关键词： Ezrin   MARCKS   黏液分泌   气道上皮  

摘要： 目的： 明确目标人群中支气管粘膜上皮中Ezrin的表达特征。 探讨Ezrin在体外培养的气道上皮细胞中的表达及在黏液分泌中的作用。 在细胞模型中进一步研究Ezrin与参与气道上皮细胞黏液分泌出胞动作的相关信号分子之间相互作用，详细探讨Ezrin/PIP2/MARCKS分子信号链参与气道黏液分泌的过程，以期明确Ezrin参与气道黏液分泌调控的具体分子机制及信号传导通路。 方法： （1）Ezrin在目标人群支气管粘膜上皮中的表达情况： 收集外科行肺叶切除术患者支气管粘膜组织，采用免疫组织化学方法检测Ezrin蛋白的表达水平及其分布特点，用Imagepro-plus6.0软件进行图像分析比较慢性气道炎症患者与正常人气道粘膜上皮组织中的表达差异，并进一步采用Western bolt法及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）法分别检测慢性气道炎症患者与正常人气道粘膜上皮组织中Ezrin的蛋白及mRNA的表达差异。 （2）Ezrin在体外培养的气道上皮细胞中的表达及其促黏液分泌效应研究： 获得野生型及关键作用位点Thr567定点突变的Ezrin重组质粒（pEGFP-N1-ezrin-Wt、 pEGFP-N1-ezrin-T567D、 pEGFP-N1-ezrin-T567A），经酶切鉴定验证后，转染16HBE细胞，取得具有EGFP标记的Ezrin T567D、T567A、Wt以及pEGFP-N1对照组的系列细胞株，为后续功能对照研究提供基础。体外培养人气道上皮16HBE细胞，以不同浓度人嗜中性细胞弹性蛋白酶（human neutrophil elastase，HNE）刺激细胞，MTT法检测其对细胞活力的影响，real-time PCR法检测经刺激物作用后MUC5AC mRNA表达水平，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞上清液及细胞裂解液中的MUC5AC蛋白含量，从而选取HNE的最适浓度。以最适浓度的HNE刺激转染野生型Ezrin及Ezrin各型突变体的16HBE细胞，ELISA法比较HNE作用后各组细胞MUC5AC蛋白含量的差别，同时采用Western blot法比较培养细胞中不同突变体中磷酸化Ezrin蛋白的含量，明确Thr567位点的不同突变体对MUC5AC分泌影响的差异，推断出其在黏液分泌中的关键作用。 （3）Ezrin与胞吐相关蛋白的定位及相互作用研究： 分别将新霉素（PLC特异性抑制剂，可抑制PIP2水解）和CalphostinC（PKC特异性抑制剂）作用于16HBE细胞，Western blot法检测细胞中磷酸化Ezrin的含量，同时应用免疫细胞化学染色，激光共聚焦显微镜观察PIP2和Ezrin的表达及细胞定位情况，以期明确PIP2和PKC对Ezrin磷酸化及顶膜定位的影响。与此同时，培养的人气道上皮细胞转染野生型、Thr567位点各型Ezrin突变体及对照后，分别予以HNE刺激，Western blot检测细胞中磷酸化MARCKS的含量，观察Ezrin对MARCKS磷酸化的影响。最后，将16HBE细胞转染野生型、PSD突变的MARCKS及对照后，予以HNE刺激后，ELISA检测胞外分泌的MUC5AC蛋白表达水平，以期明确MARCKS对MUC5AC蛋白分泌的影响。 结果： （1）Ezrin在目标人群支气管粘膜上皮中的表达情况： 免疫组化结果显示磷酸化Ezrin蛋白阳性染色细胞位于支气管粘膜上皮内，集中表达于纤毛富集的支气管粘膜上皮细胞的细胞膜顶端靠腔面侧，呈棕黄色。用Imagepro-plus6.0软件进行图像分析，把黄色区域作为评定区（area of interest，AOI），结果发现：COPD组的支气管粘膜上皮累积光密度/面积（integrated optical density/area，IOD/area）值（0.28±0.049）显著高于正常对照组（0.19±0.036），P <0.05，差异有统计学意义。real-time PCR结果显示：COPD组支气管粘膜内Ezrin mRNA相对表达量为对照组的1.18±0.071倍，与正常对照组相比无显著性差异（P>0.05）。Western-blot结果显示：COPD组支气管粘膜内磷酸化Ezrin蛋白表达量显著高于正常对照组（P <0.05)，差异有统计学意义。 （2）Ezrin在体外培养的气道上皮细胞中的表达及其促黏液分泌效应研究： Ezrin重组质粒经XhoI-BamH I的双酶切鉴定，各质粒的酶切结果与预期的一致，确证有目的DNA片段产生，可以进行后续实验。将上述pEGFP-N1-Ezrin重组质粒与空质粒分别转染到16HBE细胞，24-48h在荧光倒置显微镜下观察四组质粒均发出绿色荧光，说明转染成功。分别予以不同浓度HNE作用于16HBE细胞

关键词： 牙龈卟啉单胞菌脂多糖   周期性张应力   成骨细胞   基质金属蛋白酶-13   基质金属蛋白酶抑制因子-1   炎症状态  

摘要： 目的:口腔正畸治疗可以协助牙周治疗最大限度的恢复牙周病患者正常的口颌系统功能。如何才能实现静止期炎症状态下牙齿安全有效的正畸治疗成为正畸医生极为关注的问题。本实验通过研究炎症上清液及周期性张应力作用下，小鼠成骨细胞系MC3T3-E1基质金属蛋白酶-13(MMP-13)和金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的表达变化，来探讨炎症状态与力学作用下骨改建的机制，为进一步研究炎症状态下正畸应力对骨改建的影响提供理论依据。\n 方法:取100ng/ml的牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPs)于培养液中刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)，收集24h后的培养上清液并稀释至20％浓度后作为炎症上清液。本实验分为四组：NI-NF组为空白对照组，MC3T3-E1成骨细胞正常培养；I-NF组为单纯炎性刺激组，取20％稀释浓度的PgLPs刺激单核细胞培养的炎症上清液，与MC3T3-E1细胞共孵育24h：NI-F组为非炎性刺激加力组，对MC3T3-E1成骨细胞加载2000μ strain、0.5Hz循环单轴张应力，分别取加力5分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时后观察：I-F组为炎性刺激加力组，取20％稀释浓度的PgLPs刺激单核细胞培养的炎症上清，与MC3T3-E1细胞孵育24h后加载2000μ strain、0.5Hz循环单轴张应力，分别取加力5分钟、30分钟、1分钟、3分钟、6分钟后观察。观察各组细胞形态变化，并采用实时荧光定量PCR技术和免疫组化法检测基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1的mRNA及蛋白表达水平的变化。\n 结果:1、细胞形态变化：NI-NF组MC3T3-E1成骨细胞生长良好，光镜下观察细胞呈梭形、三角形或不规则多边形，有2～3个突起伸出，胞质透亮、饱满。I-NF组细胞呈扁平状，细胞浆中颗粒增多，有空泡状出现，透光性下降。NI-F组镜下观察细胞呈梭形、三角形或不规则多边形，突起伸出增多，细胞拉长，可呈一定的定向性排列。I-F组细胞呈长梭形、胞体扁平状，细胞质中颗粒及空泡状出现明显增多，细胞透亮度降低，细胞膜边缘毛糙，突起伸出增多，部分2、炎症状态下张应力对成骨细胞MMP-13表达的影响荧光定量PCR及免疫组化结果显示，炎症上清孵育的MC3T3-E1细胞，在加载周期性张应力后MMP-13的表达明显增加，并随着加力时间的延长而逐渐增加，不同时间段的表达差异有统计学意义(P<0.05)。\n 3、炎症状态下张应力对成骨细胞TIMP-1表达的影响荧光定量PCR及免疫组化结果显示，炎症上清孵育的MC3T3-E1细胞，在加载周期性张应力后TIMP-1的表达明显增加，并随着加力时间的延长而逐渐增加，不同时间段的表达差异有统计学意义(P<0.05)。\n 结论:小鼠成骨细胞系MC3T3E1在炎症上清和周期性张应力作用下，MMP-13的mRNA和蛋白表达与对照组相比显著增强，并随着应力刺激时间的增加，表达量逐渐增加。但同时其抑制因子TIMP-1也随着加力时间的增加而处于明显增高的水平，表示这个阶段MMP-13活性依然相对受到抑制，从而调节MMP-13/TIMP-1达到相对的动态平衡，可使Ⅰ型胶原分解作用也受到相应的抑制。同时本实验结果也提示我们在炎症状态下加载张应力，骨代谢细胞将产生更高水平的影响骨吸收的细胞因子，并在一定加力时间范围内逐渐升高。研究结果表明在炎症状态下机械应力通过对成骨细胞MMP-13＼TIMP-1表达的影响，调节细胞外基质的降解过程，可能是炎症状态下正畸牙齿移动过程中骨改建的一个重要机制。

关键词： 近江牡蛎   cDNA文库   类立克次体   同种异体移植炎症因子   高迁移率族蛋白   亲环蛋白   补体样蛋白   免疫炎症反应   抗感染防御体系  

摘要： 2007年2月底至5月底广西养殖的近江牡蛎发生了大面积的死亡,波及广西所有牡蛎养殖区,造成巨大的经济损失。本研究针对此次发病进行了广泛的流行病学调查和取样研究,发现类立克次体的大量感染,造成严重的牡蛎组织病理损伤。我们对该病原进行了组织病理学和超微病理学的研究,并成功地完成了病原的分离纯化和鸡胚培养。 在此基础上,为了进一步探讨近江牡蛎抗感染免疫防御反应相关机制,为其病害防治提供理论依据,我们构建了类立克次体刺激后近江牡蛎血淋巴细胞cDNA文库,随机挑选400个阳性克隆进行测序分析,共获得200个基因序列,包括96个已知序列和104个未知序列。其中96个已知基因序列根据其参与的生物学过程大致可分为11类。并从中筛选同种异体移植炎症因子(Ca-AIF1),高迁移率族蛋白(Ca-HMGB)和三个亲环蛋白家族基因(Ca-CyPA, Ca-CyPB和Ca-PPIL3),三个补体样基因片段(CaClql, CaClq2and CaC3)共8个基因,运用免疫学、分子生物学和细胞生物学等技术手段结合生物信息学知识,进行了结构分析和相关功能探讨,具体如下： 1、Ca-AIF1编码139个氨基酸,包含典型的钙结合EF-hand结构域。同源性比较结果显示Ca-AIF1与其他物种AIF1氨基酸序列相似度为47%-73%。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌中成功诱导表达及纯化了Ca-AIF1蛋白并制备了多克隆抗体。Real-time RT-PCR检测组织表达结果表明Ca-AIF1在所有被检组织中均有表达,并且在血淋巴细胞,鳃和性腺组织中表达量显著高于其他组织,预示着该基因可能参与机体免疫防御反应和生殖细胞的增殖分化。进一步免疫荧光检测组织细胞定位结果显示Ca-AIF1主要定位于性腺组织的上皮组织细胞中。随后我们使用real-time RT-PCR和流式细胞仪分析和探讨Ca-AIF1及其抗体在近江牡蛎抗感染免疫反应中的作用和机制。结果显示(1)RLO或LPS (RLO/LPS)刺激后,近江牡蛎单层血淋巴细胞中Ca-AIFl mRNA表达量显著上调,预示着Ca-AIF1参与近江牡蛎免疫炎症反应;(2)纯化的Ca-AIF1重组蛋白能够引起LITAF,Myd88,TGF β显著上调,预示着Ca-AIF1蛋白具有促炎细胞因子作用,能够引起近江牡蛎免疫炎症反应及可能的Myd88介导的信号通路;(3)制备的Ca-AIF1多克隆抗血清能够显著降低RLO/LPS刺激引起的LITAF表达量上调比例,表明Ca-AIF1抗血清能够显著抑制RLO或LPS刺激引起的免疫炎症反应;(4) Ca-AIF1多克隆抗血清能够有效降低RLO/LPS刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞坏死和晚期凋亡比率,提高细胞存活率,进一步表明近江牡蛎AIF1抗体能够有效保护机体抵御革兰氏阴性菌和RLO的感染。 2、Ca-HMGB编码203个氨基酸。包含两个典型HMG-box和一个酸性C末端。同源性比较结果显示Ca-HMGB与其他物种HMGB氨基酸序列相似度为34%-55%。Real-time RT-PCR检测组织表达结果表明Ca-HMGB在所有被检组织中均有表达,并且在血淋巴细胞中的表达量显著高于其他组织,预示着该基因可能参与机体免疫防御反应。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌成功诱导表达及纯化了Ca-HMGB蛋白并制备了多克隆抗体。运用细胞免疫荧光技术检测RLO刺激前后Ca-HMGB亚细胞定位结果表明,Ca-HMGB在健康近江牡蛎血淋巴细胞的细胞核与细胞质中均有表达,而当RLO刺激12h后Ca-HMGB主要在细胞质中表达。随后我们运用real-time RT-PCR, western blot和流式细胞仪分析和探讨Ca-HMGB及其抗体在近江牡蛎抗感染免疫反应中的作用和机制,结果显示(1)RLO/LPS刺激后,近江牡蛎单层血淋巴细胞中Ca-HMGB mRNA表达量显著上调;(2)RLO刺激后,Ca-HMGB蛋白能被释放到细胞外,参与免疫炎症反应;(3)纯化的Ca-HMGB重组蛋白能够引起除AIF1外,被检测的细胞因子LITAF, Myd88, TGF βmRNA表达显著上调,预示着Ca-HMGB蛋白具有促炎细胞因子作用,能够引起近江牡蛎免疫炎症反应及可能的Myd88介导的信号通路;(4)Ca-HMGB多克隆抗血清能够显著降低RLO/LPS刺激引起的LITAF表达量上调比例,表明Ca-HMGB抗血清能够显著抑制RLO或LPS刺激引起的免疫炎症反应;(5)Ca-HMGB多克隆抗血清能够有效降低RLO/LPS刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞坏死和晚期凋亡比率,提高细胞存活率,进一步表明近江牡蛎HMGB抗体能够有效保护机体抵御革兰氏阴性菌和RLO的感染。 3、亲环蛋白基因Ca-CyPA编码165个氨基酸,Ca-CyPB编码

关键词： BVT.2733   11β－羟基类固醇脱氢酶1   糖皮质激素   肥胖   靶向   脂肪组织   胰岛素抵抗   炎症   巨噬细胞   前脂肪细胞   慢病毒  

摘要： 糖皮激素分泌过多和长期应用糖皮质激素会引起肥胖、代谢综合征的发生，肥胖的发生发展与糖皮质激素作用异常有关。11－羟化类固醇脱氢酶（11β－HSD1）作为糖皮质激素的局部放大器，可将组织中无活性的可的松转化为有活性的氢化可的松，脂肪组织11β－HSD1在肥胖发生发展中起关键作用，动物实验及临床研究都证实脂肪组织11β-HSD1是治疗肥胖、糖尿病等代谢综合征的新靶点。但是目前尚没有脂肪组织靶向的11β-HSD1抑制剂问世，我们在前期研究基础上创新性地合成特异的脂肪组织11β－HSD1靶向抑制剂，研究其对饮食诱导肥胖小鼠脂肪组织及全身代谢的影响，我们发现脂肪组织11β－HSD1靶向抑制剂不仅能改善脂肪组织局部分泌功还能够通过改善肝脏糖脂代谢的关键基因表达减轻肥胖小鼠体重、改善糖耐量。 另一方面，糖皮质激素除影响代谢外，也是重要的免疫调节因子，事实上，糖皮质激素作为抗炎药物广泛应用于临床，抑制11β－HSD1活性，在改善代谢带来益处的同时，有可能促发内源性炎症反应，加重心脑血管并发症。但是目前抑制11β－HSD1活性对炎症的影响并不明确，因此我们在前期研究基础上在体内外进一步研究抑制抑制11β－HSD1肥胖小鼠对脂肪组织及全身炎症的影响，结果发现抑制11β－HSD1活性在改善肥胖小鼠全身代谢的同时不仅没有引起肥胖小鼠体内炎症因子表达升高，反而改善了肥胖小鼠脂肪组织炎症，11β－HSD1是治疗肥胖及其相关疾病的新的有效靶点。 实验分两部分： 第一部分：脂肪组织靶向11β－羟基类固醇脱氢酶1抑制剂治疗饮食诱导肥胖的机制研究 第二部分：BVT.2733,特异性11β－羟基类固醇脱氢酶1抑制剂改善肥胖及其炎症的分子机制研究 第一部分：脂肪组织靶向11β－羟基类固醇脱氢酶1抑制剂治疗饮食诱导肥胖机制研究 目的：目前治疗肥胖及代谢综合征的药物有着各种限制和副作用。脂肪组织11β－羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）已成为治疗肥胖、代谢综合征的新靶点。但是目前尚没有脂肪组织靶向的11β-HSD1抑制剂问世，我们旨在创新性合成仅作用于白色脂肪组织11β-HSD1的靶向抑制剂，研究肪组织11β-HSD1的靶向抑制剂能否减轻饮食诱导肥胖小鼠体重，改善糖耐量。 方法：特异性11β-HSD1抑制剂BVT.2733和白色脂肪组织脉管结构靶向多肽CKGGRAKDC相连接，靶向药物CKGGRAKDC-BVT.2733(T-BVT)和相同剂量的非靶向药物NT-BVT（CKGGRAKDC和BVT.2733的混合物）分别通过皮下注射干预饮食诱导肥胖小鼠两周。 结果：和对照组相比，靶向药物组（T-BVT）明显减轻肥胖小鼠体重，改善糖耐量；在脂肪组织，T-BVT组减少脂肪细胞体积，增加脂肪组织脂联素（adiponectin）、 vaspin mRNA的表达;在肝脏T-BVT减少了糖异生的限速酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK) mRNA的表达,增加了脂质氧化关键基因肉碱脂酰转移酶I (mCPT-I)、过氧化物酶体增生物激活受体α（PPARα）mRNA的表达；非靶向药物没能改变脂肪细胞体积及肝脏基因表达，但是却增加了肌肉组织解偶联蛋白2（UCP-2） mRNA的表达。结论：脂肪组织靶向的11β-HSD1抑制剂是治疗肥胖及代谢综合症的新的有效药物。 第二部分：BVT.2733,特异性11β－羟基类固醇脱氢酶1抑制剂改善肥胖及其炎症的分子机制研究 目的：抑制11β－羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）已成为治疗肥胖、代谢综合征的新方法，但是作为抑制局部糖皮质激素的药物，目前抑制11β-HSD1后对肥胖炎症的影响还不明确，我们旨在研究特异性11β-HSD1抑制剂BVT.2733对肥胖小鼠脂肪组织炎症及巨噬细胞浸润的影响。 方法：体内研究：高脂饲料喂养C57BL/6J小鼠建立了饮食诱导肥胖动物模型，特异性11β-HSD1抑制剂BVT.2733通过灌胃的方法干预肥胖小鼠4周；体外：在前脂肪细胞3T3-L1和巨噬细胞J774A.1通过慢病毒转染技术干涉和高表达11β-HSD1基因，通过实时荧光定量PCR技术检测相关炎症基因的表达。 结果：体内：BVT.2733干预4周不仅减轻了肥胖小鼠体重、改善了糖耐量及脂肪细胞分泌功能，而且减少了肥胖小鼠脂肪组织炎症基因单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子（TNF-α）mRNA的表达及巨噬细胞浸润；体外：11β-HSD1抑制剂BVT.2733及干涉11β-HSD1基因减少了巨噬细胞及前脂肪细胞炎症基因MCP-1、白细胞介素-6（IL-6）的表达，高表达11β-HSD1基因放大了炎症基因MCP-1、IL-6的表达，而这种放大的炎症能够被BVT.

关键词： 宫内炎症   脑白质损伤   神经发生   Morrris水迷宫   Akt   CREB   BDNF   LY294002   Rolipram  

摘要： 围产期胎儿炎症反应综合征(Fetal Inflammatory Response Syndrome, FIRS)是造成早产和早产儿脑白质损伤的最常见原因,临床与流行病学资料证实早产儿脑白质损伤是儿童脑瘫的一个重要危险因素。由于早产儿脑白质损伤将影响神经系统发育,所以脑损伤后神经再生修复机制的研究将显得尤为重要。cAMP反应序列结合蛋白(CREB)是一种重要的核转录因子,调节启动子中具有环磷酸腺苷反应单元(CRE)的基因转录,在神经元再生、突触形成及学习记忆等方面具有重要的调节作用,是细胞内多种信号通路的一种关键成分。虽然国内外研究发现,缺氧缺血能诱导海马神经发生,但是对宫内炎症仔鼠脑白质损伤后海马神经发生的研究目前很少涉及,而且CREB信号通路是否参与脑白质损伤后海马神经发生和认知损害修复的分子机制尚不明确。本研究通过建立宫内炎症后仔鼠脑白质损伤模型,研究仔鼠生后不同时间点海马神经发生的规律；以及研究CREB信号通路是否参与脑白质损伤后海马神经发生；而且通过PI3K抑制剂LY294002和PDE4抑制剂Rolipram干预,探讨CREB信号通路在宫内炎症仔鼠脑白质损伤后海马神经发生中的作用和分子机制。从脑损伤自身修复角度进一步阐述CREB信号通路在神经发生及认知功能改善中的作用和分子机制,为防治早产儿脑白质损伤和儿童脑瘫的康复提供理论依据。 目的： 研究宫内炎症脑白质损伤后仔鼠生后不同时间点海马神经发生的规律,明确CREB信号通路是否参与调节脑白质损伤后海马神经发生,解释CREB信号通路在宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生中的作用和分子机制,阐明CREB信号通路在宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生及认知功能改善中的重要意义。 方法： 1.动物模型：实验动物分2组：①空白对照组：在各时间点和实验组等数量配对,②宫内炎症组：SD雌鼠孕15天于左右两侧宫颈内各注射大肠杆菌稀释液0.2mL,待其生产,制备宫内炎症后仔鼠脑白质损伤模型。各组仔鼠在不同时间点腹腔注射BrdU,24h后行主动脉灌注固定后制备3、7、14、28日龄脑组织石蜡标本,用免疫组织化学法检测BrdU阳性的增殖细胞数目变化；7日龄脑组织采用免疫荧光双标记(BrdU/Nestin)检测海马齿状回神经干细胞增殖情况；28日龄脑组织采用免疫荧光双标记(BrdU/NeuN、BrdU/GFAP)检测海马齿状回神经元与星形胶质细胞分化情况。 2. Morris水迷宫法：水迷宫的水池直径为100cm,高60cm,水深51cm,水温(22±0.5)℃,站台高度为50cm,站台顶端平面10cm×10cm,平台没于水面下1cm,水池周围参照物保持不变。实验包括：①适应性训练：实验前1d让动物在无安全平台的水中适应性游泳2min；②定位航行试验：实验历时5d,每日分上下午系列,每个系列包括4次,操作者将大鼠面向池壁从不同象限入水,发现平台后,让其在平台上站立30s,将大鼠从平台上拿下来休息60s,再随机由下一象限入水进行试验,如果120s内找不到平台,则由操作者帮助其上平台,潜伏期记为最高分120s。记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)；③空间探索试验：第6天,撤去平台,取随机一点投大鼠入水池中,记录2min内大鼠穿过平台所在象限的时间。④探索实验结束后,休息三天,即水迷宫的第10天,再对全部大鼠进行一次水迷宫测试,方法同定位航行试验,测试其远期记忆的保持能力。 3. CREB信号通路与神经发生：宫内炎症组和空白对照组动物在相应时间点(3、7、14、21、28日龄)断头取脑,应用RT-PCR及Western blot检测海马齿状回p-Akt、Survivin、p-CREB、BDNF、TrkB mRNA和蛋白质表达变化；应用免疫组化在28日龄对p-Akt、p-CREB、BDNF进行定位染色,进一步明确CREB信号通路的主要基因p-Akt、p-CREB和BDNF在海马齿状回神经细胞的表达情况。通过以上方法证明CREB信号通路参与宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生。 4. CREB信号通路干预：宫内炎症组和空白对照组动物侧脑室微量注射PI3K阻滞剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路,同时应用磷酸二酯酶(PDE4)抑制剂Rolipram,增加脑内cAMP浓度从而激活CREB信号通路。两组动物分别在28日龄进行Morris水迷宫实验观测仔鼠学习记忆能力改变,并通过激光共聚焦显微镜研究相应年龄点仔鼠海马齿状回神经细胞增殖和分化的变化,以及通过Western blot检测CREB信号通路主要组分p-Akt、p-CREB及BDNF蛋白的表达变化,进一步阐述CREB信号通路参与脑白质损伤后海马神经发生的分子机制。 结果： 1.宫内炎症

关键词： 慢性乙型肝炎   肝衰竭   炎症反应   免疫状态  

摘要： 目的 探讨乙型肝炎慢加急性肝衰竭不同时期的炎症反应及免疫状态的动态变化.方法 随机纳入90名住院治疗的乙型肝炎慢加急性肝衰竭患者,入院时按照病情分为肝衰竭早期组(n=30)、中期组(n=30)和晚期组(n=30),选择丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、白蛋白、凝血酶原活动度(PTA)作为肝功能指标,TNF-α、LPS、IL-12、IL-18作为炎症指标,CD4+、CD8+T细胞、IgA、IgG作为免疫功能指标,统计分析3组患者各指标的差异,并对差异结果进行分析.结果 肝衰竭晚期组各观察指标与中期组、早期组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)；肝衰竭中期组各观察指标与早期组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 乙型肝炎慢加急性肝衰竭不同时期的炎症反应及免疫状态的动态变化是不同的,治疗时应该根据其具体变化进行针对性的用药治疗.

关键词： 颈动脉粥样硬化   不稳定斑块   免疫炎症反应   树突状细胞  

摘要： 目的： 颈动脉粥样硬化发生发展过程中，各种免疫炎性细胞机制参与其中，病变区域免疫炎症对脑血管病等血管事件继续发生影响。树突状细胞在介导有关免疫炎症反应中发挥重要作用，本研究针对颈动脉粥样硬化患者斑块性质和内中膜厚度选择分组，借助流式细胞术研究外周血树突状细胞的分子标记CD11c和CD86表达分析，并与部分临床资料：血脂、尿酸和C反应蛋白等进行相关性比较，探讨颈动脉粥样硬化的发病和致病过程中，DC作为免疫炎性细胞的相关作用意义及参与影响机制。 方法： 实验选取2010年12月-2011年12月伴有脑血管病症状和体征就诊于泰山医学院附属医院的颈动脉粥样硬化患者和健康查体正常者共108例作为研究对象，其中病例组78例，同期院内查体正常者30例为对照。所有对象均行颈部血管彩色多普勒超声探查明确有无颈动脉粥样硬化及程度，并行颅脑磁共振、血脂、血糖、血压、血尿酸和C-反应蛋白等检查和监测，明确所有入选对象的一般临床资料，病例组的诊断同时符合第四届脑血管病全国学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点》标准。颈动脉粥样硬化的检测由专人专机探查斑块的性质和内中膜厚度指标，利用流式细胞仪检测分析外周血单个核细胞中经鼠抗人单克隆抗体免疫荧光染色标记的CD11c+和CD86+细胞，比较外周血含有DC分子标记的CD11c+CD86+双阳性细胞比例，在此基础上探讨DC在颈动脉粥样硬化的发病和致病过程的炎性免疫作用及各种影响因素可能的参与机制，经统计学软件SPSS16.0进行处理分析得出数据统计结果。 结果： 1．颈动脉粥样硬化不同斑块性质的患者外周血DC标记CD11c+CD86+双阳性细胞占单个核细胞的比例统计结果，低回声斑块、混合回声斑块和强回声斑块组与对照组比较结果均增高，差异有统计学意义（P﹤0.01）；不稳定斑块组（低回声斑块组和混合回声斑块组）比例数值较稳定性斑块组（强回声斑块组）比例增高，差异有统计学意义（P﹤0.01）；其中低回声斑块组高于混合回声斑块组比例，差异比较有统计学意义（P﹤0.05）。 2．颈动脉粥样硬化不同的IMT患者，各IMT组外周血DC标记的CD11c+CD86+双阳性细胞占单个核细胞的比例统计结果，0.9≦IMT﹤1.0组、1.0≦I MT﹤1.1组、1.1≦I MT﹤1.2组三组均高于正常IMT的对照组，差异有统计学意义（P﹤0.01）；其中颈动脉内膜增厚的1.0≦IMT﹤1.1组、1.1≦I MT﹤1.2组较0.9≦IMT﹤1.0组的比例增高，差异具有统计学意义（P﹤0.01）；1.1≦I MT﹤1.2组表达比例稍高于1.0≦IMT﹤1.1组，但差异无统计学意义（P﹥0.05）。 3.颈动脉粥样硬化患者外周血DC标记CD11c+CD86+双阳性细胞占单个核细胞的比例，与血脂中的CHOL结果比较成正相关（P=0.002，r=0.295），与LDL成正相关（P=0.001，r=0.318），与HDL成负相关（P=0.018，r=﹣0.228）；与收缩压成正相关（P=0.031，r=0.248）；与甘油三酯、脂蛋白a、空腹血糖、舒张压水平未见统计学意义的关联。 4.颈动脉粥样硬化患者外周血DC标记CD11c+CD86+双阳性细胞占单个核细胞的比例，与血尿酸水平比较成正相关（P=0.001,r=0.304）。 5.颈动脉粥样硬化患者外周血DC标记CD11c+CD86+双阳性细胞占单个核细胞的比例，与C反应蛋白水平比较成正相关（P=0.042,r=0.315）。结论： ***11c+CD86+双阳性细胞在CAS患者的不稳定性质斑块和IMT增厚组增高，推测CD11c+CD86+双阳性细胞可能与CAS的发生和发展有关。 ***11c+CD86+双阳性细胞与血脂（CHOL、LDL和HDL）、收缩压、血尿酸、C反应蛋白等相关，推测CD11c+CD86+双阳性细胞与上述相关危险因素共同参与CAS致病过程。

关键词： 沙眼衣原体   pORF5质粒蛋白   炎症   细胞因子  

摘要： 目的：沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是一种严重危害人类健康的病原体，过度的炎症反应造成免疫病理损伤是Ct主要的致病机制。Ct唯一的一种分泌性质粒蛋白pORF5在Ct炎症反应中可能发挥重要作用。本实验研究pORF5质粒蛋白是否能引起BALB/c小鼠生殖道炎症反应，以及对炎症细胞因子（CKs）TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响，为进一步研究pORF5质粒蛋白的致病机制及防治提供实验依据。 方法：重组质粒pGEX-6p-1/pORF5经PCR和双酶切鉴定后，转化XL1-blue大肠杆菌，IPTG诱导表达GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白经GlutathioneSepharose4B纯化和PreScission Protease切割GST标签后得到目的蛋白pORF5，SDS-PAGE和Western-Blot进行分析和鉴定；采用快速冻干的方法浓缩pORF5蛋白，用BCA试剂盒测定该蛋白浓度。将pORF5蛋白分别在第1d、3d、6d接种于BALB/c小鼠阴道后穹窿，第7d处死小鼠，HE染色观察输卵管组织病理形态学改变，常规血细胞计数法计数外周血和阴道灌洗液中白细胞总数，瑞氏染色对外周血和阴道灌洗液中白细胞进行分类计数；ELISA方法检测血清、阴道灌洗液和小鼠脾细胞培养上清中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平；MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应。 结果： 1.重组质粒pGEX-6p-1/pORF5在XL1-blue菌中高效表达出Mr约为54kDa的GST-pORF5融合蛋白，主要以可溶性的形式存在；融合蛋白经GlutathioneSepharose4B纯化和PreScission Protease切割GST标签后得到高纯度的目的蛋白pORF5；经浓缩后浓度达到3μg/μL。 2. pORF5蛋白刺激组BALB/c小鼠输卵管壶腹部与峡部出现不同程度的肿胀，输卵管周围的结缔组织发生黏连，输卵管单侧或双侧发生了不同程度的扭曲、变形、阻塞与积水；而正常组与PBS组小鼠输卵管壶腹部及峡部未见肿胀，管腔内未见积水；pORF5蛋白刺激组小鼠的输卵管出现中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润，PBS对照组与正常组BALB/c小鼠输卵管的炎症反应并不明显。pORF5组的BALB/c小鼠外周血中白细胞总数较正常组（P﹤0.05）与PBS组（P﹥0.05）均增多，pORF5组的中性粒细胞百分比高于正常组（P﹤0.05）与PBS组（P﹥0.05），淋巴细胞百分比低于正常组（P﹤0.05）与PBS组（P﹥0.05），单核细胞百分比高于正常组（P﹥0.05）与PBS组（P﹥0.05）；pORF5组的BALB/c小鼠阴道分泌物中白细胞总数较正常组（P﹤0.05）与PBS组（P﹥0.05）均增多。 3. pORF5组的BALB/c小鼠外周血中TNF-α水平显著高于正常组和PBS组（P﹤0.01），IL-1β水平显著高于正常组和PBS组（P﹤0.01），IL-6水平显著高于正常组（P﹤0.01）和PBS组（P﹤0.05）；pORF5组的BALB/c小鼠阴道分泌物中TNF-α水平显著高于正常组和PBS组（P﹤0.01），IL-1β水平显著高于正常组和PBS组（P﹤0.05），IL-6水平显著高于正常组和PBS组（P﹤0.01）。 4. pORF5组的BALB/c小鼠脾细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著高于正常组和PBS组（P﹤0.01）；pORF5组BALB/c小鼠脾淋巴细胞经pORF5蛋白刺激后的增殖活性较正常组和PBS组（P﹤0.01）明显增强，且差异具有显著性。 结论： 1.成功表达纯化得到54kDa的GST-PORF5融合蛋白以及不含GST标签的28kDa的pORF5蛋白； 2. pORF5蛋白能引起BALB/c小鼠输卵管的炎症病理损伤； 3. pORF5蛋白能诱导BALB/c小鼠产生TNF-α、IL-1β和IL-6等前炎症因子。

关键词： 老年   重症肺炎   肠外营养   ω-3不饱和脂肪酸   免疫功能  

摘要： 目的观察含有不同ω-3／ω-6比例脂肪酸肠外营养对老年重症肺炎患者机体炎症反应和免疫功能的作用。方法将40例老年重症肺炎患者随机分为研究组和对照组，每组20例。两组在常规治疗基础上均使用等氮、等热量肠外营养，共5天，其中研究组添加ω-3多不饱和脂肪酸。分别在治疗前和治疗第6天检测血C反应蛋白（CRP）、淋巴细胞免疫表型，并观察两组患者的抗生素应用天数及种类。结果治疗后两组患者CRP水平均下降，CD3＋、CD4＋均升高，但研究组变化幅度更大（P〈0．05）；治疗后两组患者的CD8＋均下降，但两组间下降幅度比较无显著性差异；CD4＋／CD8＋仅在研究组升高。研究组抗生素应用天数及种类均少于对照组。结论添加ω-3多不饱和脂肪酸的肠外营养能降低老年重症肺炎患者机体炎症反应，提高免疫功能，缩短病程。

关键词： 免疫炎症反应   脊髓损伤   BMSCs   继发性损伤   原发性损伤   炎症反应过程   细胞激活   分子水平  

摘要： 脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）按机制可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是一个不可逆转的过程,而继发性损伤则是一个可逆且可控制的过程[1]。在继发性损伤的早期,存在一个重要的炎症反应过程,它能够触发其后发生的一系列针对受损脊髓的细胞和分子水平的反应。脊髓损伤区常有各种免疫炎症细胞激活、浸润和炎症介质生成,