs-CRP的因素。方法1.临床实验选取2018年01月-2019年08月在河南省人民医院行PTX患者47例作研究对象,收集研究对象术前(入院第1天)、术后4天空腹静脉血,同时收集20例健康人作为对照组。收集受试对象临床数据包括:性别、年龄、血红蛋白、促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)、铁蛋白、白蛋白、甘油三酯、总胆固醇、血清钙、磷、全段甲状旁腺激素(Intact Parathyroid Hormone,iPTH)等。采用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测以下指标,包括iPTH、FGF-23;骨形成标志物[骨特异性碱性磷酸酶(Bone Alkaline Phosphatase,BAP)、Ⅰ 型胶原氨基末端前肽(type Ⅰ collagen Amino-Terminal propeptide,PINP)];骨吸收标志物[Ⅰ 型胶原 C 端肽(type Ⅰ collagen C-Terminal peptide,CTX-I)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase,TRAP-5b)];血清炎症因子[hs-CRP、IL-6]。2.细胞实验建立体外人肝脏细胞(LO2)培养模型,矿物质骨代谢相关指标iPTH、FGF-23刺激,收集上清检测炎症因子水平:分别至六孔培养板中加入不同浓度iPTH及FGF-23培养24小时,收集上清,采用ELISA检测上清炎症因子hs-CRP水平。结果***患者基线资料:矿物质骨代谢指标PINP、BAP、CTX-I、TRAP-5b水平明显高于正常人范围,炎症因子hs-CRP、IL-6水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P值均<0.0.5)。***患者基线资料相关分析结果:(1)SHPT患者术前iPTH、FGF-23与一般临床资料及矿物质骨代谢指标的相关性结果:Spearman或Pearson相关性分析显示术前血清iPTH与BAP、PINP、CTX-I、FGF-23均呈正相关,iPTH与TRAP-5b无相关性;术前血清BAP与TRAP-5b、PINP与CTX-I均呈正相关。(2)SHPT患者术前iPTH、FGF-23与炎症因子的相关性结果:Spearman或Pearson相关性分析显示术前iPTH与hs-CRP、IL-6存在正相关;术前FGF-23与hs-CRP、IL-6正相关。3.围手术期结果:(1)围手术期矿物质骨代谢相关指标变化:PTX术

关键词： 牙龈间充质干细胞   外泌体   巨噬细胞   极化   牙周炎  

摘要： 研究背景与目的牙周炎是一种由细菌感染引起的炎症破坏性疾病,细菌及其产物引发机体的免疫反应,最终导致牙周组织的破坏,从而形成牙周炎。巨噬细胞作为参与机体免疫的重要细胞,其极化状态对炎症水平的调节至关重要。牙周治疗的最终目标是消除炎症和促进牙周组织结构和功能性的再生。牙龈间充质干细胞(Gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)因其来源广泛、易于培养和优异的抗炎、免疫调节功能,备受重视。在组织再生研究领域,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的应用理念已经延伸到利用其来源的外泌体影响其它细胞的功能,调控机体微环境。外泌体是由多种细胞分泌的一种细胞外囊泡,具有细胞来源特异性。课题组前期研究证实GMSCs通过旁分泌作用影响高脂微环境下巨噬细胞的极化状态,从而调节炎症反应,因此我们推测牙龈间充质干细胞来源的外泌体(GMSCs derived exosomes,GMSCs-exos)具有和GMSCs相似的免疫调节作用。本研究旨在探讨GMSCs-exos对炎症条件下巨噬细胞表型和功能的调节作用,有望为牙周炎及机体其他炎症破坏性疾病的治疗提供理论依据和新思路。实验方法收集健康的牙龈组织,酶消化法分离培养得到GMSCs。成脂成骨诱导分化实验、克隆形成率(CFU-F)实验和流式细胞术对GMSCs的干细胞特性进行鉴定。收集第3-4代的GMSCs的上清液,超速离心法提取GMSCs-exos,采用纳米粒度分析仪和透射电子显微镜的方法进行其大小、形态的鉴定,使用免疫蛋白沉淀法(Western Blot)进行GMSCs-exos表面蛋白CD9、CD81、CD63的鉴定。将静息状态下的巨噬细胞(M0巨噬细胞)经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)+γ干扰素(Gamma interferon,IFN-γ)联合刺激24 h后,再加入GMSCs-exos继续培养24 h,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和流式细胞术检测每组M1和M2巨噬细胞相关极化标记物的表达。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测每组细胞上清液中致炎和抗炎因子的浓度。实验结果茜素红S和油红O染色结果显示GMSCs具有成脂、成骨分化能力。CFU-F结果显示GMSCs呈群落性生长。流式细胞仪检测显示GMSCs表面CD90、CD105、CD73阳性表达,CD45阴性表达。超速离心法获得的提取物在透射电子显微镜下呈典型的椭圆形双层膜状结构;在纳米粒度分析仪下粒径大小在100 nm左右;Western Blot结果显示其阳性表达CD9、CD81、CD63。以上鉴定证实我们提取到的物质即为GMSCs-exos。炎症刺激后的巨噬细胞加入GMSCs-exos后,ELISA检测结果显示:TNF-α浓度明显降低(P<0.05),IL-10浓度明显升高(P<0.05);qRT-PCR和流式细胞术结果显示:M1巨噬细胞相关标记物IL-12、IL-1β、TNF-α、CD86表达降低(P<0.05),M2巨噬细胞相关标记物IL-10表达升高(P<0.05),CD163的表达在组间无差异(P>0.05)。以上结果提示,GMSCs-exos能够促进炎症状态下的巨噬细胞向M2型极化,减轻炎症反应。结论GMSCs-exos促进炎症微环境下巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,减轻炎症反应。