关键词： 谷氨酰胺   脓毒症   细胞因子   免疫炎症反应   酶联免疫吸附   肿瘤坏死因子   白介素10  

摘要： 第一部分谷氨酰胺缺乏对危重病患者免疫炎症反应的影响　　 目的：探讨谷氨酰胺缺乏对危重病患者免疫炎症反应的影响。　　 方法：筛选40例APACHEH评分>=8分的危重症患者，同时选取健康志愿者10例作为对照。所有患者均在入ICU后48h内留取静脉血标本，健康志愿者清晨6点空腹留取静脉血标本，观察患者血谷氨酰胺水平及炎症反应的变化。　　 结果：危重病患者血谷氨酰胺浓度明显低于健康对照组，并且与APACHEп评分呈明显负相关(r＝-0.572，P<0.05)。炎症反应指标中TNF-α(r=-0.750，P<0.05)和IL-10(r=-0.723，P<0.05)与血谷氨酰胺浓度呈明显负相关。　　 结论：危重病患者存在谷氨酰胺缺乏，血谷氨酰胺水平的下降对机体炎症反应有一定的影响。　　 第二部分谷氨酰胺对热休克蛋白70及细胞因子表达的影响　　 目的：观察谷氨酰胺抑制人外周血单个核细胞细胞因子表达是否与HSP70介导有关。　　 方法：Ficoll密度梯度离心法提取健康志愿者新鲜PBMCs，将分离得到的细胞分为两部分。第一部分细胞分为六部分，分别用不同浓度的Gln(0、8、15 mmol/L)预处理0.5 h及2.0 h后，再用10g/L内毒素刺激4.0 h，留取细胞及上清。第二部分细胞分为A、B、C三组，将HSP阻断剂Quercetin(200 umol/L)加入A组及B组中，作用0.5 h;再将谷氨酰胺8 mmol/L加入A组和C组中;1.0 h后在三组中均加入10 g/L内毒素刺激4.0 h，留取细胞及上清。酶联免疫吸附(ELISA)测定上清中PBMCs肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-10(IL-10)的表达，免疫印迹(Western blot)技术检测细胞内HSP70的表达情况。对指标检测结果进行统计学分析。　　 结果：8 mmol/L及15 mmol/L谷氨酰胺预处理0.5 h后能够明显增加HSP70的表达(P<0.05)，8mmol/L谷氨酰胺预处理2.0 h后能明显增加HSP70的表达(P<0.05)。同时TNF-α和IL-10表达受抑(P<0.05);使用HSP70阻断剂Quercetin后，HSP70表达量明显下降，同时TNF-α和IL-10表达增加(P<0.05)。　　 结论：谷氨酰胺抑制内毒素刺激下PBMCs细胞因子的表达与HSP70介导有关。　　 第三部分谷氨酰胺对磷酸化p38及细胞因子表达的影响　　 目的：观察谷氨酰胺(Gln)抑制细胞因子的表达是否与p38磷酸化有关。　　 方法：Ficoll密度梯度离心法提取健康志愿者新鲜外周血单个核细胞，在培养液中加入Gln、p38MAPK通路阻滞剂(SB203580)和HSP70阻断剂(Quercetin)，用内毒素刺激4h后留取细胞及上清，酶联免疫吸附法测定内毒素刺激下单个核细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素10(IL-10)的表达，Western Blot技术检测细胞内磷酸化p38的表达情况。　　 结果：Gln能够明显增加HSP70的表达，同时TNF-α和IL-10表达受抑;使用Quercetin和SB203580后，磷酸化p38减少的同时TNF-α和IL-10也减少了。　　 结论：谷氨酰胺下调LPS刺激下PBMCs细胞因子的过度表达依赖于p38MAPK信号蛋白的抑制。

关键词： 氧气   一氧化碳   脓毒症   肺   炎症反应  

摘要： 脓毒症(Sepsis)是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中,是机体对感染的一种不能控制的全身性炎症反应。炎症反应是感染或非感染因素如细菌感染、外伤、烧伤、较大外科手术等,刺激宿主免疫系统,释放细胞炎症介质,发生的一种临床病理过程。以细胞因子为代表的多种炎症介质的失控性释放,产生过度炎症反应,不仅不能去除机体的致病因素,反而会抑制免疫系统,继续发展可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症和多器官功能不全,其共同病理生理特征是自身的免疫失控、体内白细胞大量激活,产生过量的炎症介质而引起全身多个脏器损伤。 一氧化碳(carbon monoxide, CO)在机体内由血红素加氧酶(HO)催化血红素产生,过去曾被认为是破坏细胞呼吸作用的有害物质,最近的研究发现CO还是一种气体信号分子,在损伤诱导的各种机体应激中具有保护组织的作用,在心血管、神经和免疫的生理和病理过程中都起着重要的调节作用。我们研究发现CO对炎症反应也具有抑制作用,但其机制尚未明确。 在本研究中,我们利用可以在机体内释放CO的一种新型金属—羰基化合物一氧化碳释放分子(tricarbonyldichlororuthenium (Ⅱ) dimer, CORM-2),通过在体实验研究高氧预处理联合外源性CO干预对脓毒症小鼠肺部炎症反应的抑制作用及(部分)分子机制。 第一部分盲肠结扎穿孔模型及高氧预处理联合CORM-2的使用方法的建立 目的 以盲肠结扎穿孔术复制接近于人类腹膜炎引起脓毒症或脓毒性休克的动物模型,明确高氧预处理对脓毒症机体的保护作用及CORM-2的使用方法。 方法 1)选用6--8周龄清洁级昆明种小鼠,雄性,体重20+2g,均由江苏大学动物实验中心提供。于本实验室(室温25℃)适应性饲养一周。术前禁食12小时。将氧气组小鼠置于通氧气的密闭容器中,予以吸氧30分钟。 2)异氟烷吸入麻醉小鼠,自腹中线行约1cm切口,逐层进入腹腔,轻柔快速找出盲肠,提起末端,分离肠系膜,穿细线在盲肠近端结扎,避过系膜血管,用20号针头穿透结扎处远端,自两穿孔处挤出肠内容物少许,回纳肠管至腹腔。3-0手术缝线缝合伤口,腹膜、肌层一同毯边缝合,皮肤层间断缝合。每只鼠腹腔注射等渗生理盐水1.0ml抗休克;单笼饲养,自由进食,足量饮水,切口涂以碘酊抗感染。 3)按照试剂规格,每10.25mg CORM-2溶解于500ul DMSO中配制成500ulCORM-DMSO溶液,吸取8ulCORM-DMSO溶液,溶解于152ul等渗生理盐水中,立即用于尾静脉注射。CORM-2要求现用现配。 结果 本实验室盲肠结扎穿孔术操作科学,模型符合实验要求,高氧预处理后小鼠存活率升高。CORM-2的配制符合实验要求,可安全用于实验。 结论 脓毒血症是危重病中常见的死亡原因,机体受严重感染或损伤而产生系统性炎症反应综合征(system inflammatory response syndrom,SIRS),进而导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrom, MODS)。本实验所采用脓毒症模型操作简便,通过外科处理使动物腹腔存在失活组织的同时,少量持续溢入混有多种细菌的肠内容物,引起腹腔感染。该模型中,动物各项指标检测明确,在机体损伤方面达到了预期的要求,可用于动物实验中炎症反应机制的研究。 近年合成的新型一氧化碳释放分子CORM-2通过溶解后释放CO发挥生理作用,在一定生理剂量时并不提高动物体内HbCO的浓度。本实验室不同模型研究证实,CORM-2可被安全有效的用于炎症反应的干预作用相关研究。 第二部分高氧预处理联合CORM-2干预对脓毒症小鼠碳氧血红蛋白含量及存活率的影响 目的 探讨高氧预处理联合CORM-2干预对脓毒症小鼠体内HbCO含量及存活情况的影响,以明确HbCO的表达水平,增加CORM-2的安全有效性,更好的为临床防治脓毒症提供理论指导。 方法 12只小鼠随机分为三组：CLP模型组、CORM-2组、高氧预处理组。将自制塑料盒氧舱在侧壁上、下分别钻孔后接通急诊氧气袋(氧气取自病房中心供氧装置),O2组小鼠放入盒中通氧气30分钟;制作CLP模型,配制CORM-2并记录打入CORM-2的时间,各组分别在1.5h、3h、6h、24 h记录小鼠存活数量,分别在各时间点采血0.5ml;在4只干净试管中加入等量物质：10mg低亚硫酸钠、10ml配制好的氨水、50ul抗凝血,轻轻混匀;分光光度计选择538nm、578nm波长,于10分钟内测定吸光度值,记录结果,绘制图表。

关键词： 大黄素   LPS   TLR-4   抗炎   NF-κB   人脐静脉血管内皮细胞  

摘要： 大黄素具有一定的抗血管炎症反应的活性,但是其具体的分子机制并不清楚。本文以体外脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人脐静脉血管内皮细胞炎性反应为研究模型,探讨大黄素影响血管内皮细胞炎性反应的分子机制,寻找大黄的作用靶点。在用大黄素与血管内皮细胞共同孵育后,大黄素能够明显地通过抑制LPS诱导的内皮细胞中NF-κB的活化和IκB的降解,来抑制内皮细胞中促炎因子IL-1β和IL-6,趋化因子IL-8和MCP-1的表达。但是对于IL-1β诱导的血管内细胞中NF-κB的活化和IκB的降解,大黄素却没有产生抑制作用。这就提示我们,大黄素的作用靶点不可能存在于LPS和IL-1β所共同诱导的那一段信号转导途径中,而是应该存在于LPS受体复合物部位,影响TLR-4的表达或LPS受体复合物的形成。进一步研究发现胆固醇结合试剂(methyl-β-cyclodextrin,MBCD)能够抑制传代的不能够表达mCD14(membrane CD14)的血管内皮细胞中LPS诱导的NF-κB活化,这表明脂筏参与调解了传代血管内皮细胞中LPS通过TLR-4诱导的NF-κB活化。大黄素可以通过使内皮细胞脂筏中的胆固醇泄漏来破坏脂筏的结构,从而抑制LPS诱导的内皮细胞中NF-κB的活化和细胞因子的表达。大黄素这种抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎性反应的活性,表明它可能会在治疗动脉粥样硬化或与炎症相关的心血管疾病方面具有一定的价值。

关键词： 外源性一氧化碳释放分子   脓毒症   肝脏   炎症反应   抑制作用  

摘要： 背景与目的 脓毒症(Spesis)是指由感染引起的全身性炎症反应综合征(SystemicInflammatory Response Syndrome,SIRS),是当前创伤、烧伤外科以及ICU所面临的棘手难题,其进一步发展所导致的脓毒性休克(septic shock,SS)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)以及多脏器功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),已成为临床主要死亡原因之一。尽管现代外科监护技术和抗生素治疗有了很大进展,但脓毒症的死亡率仍然居高不下,因此脓毒症及其并发症尤其是MODS的防治,仍然是当代外科学领域的难题之一。 肝脏作为机体的一个重要器官,在脓毒症的发生发展过程中起着至关重要的作用。有证据表明:肝脏拥有全身最多数量的巨噬细胞,负责清除来自肠道、脾脏的细菌和内毒素,肝巨噬细胞(Kuffer细胞)在脓毒症时合成和释放的多种急性时相蛋白和细胞因子,能使多种信号通路活化(包括januskinase/signal transducer andactivator of transcription-JAK/STAT通路)释放炎症介质且不断循环形成“瀑布样”级联反应,在脓毒症发生发展中起重要的作用。 本研究即采用LPS刺激单核巨噬细胞细胞和小鼠盲肠结扎和穿孔(cecalligation and puncture,CLP)脓毒症模型,以外源性CO释放分子CORM-2进行早期干预,观察它对JAKs分子磷酸化的抑制作用,旨在研究其对脓毒症JAK/STAT通路的活化是否具有调节作用,并探讨可能的分子机制。 方法 研究分为2部分,第一部分,利用LPS刺激单核巨噬细胞(RAW264.7),建立细胞脓毒症模型作为脓毒症小鼠的肝脏离体模型,在离体方面研究炎症反应的机制以及外源性一氧化碳释放分子(CORM-2)所释放的CO对该模型的干预作用;第二部分,应用盲肠结扎穿孔(CLP)的C57BL/6小鼠复制脓毒症的在体模型,将小鼠随机分为4组(具体例数根据检测指标而定):假手术组(sham)、CLP组、CLP+iCORM组、CLP+CORM-2组,以肝脏的形态学、功能、细胞因子以及JAK/STAT表达水平为指标探讨CLP小鼠早期肝脏炎症反应的部分分子机制,评价了外源性一氧化碳释放分子(CORM-2)所释放的CO对CLP小鼠早期肝脏炎症反应的抑制作用。 结果及结论 1.单核巨噬细胞炎症模型:LPS刺激后细胞损伤明显,活性下降;炎症因子IL-1β、TNF-α相关炎性蛋白表达明显增加,JAK/STAT活性也显著增高。外源性CO的干预组炎症的反应较对照组明显减轻,说明外源性CO能在一定程度抑制小鼠脓毒症离体模型的炎症反应。 ***小鼠脓毒症模型:术后24h小鼠肝脏炎症细胞浸润明显,血浆中IL-1β、TNF-α等指标明显上升,ICAM-1、JAK/STAT蛋白表达明显增加。外源性CO的直接干预可以明显改善肝脏组织肿胀程度,减少验证细胞的浸润,抑制炎性反应,有效维护细胞功能。 以上结果表明,外源性外源性一氧化碳释放分子能明显抑制JAKs分子磷酸化,继而抑制了JAK/STAT信号通路的活化,减少下游相关细胞因子的表达,有效防止严重感染时炎症反应的级联反应。证实了外源性一氧化碳的干预在一定程度上抑制了脓毒症早期肝脏炎症反应的发展。

关键词： 凋亡抑制因子6   核受体LXR   RAW264.7细胞   THP-1细胞  

摘要： 目的 凋亡抑制因子6(Apoptosis Inhibitor 6,Api6)也叫作AIM或Spα,是清道夫受体富含半胱氨酸残基家族新成员,在免疫反应、肿瘤发生中发挥着重要的作用;但作为清道夫受体,Api6在脂质代谢中的作用尚未得到深入研究。本研究选用人THP-1单核/巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞探讨①高脂、炎症状态下,两种巨噬细胞脂质蓄积情况;②高脂和/或炎症状态下,清道夫受体SR-A、CD36和Api6在两种巨噬细胞中的表达;③高脂和/或炎症状态下,核受体LXRalpha、LXRbeta表达与Api6表达的相关关系。 材料和方法 1.从人新鲜血浆中提取LDL,氧化制备成oxLDL;采用oxLDL刺激细胞建立高脂模型,采用脂多糖(LPS)刺激细胞建立炎症模型,油红O染色观察巨噬细胞脂质蓄积情况。 2.提取Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞mRNA,逆转录扩增获得Api6cDNA全长,构建入pCDNA3.1质粒中,获得可以表达Api6基因的质粒pCDNA3.1/Api6。 3.实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR)检测Api6、CD36、SR-A、LXRalpha、LXRbeta、ABCA1、ABCG1等基因在各种处理条件下,两种巨噬细胞中mRNA的表达水平。 结果 1.研究发现200 ng/ml的LPS和100μg/ml的oxLDL处理可以导致体外培养的两种巨噬细胞出现异常的脂质蓄积。 2.成功构建了pCDNA3.1/Api6质粒,并对RAW264.7巨噬细胞进行瞬时转染,使Api6表达上调了12500倍。 3.高脂情况下,清道夫受体SRA在RAW264.7细胞和THP-1细胞中的表达分别上调了6倍、2.5倍和6倍、44倍。但同样处理条件下,Api6在RAW264.7细胞的表达没有明显上调;而炎症和高脂同时存在时,Api6在THP-1细胞中的表达却上调了2.7倍。 4. LXR受体激动剂T0901317可以使RAW264.7细胞中LXR的靶基因ABCA1和ABCG1基因表达分别上调22倍和7倍;THP-1巨噬细胞中ABCA1和ABCG1基因表达均上调9倍;但LXR受体激动剂T0901317没有改变Api6在RAW264.7细胞中的表达,Api6在THP-1细胞中的表达则上调了2倍。Api6在各种处理条件下表达水平的变化趋势与LXRα的表达水平相关。 结论 200 ng/ml的LPS和100μg/ml的oxLDL处理可以导致体外培养的RAW264.7和THP-1细胞出现异常的脂质蓄积。炎症、高脂状态下,Api6的表达水平与核受体LXR受体α亚型的表达水平明显相关;由于缺乏LXRα受体,体外培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞Api6基础表达量较低,因此可以作为载体细胞,用以建立过表达Api6的细胞模型深入研究Api6在脂质代谢中的作用。

关键词： ApoE/SRA/CD36三敲小鼠   炎症   酪蛋白   炎症   脂代谢紊乱   组织损伤   纤维化   炎症   胆固醇   LDLr   ApoE/SRA/CD36三敲小鼠   纤维化  

摘要： 第一部分:ApoE/SRA/CD36三敲小鼠慢性炎症模型的建立 目的:采用酪蛋白刺激ApoE/SRA/CD36三敲小鼠建立炎症模型,模拟人体内低丰度慢性系统性炎症,并进行体内实验,探讨炎症状态下,脂质代谢的变化和组织损害及其分子机制。 方法:16只雄性ApoE/SRA/CD36三敲小鼠随机分为两组:对照组(n=8)和炎症组(n=8)。两组小鼠均喂食西方饮食(Western diet, TD88137,含21%脂肪和0.15%胆固醇)。对照组小鼠皮下注射0.5ml PBS,炎症组小鼠皮下注射相同量的酪蛋白,隔天注射一次,持续14周后,处死小鼠,收集血浆、肝脏、肾脏和主动脉组织。血浆离心去血清,检测其中炎症介质—小鼠血清淀粉样蛋白(serum amyloid A,SAA)和IL-6—的水平。 结果:与对照组小鼠相比,炎症组小鼠体内SAA和IL-6水平明显升高,分别为26.60±3.24ng/ml vs 14.35±1.73ng/ml(P<0.01),36.37±2.20pg/ml vs 18.02±4.87 pg/ml(P<0.01),差异有统计学意义。 结论:隔天小鼠皮下注射10%酪蛋白,持续14周,小鼠体内产生低丰度慢性系统性炎症,炎症模型建立成功。 第二部分:炎症致脂代谢紊乱及组织损害相关指标变化 目的:研究低丰度慢性系统性炎症状态下,ApoE/SRA/CD36三敲小鼠血清、肝脏、肾脏和主动脉脂质水平的变化,以及肝脏纤维化相关指标的水平,观察炎症致脂代谢紊乱和组织损害的程度。 方法:用试剂盒法测定血清脂质水平,包括总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。一部分肝脏、肾脏和主动脉组织包埋于OCT胶制作冰冻切片,一部分肝脏和肾脏组织经脱水、透明、浸蜡、包埋制成石蜡切片。用油红O法染色冰冻切片观察肝脏、肾脏和主动脉脂质沉积的情况;用酶法测定肝脏和肾脏组织中胆固醇的含量;测量并计算主动脉根部斑块总面积与血管周长的比例。用免疫组织化学染色法和Real Time PCR方法检测小鼠肝脏和肾脏组织中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、纤维连接蛋白(Fn)蛋白和mRNA的表达。 结果:①在脂代谢紊乱方面,血清脂质检测表明炎症组小鼠血清中TC、LDL和HDL水平降低,明显低于对照组小鼠,差异有统计学意义(P<0.05);油红O染色结果显示,炎症组小鼠肝脏、肾脏和主动脉斑块内有大量的红染颗粒,脂质沉积异常增多;细胞内胆固醇测定结果显示,相对于对照组,炎症组小鼠肝脏和肾脏组织中胆固醇含量显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);统计主动脉根部斑块面积与血管周长比例的数据表明,炎症组小鼠斑块面积和脂质含量都明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。②组织损害方面,HE染色显示肝脏和肾脏组织结构有病变;免疫组织化学染色观察炎症组小鼠肝脏和肾脏Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、Fn蛋白表达与对照组相比,没有明显增多,但Real Time PCR测定表明炎症组小鼠肝脏Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、Fn mRNA的表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论:低丰度慢性系统性炎症造成ApoE/SRA/CD36三敲小鼠体内脂质代谢紊乱,炎症组小鼠血脂水平降低,而肝脏、肾脏和主动脉脂质沉积加重,胆固醇在体内重新分布;炎症导致肝脏和肾脏组织损伤,可能启动了肝脏和肾脏纤维化病变。 第三部分:炎症对通过LDLr途径致胆固醇在体内重新分布和组织损伤的分子机制 目的:通过对低密度脂蛋白受体(LDL receptor, LDLr)途径中核转录因子胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)裂解激活蛋白(SCAP)、SREBP-2和LDLr蛋白和mRNA表达的检测,探究炎症致ApoE/SRA/CD36三敲小鼠体内胆固醇重新分布和组织损伤的分子机制。 方法:用Real Time-PCR法和Western Blot法分别检测肝脏和肾脏SCAP、SREBP-2及其下游基因LDLr mRNA和蛋白的表达水平。 结果:Real Time-PCR检测表明,与对照组小鼠相比,炎症组小鼠脂代谢相关基因LDLr、SREBP2和SCAP mRNA的表达分别增高了4.56倍、14.72倍、3.14倍,差异有统计学意义;Western Blot、免疫组化染色显示以上基因的蛋白质表达水平显著增加,与基因结果相符。 结论:证实了低丰度慢性系统性炎症上调LDLr、SREBP2和SCAP基因表达,并增加蛋白质的表达,使肝脏、肾脏和主动脉组织细胞通过LDLr途径从血清中摄入大量的胆固醇,致胆固醇在体内重新分布,这一过程还可能启动了肝脏

关键词： 多发伤   ω-3多不饱和脂肪酸   炎症   免疫   全身炎症反应综合症(SIRS)   多器官功能衰竭(MOF)  

摘要： 【目的】探讨ω-3多不饱和脂肪酸对严重多发伤患者伤后的炎症反应与免疫功能的调节作用,以及对患者预后的影响。 【方法】对2008年9月至2009年5月收治于我院创伤外科的损伤严重度评分(injury severity score, ISS)大于等于16分的42例严重多发伤患者,随机分为对照组(n=21)和尤文组(n=21),在治疗中尤文组患者每天加用100 ml的ω-3鱼油脂肪乳注射液,采用静脉输入持续7天,其他治疗与对照组相同。分别于伤后不同时间点监测每日最高体温、白细胞计数、肝功能、肾功能、凝血功能；并检测炎症反应指标TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、C反应蛋白及免疫功能指标CD4＼CD8比值和HLA-DR的表达；并记录患者的SIRS发生率、MOF发生率、ICU停留时间、总住院时间和死亡率,进行组间比较。 【结果】两组患者之间的炎症反应水平和免疫功能差异具有显著性意义(P<0.01,P<0.05),与对照组相比,尤文组的机体炎症反应水平明显降低、免疫功能得到改善,且尤文组患者的预后要优于对照组。 【结论】在严重多发伤患者的治疗中加用ω-3多不饱和脂肪酸,可对机体的炎症反应和免疫功能起到一定的调节作用,并对改善严重多发伤患者的预后具有一定帮助。

关键词： 心力衰竭   炎症   毛冬青  

摘要： 慢性心力衰竭(CHF)发生率呈快速增长趋势,严重地威胁人类健康。其中慢性炎症状态在CHF的发生、发展过程中发挥着重要作用,本文对毛冬青对慢性心衰炎症状态影响开展研究,探讨中医药防治CHF机理。 1.理论研究 目前,关于慢性炎症状态在CHF的发生、发展过程中发挥着重要作用引起许多学者的关注。基本的共识认为慢性心力衰竭也是一个炎症反应过程,而抗炎治疗成为治疗CHF重要途径之一。从临床表现而言,心力衰竭主要分属于中医的“喘证”、“水肿”、“心悸”等病证,其病机为本虚标实之证,以气虚阳虚为本,血瘀水停为标。治疗以益气温阳治本,活血利水治标为主要的治疗方法,在临床实践中具体应用方药很多,各有特色,均能取得良好的临床疗效。中药毛冬青具有清热解毒、活血通脉之功效。近年来许多学者开始认识到,中医治疗CHF不仅可以采用补气、活血、利水等方法,还可以针对CHF慢性炎症反应进行干预,现代药理研究表明其具有抗炎和多种心血管药理作用,结合以往临床研究基础,我们认为毛冬青可能通过其抗炎症作用改善CHF慢性炎症状态,从而改善CHF临床症状和预后。所以很有必要进行毛冬青干预慢性心力衰竭炎症状态的实验研究,这对于阐述“清热解毒”法在慢性心衰应用和进一步推广毛冬青用于治疗慢性心衰有重要的意义。 2.实验研究 目的：观察毛冬青对慢性心力衰竭炎症状态的影响,初步阐述“清热解毒”法的慢性心衰可能机理。 方法：雄性SD大鼠60只(体重为250±20g),进行随机分组,48个为手术组,12个为假手术组。手术组以腹主动脉缩窄法引起心脏后负荷加重而造成心衰模型,术后观察30天,造模成功的大鼠随机分为4组,分别为毛冬青-低剂量组、高剂量组,西药(卡托普利)对照组和空白对照组。毛冬青低剂量组灌服毛冬青10g/kg/d；毛冬青高剂量组灌服毛冬青20g/kg/d；西药对照组灌服卡托普利100mg/kg/d；空白对照组灌服生理盐水2ml/d：各组均灌服2周后,观察大鼠一般状况,测定心脏射血分数(心脏彩超),心功能(血压差),B型钠尿肽(BNP),C反应蛋白(CRP),肿瘤坏死因-a(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。 3.临床观察 收集10例慢性心力衰竭患者和10例心功能正常者,检验C反应蛋白(CRP),B型钠尿肽(BNP)等指标,以初步探讨慢性心衰与炎症指标的关系。 4.结果 (1)假手术组的心功能(EF,FS及BNP)明显优于空白对照组(P<0.01),提示造模成功。 (2)大鼠实验表明,毛冬青高剂量组、低剂量组和卡托普利组均能改善大鼠心功能,三组之间在EF值、FS值和BNP值的改变组间没有明显差别(P>0.05),说明三者之间疗效相似。通过与对照组比较发现,毛冬青高剂量组在改善EF值和FS值方面有优于低剂量组之趋势,低剂量组在改善BNP值方面有优于高剂量组之趋势。 (3)对大鼠血清的有关炎性指标进行检测,毛冬青低剂量治疗的大鼠CRP,TNF-α, IL-6, MCP-1与卡托普利组和假手术组无显著差异,也显著低于空白对照组,高剂量治疗的大鼠,尽管也见炎症指标显著下降,但不如低剂量组。 (4)临床观察发现慢性心衰病人的BNP与CRP均高于非心衰患者(P<0.05)。 结论： (1)对大鼠进行腹主动脉结扎可以成功造成慢性心衰的模型。 (2)毛冬青可以改善大鼠心功能。 (3)毛冬青可以改善慢性心衰大鼠的炎症状态,与卡托普利相似,以低剂量为优。 (4)慢性心衰患者存在着BNP与CRP升高的现象,慢性心衰存在炎症反应。

关键词： 人参皂苷Rb1   小檗碱   脂肪细胞炎症因子   表达   分泌   分子机制   比较  

摘要： 近年来2型糖尿病炎症学说备受关注,许多研究表明在2型糖尿病患者和肥胖的糖尿病动物模型中多种炎症因子和炎症标志物,例如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant-1,MCP-1)等的表达和分泌增加。这些表达和分泌增加的炎症因子和炎症标志物可以通过干扰正常的胰岛素信号转导途径,引起胰岛素抵抗,还可以直接损伤胰岛β细胞。脂肪不仅是储存能量的组织,也是重要的内分泌器官,是上述炎症因子产生的重要场所之一。因此,调节脂肪细胞炎症因子的表达和分泌有望成为治疗2型糖尿病,改善胰岛素抵抗的新手段。 补气药人参和清热药黄连是中医临床常用的治疗2型糖尿病的中药,常单独或配伍使用。虽然两味中药性味不同,功效迥异,但是都能发挥降糖、调脂,改善胰岛素抵抗等作用。深入研究它们对脂肪细胞炎症因子表达和分泌的作用及其分子机制的异同点,有助于我们深化对中药药性理论的认识,也为它们更好的被应用于临床提供理论基础和运用指导。 目的：运用体外培养3T3-L1脂肪细胞,观察人参皂苷Rb1和小檗碱对脂肪细胞炎症因子表达和分泌的作用及其作用的分子机制,并比较两者作用的异同点。 方法：1)将诱导分化成熟的脂肪细胞加或不加10ng/ml的TNF-α诱导24小时后,分别加入10umol/L的人参皂苷Rbl和小檗碱,干预12小时后提取RNA,逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR(QRTPCR)法检测人参皂苷Rb1与小檗碱对3T3-L1脂肪细胞TNF-α、IL-6、leptin、visfatin、MCP-1、脂联素mRNA表达水平的影响；或干预24小时后提取蛋白,蛋白免疫印迹(western blotting)法检测人参皂苷Rbl与小檗碱对3T3-L1脂肪细胞IKK-β、NF-κB P65蛋白的表达和IKK-β(ser181)磷酸化水平的作用；或干预24小时后,激光共聚焦显微镜下观察人参皂苷Rb1与小檗碱对3T3-L1脂肪细胞NF-κB P65蛋白向细胞核内转位的影响；2)将诱导分化成熟的脂肪细胞分别加入10umol/L的人参皂苷Rb1和小檗碱,干预24小时,留取细胞上清,酶联免疫吸附(ELISA)法检测人参皂苷Rbl与小檗碱对3T3-L1脂肪细胞TNF-α、IL-6和脂联素分泌的作用。 结果：1)10umol/L的小檗碱作用于3T3-L1脂肪细胞12小时降低TNF-α、IL-6、leptin和MCP-1 mRNA的表达,增加visfatin mRNA的表达,但没有增加脂联素的表达,而10umol/L的人参皂苷Rb1作用12小时降低TNF-α、MCP-1的表达,增加visfatin、leptin、脂联素mRNA的表达,对IL-6的表达没有明显的作用；2) 10ng/ml的TNF-α诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24小时引起TNF-α、IL-6、leptin、MCP-1的mRNA表达增加,visfatin和脂联素表达下降,加入10umol/L的小檗碱干预12小时后TNF-α、IL-6、leptin、MCP-1表达下降,visfatin mRNA的表达增加,脂联素的表达没有增加,而加入10umol/L的人参皂苷Rb1干预12小时后TNF-α和MCP-1 mRNA的表达下降,脂联素的表达增加,IL-6、leptin、visfatin mRNA的表达没有发生明显改变；3) 10umol/L的小檗碱作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24小时降低TNF-α、IL-6的分泌,没有增加脂联素的分泌；而10umol/L的人参皂苷Rb1作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24小时不仅降低TNF-α、IL-6的分泌,还显著增加了脂联素的分泌；4)蛋白免疫印迹结果显示10umol/L的小檗碱作用24小时能够降低基础和TNF-a诱导后3T3-L1脂肪细胞IKK-β(ser181)的磷酸化水平,但是没有改变IKK-β和NF-κB p65蛋白的表达；而10umol/L的人参皂苷Rb1作用24小时对基础和TNF-a干预后IKK-β、NF-κB p65蛋白的表达以及IKK-β(ser181)的磷酸化水平均没有明显的作用；5)激光共聚焦显微镜下观察到10ng/ml的TNF-α诱导24小时后3T3-L1脂肪细胞NF-κB P65蛋白向细胞核内的转位明显增加,用10umol/L的小檗碱干预24小时能抑制NF-κB P65蛋白向细胞核内的转位,而10umol/L的人参皂苷Rbl没有这一作用。 结论：1)小檗碱可能通过作用于IKK/NF-κB信号通路发挥调节炎症因子表达和分泌的作用；2)人参皂苷Rb1对

关键词： 角膜   碱烧伤   FK506   免疫炎症反应   T淋巴细胞  

摘要： 目的:研究他可莫司(FK506)滴眼液治疗大鼠角膜碱烧伤的药物有效浓度及给药方案,评价其抑制角膜碱烧伤后免疫炎症反应,改善角膜微环境的效能,并探讨其作用机制。 方法:NaOH滤纸片敷贴法制作大鼠角膜中度碱烧伤模型,96只wistar大鼠随机分为A、B、C、D四组,A、B、C组为治疗组,给予浓度0.05%、0.1%、0.5%FK506滴眼液治疗,4次/天,D组为阴性对照组。观察不同组别大鼠角膜透明性、基质融解程度以及新生血管形成情况。在不同时间点(第3,7,14,30d)处死大鼠取下角膜, HE染色分析角膜组织结构的变化,比较炎症细胞浸润程度的差异,免疫荧光法检测CD4/CD8阳性T细胞时空表达规律。 结果:碱液滤纸片烧伤角膜后,角膜雾状水肿,烧伤区角膜上皮缺失,基质融解形成溃疡,角膜缘血管扩张,后期形成新生血管,角膜失去透明性。FK506治疗组的角膜在溃疡形成面积,角膜混浊等级以角膜新生血管化程度方面均明显好于对照组。①.角膜融解定量分析结果:烧伤后3d,A、B、C组角膜融解面积分别为(3.14±0.25)mm2、(2.65±0.28) mm2、(2.27±0.47) mm2,而对照组D组为(4.06±0.41) mm2,差异有统计学意义(P<0.05),低浓度FK506治疗组与中、高浓度组相比亦存在统计学差异(P<0.05),而0.1%与0.5%浓度组之间则无明显差别(P>0.05); 7d时角膜融解面积缩小,分别为A组(1.82±0.51)mm2、B组(1.34±0.41) mm2、C组(0.90±0.39) mm2,与对照组D组(2.47±0.54) mm2,相比差异有统计学意义(P<0.05)。②.角膜混浊定量分析结果:治疗组在烧伤后角膜混浊评分低于对照组(P<0.05),其规律与角膜融解面积的变化曲线相一致,中高浓度组之间则无差异。③.角膜新生血管定量分析结果:治疗组在烧伤后3d角膜新生血管面积分别为A组(4.26±0.36)mm2、B组(3.88±0.33) mm2、C组(3.54±0.46) mm2均小于对照组D组(5.00±0.12) mm2,差异有显著意义(P<0.01),A与B、C比较也有统计学意义(P<0.05),而B与C比较无统计学意义(P>0.05);此种差异性保持至第14d方逐渐减小。烧伤角膜HE染色检查显示FK506治疗组基质中炎症细胞浸润的数量明显少于对照组,计数结果显示3d时,A组(77.67±4.51)个/0.04mm2、B组(51.33±3.21)个/0.04mm2、C组(41.67±3.06)个/0.04mm2,而同期对照组D组(97.00±6.25)个/0.04mm2,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光提示治疗组中CD4阳性细胞的数量少于对照组,通过光密度分析,低浓度治疗组为中等强度荧光,中高浓度治疗组为低荧光,而对照组则表现为弥漫性强荧光。在整个角膜碱烧伤病理过程中,CD8+ T淋巴细胞的表达情况,给药组与对照组对比未见明显差异。 结论:他可莫司(FK506)局部使用可明显下调角膜碱烧伤后T淋巴细胞介导的特异性免疫反应,同时也可间接减轻非特异性炎症反应,并且表现为浓度依赖性。FK506局部干预后可阻止角膜碱烧伤后基质融解程度,抑制角膜新生血管的生长,减轻角膜组织结构的破坏,改善角膜预后,从而为角膜碱烧伤急性期的治疗提供了新的免疫治疗模式。