关键词：
花椒提取物
胆固醇
抗炎
HepG2
C57BL小鼠
摘要：
目的：探讨花椒各不同的极性部位(石油醚部位,乙酸乙酯部位,和正丁醇部位)在正常生理及高胆固醇状态下对人肝癌细胞HepG2胆固醇代谢的影响,同时比较了在炎症状态下对小鼠胆固醇代谢的影响,选择活性最好的部位,考察其可能的分子机制。运用LC-MS分析其主要成分,并运用HPLC、TLC、LH-20等手段从中分离纯化出活性物质。
方法：1、自四川汉源购入花椒15kg,加入3倍体积的95%乙醇,使用多功能提取浓缩机组50℃回流提取三次,得到花椒醇提物。将其依次用石油醚(PE)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇萃取(n-BuOH)三次,得到PE组、EtOAc组、BuOH组。用Folin&Ciocalteu's phenol法测定各部位的总酚含量,DPPH法测定各部位清除自由基的能力,评价其抗氧化能力。
3、培养人肝癌细胞HepG2,待长到60%时,用PBS清洗两遍,换无血清DMEM,分别加入PE部位(0.05mg/ml)、EtOAc部位(0.05mg/ml)、n-BuOH部位(0.05mg/ml)处理12小时后加入lug/ml25-羟胆固醇+5ug/ml胆固醇。24小时后,MTT法检测药物对细胞存活率的影响；检测细胞内总胆固醇的含量以及细胞上清液中ApoB的分泌；提取细胞总RNA, real-time PCR测SREBP-2、LDLR、HMGCR、CYP7A1、ABCA1的mRNA, western blotting检测ACAT和LDLR的蛋白表达,比较活性最好的部位。实验另设立空白对照组和未经25-羟胆固醇+胆固醇处理的PE组(0.05mg/ml)、EtOAc组(0.05mg/ml)、BuOH组(0.05mg/ml)。
4、培养人肝癌细胞HepG2,待长到60%时,用PBS清洗两遍,换无血清DMEM,分别加入n-BuOH部位(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml)处理12小时后加入lug/mL25-羟胆固醇+5ug/ml胆固醇造细胞高胆固醇模型。24小时后,检测细胞内TC、TG、FC、FFA的含量；细胞上清液中ApoB、apoAl的分泌；提取细胞总RNA, real-time PCR测SREBP-2、LDLR、HMGCR、CYP27A1、LXR-α、ABCG1的mRNA表达水平；提取细胞总蛋白,western-blotting检测SREBP-2、LDLR、HMGCR、ACAT蛋白的表达水平。实验另设立空白对照组和未经25-羟胆固醇+胆固醇处理的n-BuOH组(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml)。
4、将C57/BL小鼠分成6组,分别为：阳性给药组(地塞米松5mg/ml+LPS)、PE组(PE400mg/mL+LPS)、EtOAc(EtOAc400mg/ml+LPS)、BuOH(n-BuOH400mg/mL+LPS)、vehicle组、模型组(LPS),灌胃七日后,腹腔注射LPS,建立小鼠急性炎症模型。ELISA法检测血液中TNF-α的含量, real-time PCR检测肝脏中促炎因子以及调控胆固醇代谢基因的表达,比较各部位的药效。选取活性最好的部位,同样设立模型组(LPS)、高剂量组(500mg/kg+LPS)、中剂量组(250mg/kg+LPS)、低剂量组(125mg/kg+LPS)、vehicle组、阳性给药组(地塞米松5mg/ml+LPS),灌胃七日后,腹腔注射LPS,建立小鼠急性炎症模型,ELISA法检测血液中TNF-α、IL-6的含量,酶法测定肝脏中总胆固醇的含量,real-time PCR检测肝脏中TNF-α、COX-2、iNOS、IL-6、ABCA1的表达,western-blotting检测肝脏中SREBP-l、PPAR-γ蛋白的表达。
5、LC-MS测定n-BuOH部位物质成分,并通过活性追踪的方法,运用TLC、LH-20、HPLC等手段进行活性物质的分离纯化。
结果：1、总酚含量的测定和DPPH清除能力的实验发现三个组分抗氧化能力顺序依次为BuOH (134.3mg/g)>EtOAc(75.7mg/g)>PE(21.8mg/g)
2、体外模型选用25-羟胆固醇+胆固醇诱导HepG2细胞,比较PE、EtOAc和BuOH组分降低细胞内总胆固醇含量的活性,发现三个组分均能降低细胞内总胆固醇含量及ApoB的分泌,而BuOH的活性最好。这三个组分在体外可以降低SREBP-2, HMGCR和ACAT的表达,从而降低胆固醇的生物合成及游离胆固醇的酯化,另一方面升高CYP27A1,ABCA1和LDLR的表达,从而增加胆固醇的逆转运,提高对血液中LDL的清除能力。体内模型选用腹腔注射LPS诱导C57BL小鼠,发现EtOAc和BuOH两个组分具有抗炎活性,且
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