关键词： Insig-1   siRNA   RAW264.7   Insig-1   RNAi   炎症   RAW264.7   脂代谢   Insig-1   RNA i   炎症   小鼠   脂代谢   非高密度脂蛋白胆固醇   冠心病   冠状动脉造影  

摘要： 第一部分小鼠Insig-1基因siRNA表达质粒的构建、鉴定 目的:构建针对小鼠Insig-1基因的siRNA表达质粒并鉴定其干扰效果。 方法:利用Ambion公司的siRNA在线设计软件,设计针对小鼠Insig-1基因的三个干扰片段和一个阴性对照片段,插入到pGenesil-1中构建Insig-1的干扰质粒,分别命名为pGen-Insig-1-1(si-1)、pGen-Insig-1-2(si-2)、pGen-Insig-1-3(si-3)及pGen-Insig-1-nc(si-nc)。酶切鉴定后送检测序。通过脂质体Lipofectamine 2000将上述质粒分别瞬时转染小鼠RAW264.7细胞,利用反转录PCR技术(RT-PCR)和western blot鉴定干扰效果,筛选出干扰作用最强的Insig-1表达质粒。 结果:测序结果显示重组质粒中的插入序列与设计的寡核苷酸序列完全一致,表明已成功构建了针对Insig-1基因的siRNA表达质粒。经RT-PCR和western blot鉴定,构建的三个干扰质粒均能不同程度的抑制Insig-1基因表达,其中pGen-Insig-1-2干扰效果最强。 结论:成功构建了针对Insig-1基因的3个siRNA表达质粒,并鉴定出沉默效果最强的干扰质粒 第二部分Insig-1基因沉默对炎症状态下RAW264.7小鼠巨噬细胞脂质代谢的影响 目的:观察RNAi沉默Insig-1基因对炎症状态下小鼠巨噬细胞RAW264.7脂质代谢的影响。 方法:RAW264.7细胞接种于24孔板24小时,利用脂质体转染干扰载体pGen-Insig-1-2和pGen-Insig-1-nc,24小时后经G418筛选14天获得稳定转染细胞株。RT-PCR、western blot和免疫细胞化学鉴定稳定干扰株Insig-1的表达。不同浓度LDL和LPS负荷细胞下,western blot检测LDLr蛋白的表达,以确定LDL和LPS后续处理细胞的浓度。以筛选浓度的LDL和LPS共同刺激pGen-Insig-1-2/RAW264.7细胞和pGen-Insig-1-nc/RAW264.7细胞(以未转染RAW264.7细胞作阴性对照),利用酶学方法检测细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的水平;油红O染色观察细胞内脂质积聚情况;提取细胞总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和western blot检测Insig-1、SCAP、SREBP-2和LDLr的mRNA和蛋白表达水平。 结果:干扰载体转染RAW264.7,经G418筛选后得到稳定干扰株,分别命名为pGen-Insig-1-2/RAW264.7细胞和pGen-Insig-1-nc /RAW264.7细胞,经RT-PCR、western blot和免疫细胞化学结果证实pGen-Insig-1-2/RAW264.7稳定干扰株内Insig-1mRNA和蛋白表达较pGen-Insig-1-nc/RAW264.7和未转染RAW264.7细胞显著降低(P<0.05)。通过LDLr的蛋白表达筛选出处理细胞的LDL和LPS浓度分别为50μg/ml和200ng/ml。油红O染色结果显示当负荷50μg /mlLDL+200ng/ml LPS时,RAW264.7细胞内红染脂滴与未加高脂和炎症处理的RAW264.7细胞(空白对照)相比显著增多(P<0.05);经同样条件刺激, pGen-Insig-1-2/ RAW264.7细胞内红染脂滴与未转染RAW264.7细胞(阴性对照)相比显著增多;pGen-Insig-1-nc/RAW264.7细胞内红染脂滴与未转染RAW264.7细胞(阴性对照)无明显差异。胆固醇含量变化与油红O结果一致。RT-PCR、western blot显示50μg/ml LDL+200ng/ml LPS处理的RAW264.7细胞与未加高脂和炎症处理的RAW264.7细胞(空白对照)相比,SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05);经同样条件刺激, pGen-Insig-1-2/ RAW264.7细胞SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA和蛋白的表达较未转染RAW264.7细胞(阴性对照)明显增加(P<0.05);pGen-Insig-1-nc/ RAW264.7细胞SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA和蛋白的表达与未转染RAW264.7细胞无明显差异(P>0.05)。 结论: Insig-1基因沉默增强了炎症状态下RAW264.7小鼠巨噬细胞SCAP、SREBP-2、LDLr mRNA和蛋白表达,促进了小鼠巨噬细胞胆固醇的摄取,细胞脂

关键词： 哮喘   中性粒细胞   脂多糖类   小鼠   Th17细胞   转录因子   地塞米松  

摘要： 支气管哮喘是多种炎性细胞参与的慢性气道炎症,T淋巴细胞在其中发挥着重要的免疫调节作用。Th2占优势的Th1/Th2失衡被认为是哮喘发病的一个重要的免疫学机制。Th2细胞分泌IL-4、IL-13、IL-5等细胞因子促进IgE的产生及嗜酸细胞的分化,从而导致了嗜酸细胞性哮喘的发病。但是我们课题组前期研究结果显示有49.37%的哮喘患儿为非嗜酸细胞性哮喘,其中又有半数以上的患儿气道为中性粒细胞性炎症。因此用Th1/Th2失衡理论不能完全解释这部分哮喘的发病机制。 Th17细胞是一类新的CD4+T细胞亚群,能够特异性地产生细胞因子IL-17;并且具有特异性转录因子核孤儿受体γt (RORγt),诱导Th17细胞的产生及分化。IL-17具有强大的招募中性粒细胞的作用。 近来研究表明,Th17细胞可能与哮喘相关。我们假设不同的哮喘亚型存在不同的免疫学机制:Th2细胞介导了嗜酸细胞性哮喘气道炎症的发生,Th17细胞则介导了中性粒细胞性哮喘气道炎症的发生。但迄今为止,相关的研究鲜见报道,并且在Th17细胞与哮喘的研究中,多采用传统的嗜酸细胞性哮喘动物模型。因此本研究通过建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型,并以嗜酸细胞性哮喘小鼠模型作为对照,探讨Th17细胞在中性粒细胞性哮喘发病中的作用及作用机制,并且应用地塞米松干预探讨糖皮质激素对中性粒细胞性哮喘气道炎症的作用及作用机制。研究的完成将初步阐明Th17细胞在中性粒细胞性哮喘发病中的作用及可能的分子机制,为中性粒细胞性哮喘的早期干预寻找新的作用靶点。研究分四部分进行。 目的制作中性粒细胞性哮喘小鼠模型,为后续研究建立基础。 方法BALB/c小鼠36只,随机分为3组:正常对照组(NC组)、嗜酸细胞性哮喘模型对照组(EA组)和中性粒细胞性哮喘模型组(NA组),每组12只。常规方法建立嗜酸细胞性哮喘模型。中性粒细胞性哮喘模型制作:实验第0天、7天和14天在小鼠麻醉后用10μg脂多糖(LPS)鼻内滴入及腹腔内注入50μg卵白蛋白(OVA)联合致敏,从实验第21天起,用5%OVA溶液雾化吸入2周进行激发。正常对照组:用PBS致敏,生理盐水激发。观察小鼠哮喘发作症状,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及分类计数,肺组织HE染色观察气道病理学变化。 结果两组哮喘模型小鼠在激发过程中均出现烦躁不安、呼吸急促、弓背直立、前肢缩抬、大小便失禁等表现。NC组则无此表现。EA组及NA组小鼠BALF中细胞总数、EOS比例、NEU比例均明显高于NC组(均P<0.01);与EA组相比,NA组小鼠NEU比例明显升高,BALF中细胞总数、EOS比例则明显降低(均P<0.01)。肺组织病理学改变:EA组支气管壁增厚,粘膜上皮杯状细胞增生,支气管及肺血管周围见以嗜酸细胞为主的大量炎症细胞浸润。NA组小鼠细支气管周围除嗜酸细胞外,还可见较多中性粒细胞、淋巴细胞在气道粘膜下浸润,支气管壁增厚。结论通过LPS及OVA联合致敏的方法,成功建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型。 目的探讨中性粒细胞性哮喘发病可能的免疫学机制。 方法相同方法建立嗜酸细胞性哮喘和中性粒细胞性哮喘小鼠模型。ELISA方法检测小鼠BALF中IL-17A、IL-4、IFN-γ水平;制备小鼠脾脏及肺脏单细胞悬液,流式细胞技术检测Th1、Th2、Th17细胞占CD4+CD8-T淋巴细胞比例,并进行相关分析。 结果NA组小鼠BALF中IL-17A水平明显高于NC组及EA组(均P<0.01)。EA组及NA组小鼠BALF中IL-4水平均明显高于NC组(分别P<0.01,P<0.05),但两组间比较无显著性差异(P>0.05)。EA组及NA组小鼠BALF中IFN-γ水平均明显低于NC组(分别P<0.01,P<0.05),但两组间比较无显著性差异(P>0.05)。与NC组相比,NA组小鼠脾脏及肺脏中Th17细胞比例、Th2细胞比例明显升高,Th1细胞比例明显下降(均P<0.01);与EA组相比,NA组小鼠脾脏及肺脏中Th17细胞比例、肺脏Th1细胞比例明显升高(均P<0.01),脾脏Th1细胞比例、肺脏Th2细胞比例明显下降(均P<0.01),脾脏Th2细胞比例无显著性差异(P>0.05)。与NC组相比,EA组小鼠脾脏及肺脏中Th2细胞、Th17细胞比例明显升高,Th1细胞比例明显降低(分别P<0.01,P<0.05,P<0.01)。小鼠肺脏中Th17细胞比例、BALF IL-17A水平均与BALF中NEU比例呈正相关;Th2细胞比例、IL-4水平均与EOS比例呈正相关;Th1细胞比例、IFN-γ水平均与EOS比例呈负相关;Th2细胞比例还与NEU比例呈正相关。 结论Th17细胞可能介导了哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的发生,并通过IL-17发挥作用。 目的探讨Th17细胞参与中性粒细胞性

关键词： 慢性肾脏病   肾炎康复片   阿霉素肾病   炎症   p38MAPK信号通路  

摘要： [背景／目的]本文分为3部分。首先,我们综述了肾炎康复片治疗慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)的研究概况。肾炎康复片是中药复方制剂,具有健脾补肾、清化湿热、活血化瘀等功效。在肾脏病领域,国内有关肾炎康复片临床药效学的研究主要是针对慢性肾小球肾炎、肾病综合征、IgA肾病、糖尿病肾病、慢性肾功能不全等常见的原发和继发性CKD。其临床疗效主要表现在改善相应疾病的临床症状,减少蛋白尿、血尿,还可以改善肾功能。肾炎康复片治疗CKD的药理作用包括“抑制免疫反应、减轻炎症损伤、延缓肾纤维化、保护足细胞和肾小管上皮细胞”等。其次,我们总结了CKD肾组织炎症信号通路p38MAPK的调节机制及中药的干预作用。肾组织的炎症反应及其相关的组织损伤(如肾小球硬化和肾间质纤维化)是导致CKD进展至终末期肾病的重要因素。p38MAPK信号通路能够调控多种核转录因子的表达和生物活性,还可以影响多种下游炎症介质的合成,并参与炎症细胞的活化,在肾脏疾病炎症损伤中发挥着重要的作用。研究表明,某些单味中药及其提取物以及一些中药复方可以通过调节p38MAPK信号通路而影响肾组织内炎症反应,从而,减轻肾组织炎症损伤。最后,作为本文的重点,我们报道了肾炎康复片调节肾组织p38MAPK信号通路而改善阿霉素肾病(Adriamycin-induced nephropathy, ADRN)模型肾组织炎症损伤的分子机制。我们借助单侧肾切除并2次静脉注射阿霉素(Adriamycin, ADR)的方法,建立ADRN模型,观察肾炎康复片对肾组织炎症信号通路p38MAPK的干预作用,试图在体内阐明肾炎康复片通过调节p38MAPK信号通路,减少肾小球内转化生长因子(Transforming growth factor, TGF)-β1的表达和巨噬细胞(Macrophage, MΦ)的浸润,改善肾组织炎症损伤的分子机制。 [方法]将19只SD大鼠按随机数字表方法分为假手术组、对照组和肾炎康复片组。对肾炎康复片组和对照组大鼠行右侧肾摘除术,并在4周内经静脉2次注射阿霉素(4或2mg·kg-1),建立ADRN模型。第2次注射ADR后,肾炎康复片组人鼠经口灌胃肾炎康复片1.2g·kg-1·d-1,并同时以蒸馏水干预对照组,共干预4周。术后每周称量大鼠体重,并检测24h尿蛋白排泄量。术后第4周末处死大鼠,抽取血液,摘除左肾并称重,观察肾小球内巨噬细胞ED1+、ED3+浸润、足细胞及滤过膜超微结构、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原表达(Collagen typeⅠ)以及肾小球形态特征、血清生化指标等,并且,借助Western blotting检测肾组织内TGF-β1、磷酸化p38MAPKC Phosphoryl ated p38MAPK, p-p38MAPK)的蛋白表达。 [结果]肾炎康复片减少了肾小球内巨噬细胞ED1+、ED3+浸润,下调了模型鼠肾组织内TGF-β1和p-p38MAPK蛋白表达,抑制了模型鼠系膜细胞(Mesangial cell, MC)增殖、细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)和胶原(Collagen typeⅠ)沉积,减轻了α-SMA、Ⅰ型胶原表达,同时,还改善了模型鼠的蛋白尿和血清白蛋白(Albumin, Alb),但是,对血清尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)和血清肌酐(Serum creatinine, Scr)没有影响。 [结论]肾炎康复片在体内具有减轻肾组织炎症损伤的作用；肾炎康复片通过下调肾组织p38MAPK信号通路中关键信号分子——p-p38MAPK的蛋白表达,干预p38MAPK信号通路的信号转导,减少肾小球内TGF-β1的表达和巨噬细胞的浸润,从而,改善肾组织的炎症损伤。

关键词： IRS-1Gly972Arg基因多态性   胰岛素抵抗   内皮功能受损   原发性高血压   G972R IRS-1突变   高血压   卡托普利   罗格列酮   ET-1/eNOs   CXCR2mRNA  

摘要： 目的：研究湖南长株潭地区汉族人群中IRS-1Gly972Arg基因多态性与原发性高血压、胰岛素抵抗与内皮功能受损相互之间作用的关系。 研究方法：选取湖南省长株潭地区510名经确诊的原发性高血压和胰岛素抵抗患者及520名健康对照者。其中单纯高血压患者184例,单纯胰岛素抵抗患者178例,高血压合并胰岛素抵抗患者145例,均为汉族人群。健康对照组选自于高血压或胰岛素抵抗患者同一地区的无血缘关系的群体,无高血压、糖尿病病史及家族史(计520例,其中男性271例,女性249例)。测量对象一般指标(如BMI、腰臀比、血压、血糖、血脂、肝肾功能等),并进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)评估受试者的胰岛素抵抗情况,使用HP Sonos5500彩色超声系统检测受试者肱动脉介导的血管舒张水平(FMD)。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对受试者IRS-1Gly972Arg基因多态性进行基因分型。 结果：IRS-1Gly972Arg基因多态性符合Hardy-Weinberg平衡定律。IRS-1基因Gly972Arg多态性的突变率(即G/A基因型频率)：原发性高血压患者中发现9例突变携带者(9/329),占2.7%,血压正常受试者中发现10例突变携带者(10/701),占1.4%;胰岛素抵抗患者中发现7例突变携带者(10/326),占2.1%,正常糖耐量受试者中发现12名突变携带者(12/704),占1.7%。尽管高血压组该基因突变率略高于血压正常组,胰岛素抵抗组略高于糖耐量正常组,但差异没有统计学意义。Logistic回归分析显示,经基因分型、胰岛素抵抗指数、高血压分级、吸烟、饮酒、年龄、性别、高血压家族史、血脂水平调整后,只有原发性高血压分级水平才是内皮功能受损的独立危险因素IRS-1Gly972Arg基因多态性、胰岛素抵抗以及两者之间的交互作用与内皮功能受损无明显相关性。 结论：高血压水平分级是内皮功能受损的独立危险因素,胰岛素抵抗、IRS-1Gly972Arg基因多态性,以及两者之间的交互作用与内皮功能受损无明显相关性。 目的：初步探讨IRS-1G972R变异致人群血管内皮功能受损的机制。 方法：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对受试者IRS-1Gly972Arg基因多态性进行基因分型。使用HP Sonos5500彩色超声系统检测受试者肱动脉介导的血管舒张水平(FMD)。ELISA法测定血清ET-1, eNos, IL-8和ICAM-1水平。外周血单个核细胞CXCR2mRNA表达水平通过Real-time PCR测定。数据进行多因素方差分析。 结果：在1030例受试者中,G972R IRS-1等位基因突变频率为11.1%。IRS-1G972R基因多态性与内皮功能受损之间无明显的统计学差异。内皮功能受损与高血压及血浆ET-1/eNOS水平明显相关。然而,在高血压受试者中,G972R IRS-1突变者其血浆ET-1/eNOS水平显著高于Gly/Gly纯合子携带者。在胰岛素抵抗的受试对象中,与Gly/Gly纯合子携带者相比,G972R IRS-1突变者血清IL-8和ICAM-1水平和单核细胞CXCR2mRNA表达水平显著升高。 结论：本研究显示,内皮功能受损的主效应因素是高血压,而不是IRS-1G972R多态性。然而,在高血压的受试者中,G972R IRS-1突变进一步增加了血清ET-1/eNOS水平, ET-1/eNOS水平与内皮功能状态密切相关;同时,在胰岛素抵抗的受试者中,G972R IRS-1突变促进了炎症反应,而炎症反应是内皮功能受损的另一个重要因素。总之,本研究结果显示,在内皮功能受损的进展中,IRS-1G972R突变与高血压之间存在交互作用;在炎症反应中,IRS-1G972R突变与胰岛素抵抗之间存在交互作用。 目的：探讨IRS-1Gly972Arg基因多态性对于高血压或胰岛素抵抗受试者采用卡托普利和罗格列酮治疗后相关指标变化值的影响。 方法：随机选取HBP,IR,HBP+IR和正常组各20例,每组按G/A基因型不同各分配10例。合并高血压组40名受试对象口服卡托普利,疗程一个月,每日25mg,比较治疗前后ET-1/eNOS表达水平变化;血浆合并胰岛素抵抗者口服罗格列酮,疗程2个月,每日4mg,比较治疗前后PBMC CXCR2mRNA表达水平变化。 结果：服用卡托普利1月后各小组的ET-1/eNOS表达水平较未服药前降低,治疗前后ET-1/eNOS变化的绝对值水平在A等位基因受试人群中高于G等位基因的受试者。但对卡托普利降低其外周血浆ET-1/eNOs表达水平的效果采用协方差分析并未得出统计学意义。协方差分析还提示,是否合并胰岛素抵抗以及等位基因类型对高血压受试者卡托普利服

关键词： 低热量饮食   男性患者   代谢参数   低碳水化合物饮食   性欲   受试者   型糖尿病   炎症标志物   高蛋白   血糖水平   全身炎症  

摘要： 要点●2型糖尿病肥胖男性患者,采用低热量饮食快速减肥后,其性功能获得显著改善。●采用低热量饮食、替代饮食(流质)或高蛋白-低碳水化合物饮食,受试者的代谢参数,包括血糖水平、胰岛素敏感性和血脂水平,也获得相应的改善。澳大利亚的一项小型临床研究结果表明,2型糖尿病肥胖男性患者在采用低热量饮食快速减肥后,其性功能获得显著改善。

摘要： Scope and Method of Study. The Gastro Intestinal (GI) tract represents the largest mucosal surface in the body responsible for digestion, absorption of essential nutrients and protection against various pathogens entering through GI tract. Dendritic cells (DCs) in the GI tract plays major role in gut immune response through capturing and transferring antigens to T-cells and releasing cytokines. Although several cytokines produced by DCs are involved in gut immunity, IL-23 is involved in the defense against most pathogens in the GI tract through up-regulation of defensins. Previous report from our lab showed that the extracts from edible mushroom enhance α-defensin production in in-vitro cell line The aim of this study was to investigate effect of white button (WM) and portabello (PM) mushrooms on IL-23 secretion both in-vitro and in-vivo models. We also assessed the side effects of these mushrooms by using histopathology. We used C57B6 mice for studying IL-23 secretion and toxicological evaluation. We used 3% DSS to induce acute inflammation because DSS induced inflammation is localized to the GI tract rather than systemic inflammatory response. Moreover, we are interested to study the effect of mushrooms on intestinal dendritic cell response. We also used J.744.1 a mouse monocytic cell line to study the molecular mechanism by which edible mushrooms up-regulate IL-23 secretion. We used spleen cell culture for ex-vivo cytokine secretion assay. Cytokines were measured by using ELISA. Findings and Conclusions. In DSS untreated mice, the plasma IL-23, IL-6 levels were low compared to DSS treated mice. All the mice fed with mushroom diets for six weeks showed an increase in the plasma IL-23, IL-6, colon MPO, colon IL-6, and inflammation score when they challenged with 3% DSS. Although all mushroom up-regulates IL-23, PM up-regulates IL-23 secretion on the 3rd of day of in-vitro treatment and mice without DSS challenge unlike other mushrooms. Data suggest that mushroom co

关键词： 血管生成素-1   内皮祖细胞   内皮损伤   动脉粥样硬化   NF-kB蛋白表达  

摘要： 内皮损伤和炎症是动脉粥样硬化的主要特点。修复内皮细胞功能已成为防治动脉粥样硬化的靶点。我们在前期研究中发现：诱导大鼠的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)炎症时，经下调EPC中ABIN-2蛋白的表达，Ang-1对炎症反应的抑制作用消失。ABIN-2蛋白是NF-kB内源性抑制物，能够抑制NF-kB的活性，而在调节炎症反应的信号通路中，NF-kB信号途径被认为是经典的一条途径。那么Ang-1调节炎症反应是否通过抑制NF-kB发挥作用?为此，我们使用NF-kB特异性抑制剂抑制其活性，通过观察NF-kB失活后Ang-1对炎症反应的作用，论证NF-kB信号传导通路在Ang-1干预内皮祖细胞炎症反应中的作用。　　 实验采用TNF-a诱导EPC炎症反应，以慢病毒为载体将Ang-1导入EPCs中，使用特异性抑制剂PDTC抑制NF-κB，通过Western blotting检测EPC细胞中Ang-1蛋白和NF-kB蛋白的表达情况。随后采用荧光定量PCR、ELISA方法检测各组EPC细胞中粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达水平。　　 实验结果提示：转染Ang-1基因EPC细胞中能够成功表达Ang-1蛋白，而经PDTC抑制后NF-κB蛋白未见明显表达。荧光定量PCR、ELISA证实在mRNA水平和蛋白水平上PDTC处理后可明显抑制TNF-a诱导的ICAM-1和VCAM-1的表达，携带Ang-1基因的慢病毒组也出现同样结果。而经PDTC处理后，Ang-1诱导ICAM-1和VCAM-1的作用被抑制了。　　 实验结论：Ang-1可能通过NF-kB信号传导通路影响TNF-a诱导的内皮祖细胞的炎症反应。

关键词： 胃肠肿瘤   限制性液体治疗   免疫功能   术后并发症   炎症反应  

摘要： 第一部分限制性液体治疗对老年患者腹部外科术后并发症发生率的影响　　目的:探讨限制性液体治疗对胆道手术后并发症发生率的影响。　　方法:前瞻性分析2006年10月至2008年3月南京军区南京总医院收治的168例接受腹部外科胆道手术患者的临床资料。所有患者于术前随机分成限制性液体治疗组（85例）和常规液体治疗组（83例）。观察两组补液量的差异，比较两组术后全身并发症发生率、腹部并发症发生率、总体并发症发生率、肠功能恢复时间、住院时间、病死率的差异。采用x2检验、t检验及Fisher确切概率法对数据进行分析。　　结果:限制性液体治疗组和常规液体治疗组术中静脉补液总量的中位值分别为1450ml和2420ml，两组比较，差异有统计学意义(t=-5.067，p＜0.05)。限制性液体治疗组静脉晶体补充量中位值为850ml，显著少于常规液体治疗组的1500ml（t=-15.190，P＜0.05）。限制性液体治疗组全身并发症发生率和术后总体并发症发生率分别为9％(8/85)和19％(16/85)，低于常规液体治疗组的22％(18/83)和30％(25/83)。全身并发症发生率两组比较，差异有统计学意义(x2=4.873，P＜0.05)。限制性液体治疗组肠功能恢复平均时间和住院时间分别为为2d和9d，显著短于常规液体治疗组的4d和12d（t=-8.102，-2.003，P＜0.05）。限制性液体治疗组和常规液体治疗组病死率分别为2％(2/85)和4％(3/83)，两组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。　　结论:限制性液体治疗降低了胆道手术后并发症的发生率，缩短住院时间，促进患者的术后恢复。　　第二部分限制性液体治疗对老年患者腹部外科术后免疫炎症反应的影响　　目的:观察限制性液体治疗对老年患者胃肠肿瘤术后免疫炎症反应的影响，探讨影响术后并发症发生率的机制。　　方法:自2009年5月至2010年10月，前瞻性分析因胃肠肿瘤接受手术治疗的老年患者的临床资料（179例）。所有患者被随机分为限制性液体治疗组（93例）和传统液体治疗组(86例)。观察两组补液量的差异，记录术后并发症发生率、肠功能恢复时间、住院时间、病死率，分别于术前一天(Pre-op)、术后第一天(POD1)、术后第二天(POD2)、术后第三天(POD3)、术后第五天(POD5)用流式细胞仪测定T细胞亚群、HLA-DR，并测定白细胞计数、中性粒细胞计数、CRP。比较两组静脉补液量、术后并发症发生率、肠功能恢复时间、住院时间及病死率差异，并用SPSS16.0软件行多因素分析观察T细胞亚群、HLA-DR同术后并发症发生率关系。　　结果:限制性液体治疗方案能显著减少围术期补液量。两组术后CD3+T细胞计数较术前显著下降，但限制性液体治疗组计数高于传统液体治疗组(R vsS;POD2,746 vs480ce11/μl, P=0.022;POD3,878 vs502ce11/μl,P=0.005;POD5,892vs674ce11/μl，P=0.042)。两组术后单核细胞HLA-DR表达较术前明显下降，但限制性液体治疗组表达高于传统液体治疗组(R vs S;POD1，66.20 vs51.97％，P=0.029;POD2,68.19 vs51.26％, P=0.039;POD3,72.19 vs57.45％, P=0.014;POD5,73.92 vs60.46％，P=0.036)。多元分析提示术后CD3+T细胞计数同术后并发症发生率相关complication(odds ratio=1.963,[95％ CI],1.019-3.782, P=0.044), and also thecomplications of infection(odds ratio=3.106,[95％CI],1.302-7.406, P=0.011).　　结论:围术期限制性液体治疗能降低老年患者腹部外科术后细胞免疫功能的抑制，限制性液体治疗能通过改善患者术后细胞免疫功能降低术后并发症发生率。

关键词： 张应力   炎症状态   成骨细胞   正畸治疗  

摘要： 目前正畸治疗过程中由于口腔卫生不佳患牙龈炎甚至牙周炎的人数在不断的增多。同时牙周炎常造成牙齿的松动和移位，需要通过牙周和正畸联合治疗以恢复牙齿的正常功能和美观。如何才能实现静止状态下牙周炎患牙安全有效的正畸治疗成为正畸医生极为关注的问题。　　 LPS是Gˉ细菌细胞壁的主要成分，对牙周组织有很强的毒性和抗原性，是牙周致病菌重要的毒力因子。研究表明，LPS刺激单核巨噬细胞后释放多种炎症因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，可导致骨吸收。作为一种即刻早期基因，原癌基因c-fos在受到外界刺激时可快速激活和表达升高，而牙周组织中c-fos的检出提示它与成骨细胞、破骨细胞及成纤维细胞的功能活动存在紧密联系。近年c-fos在应力作用下的表达也逐渐受到重视，赵志河等的研究中表明，成骨细胞中c-fos的上调与力的加载持续时间有关，并且与细胞骨架的改变有密切联系。　　 本研究拟通过建立炎性刺激下的成骨细胞模型---PgLPS刺激RAW264.7的培养上清作用于小鼠成骨细胞系MC3T3-E1，并进一步研究张应力对炎性刺激下成骨细胞c-fos的影响，以进一步探讨牙周炎症状态下正畸力作用下骨改建的影响。其中炎性刺激下的成骨细胞模型的建立已由课题组成员协助师姐完成。　　 本论文由三部分组成：　　 第一部分：PgLPS刺激RAW264.7的炎性上清对成骨细胞增殖活性的影响　　 目的：观察经脂多糖(PgLPS)刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖活性的影响。　　 方法：收集经100ng/mlPgLPS刺激的RAW264.7培养上清，以不同稀释浓度(0％，10％，20％...100％)的培养上清作用于MC3T3-E124h，48h后，用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性，采用SPSS17.0进行统计学分析。　　 结果：MC3T3-E1经不同稀释浓度的培养上清刺激后，MC3T3-E1增殖活性受到抑制，且与培养上清呈浓度及时间依赖性。　　 结论：PgLPS刺激的RAW264.7培养上清可抑制MC3T3-E1的增殖。　　 第二部分：PgLPS刺激RAW264.7的炎性上清对成骨细胞c-fos及ALP表达的影响　　 目的：研究经牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P．g)脂多糖(LPS)刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)c-fos表达的影响。　　 方法：收集100ng/m1的PgLPS刺激RAW264.724h后的上清液，以20％稀释浓度分别作用于MC3T3-E1，分别在1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h时，采用RT-PCR和Westernblot检测ALPmRNA、c-fosmRNA及蛋白表达水平的变化。　　 结果：PgLPS刺激RAW264.7细胞培养上清作用于MC3T3-E1后，ALPmRNA表达均下降，在6h时表达最低，而c-fos的mRNA和蛋白水平均提高，分别在3h和6h时达最高水平。　　 结论：PgLPS刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清可通过上调成骨细胞c-fos的表达而抑制其成骨能力。　　 第三部分：张应力对炎性刺激下成骨细胞c-fos及ALP表达的影响　　 目的：研究不同强度的循环单轴张应力对炎性刺激下小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)立早基因c-fos表达的影响。　　 方法：分别对前期实验培养的炎性与非炎性状态下的成骨细胞MC3T3-E1施加0.5HZ．1000ustrain和3000ustrain的循环单轴张应力各5min、15min、30min、1h、3h、6h，用Real-TimePCR和westernblot分别检测c-fosmRNA及蛋白表达水平的变化，用ALP试剂盒检测细胞活性的变化。　　 结果：施加两种不同强度的张应力后，非炎性与炎性状态下的MC3T3-E1细胞c-fosmRNA和蛋白相对表达水平都随应力加载的持续时间逐渐升高，前者3h时达到最高点，之后逐渐下降，而后者1h即达到最高，之后逐渐下降，并在6h又再次升高：不同强度的张应力作用于同种状态下的成骨细胞，其c-fosmRNA和蛋白相对表达水平无显著差异。两种状态下的成骨细胞受力后其ALP活性明显降低(P＜0.05)。　　 结论：不同强度的循环单轴张应力，作用于炎性状态下的成骨细胞，可通过上调c-fos的表达而抑制其成骨及分化功能。

关键词： 溃疡性结肠炎   间充质干细胞   免疫炎症反应   动物模型   病理组织学   血清细胞因子  

摘要： 目的：通过观察溃疡性结肠炎( ulcerative colitis，UC)小鼠模型在经过骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治疗前后结肠的病理组织学改变及血清细胞因子、生物酶等检测指标的变化，探讨溃疡性结肠炎的免疫病理机制，研究骨髓间充质干细胞对溃疡性结肠炎炎症损伤的治疗修复情况，从而为利用细胞生物手段治疗溃疡性结肠炎提供实验室依据。　　 方法：　　 1.研究对象　　 来源于增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)小鼠骨髓的间充质干细胞(MSCs);7-8周龄C57BL/6小鼠54只平均分成三组，分别为正常对照组、实验性溃疡性结肠炎模型组、静注骨髓间充质干细胞的溃疡性结肠炎治疗组。　　 2.实验方法　　 对培养的间充质干细胞使用流式细胞仪进行表型测定筛选Flkl阳性的MSCs。采用三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)灌肠的方法以7-8周龄C57BL/6小鼠作为研究对象，制作溃疡性结肠炎小鼠实验模型，给实验性溃疡性结肠炎小鼠模型经尾静脉注入培养的Flkl阳性的MSCs制作溃疡性结肠炎治疗模型，分别于不同的时间第1、4、8、12、18、25天处死小鼠，取三组小鼠结肠组织经HE染色后对比观察各自结肠组织的病理学变化;使用免疫组化的方法检测骨髓间充质干细胞在小鼠结肠的定植分布情况及其对炎症损伤的治疗修复作用;用混合淋巴细胞反应实验检测三组T细胞的功能变化;使用酶联免疫吸附实验检测三组小鼠血清细胞因子的变化;使用生化分析仪检测三组小鼠生化指标的变化。　　 结果：光镜下UC小鼠结肠组织腺体排列紊乱，基底膜断裂或消失;各种炎症性细胞浸润;隐窝脓肿形成;粘膜下水肿及纤维化。经尾静脉输注EGFP小鼠的MSCs到实验性溃疡性结肠炎模型小鼠体内后，小鼠的结肠组织炎症损伤明显减轻，炎症细胞浸润减少，可以检测到MSCs在模型组小鼠结肠的定植并分化为肠上皮细胞，对结肠的炎症损伤有明显的修复作用。UC小鼠T细胞活性明显高于对照组与MSCs治疗组，血清细胞因子IL-iβ、IL-6、TNF-a水平上升，IL-10水平下降。MPO、NOS活性升高，NO含量升高，SOD活性降低。经MSCs治疗后血清细胞因子及生物酶学指标均有所改善。　　 结论：溃疡性结肠炎发病机理可能为抗原的刺激致免疫调节紊乱，表现为免疫炎症反应的过度亢进和难于自限。T细胞免疫功能异常，血清细胞因子IL-iβ、IL-6、TNF-a水平升高， IL-10水平降低。MSCs对小鼠溃疡性结肠炎模型损伤有明显的修复作用：能够抑制溃疡性结肠炎小鼠模型T细胞免疫功能，降低血清细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-a水平，升高IL-10水平;使MPO、NOS活性降低，降低NO含量，使SOD活性升高，减轻炎症损伤。