关键词： 牙周炎   高脂血症   伴放线放线杆菌   脂多糖   细胞因子   炎症反应  

摘要： 目的研究伴放线放线杆菌牙周局部感染和全身感染对正常/高脂饮食新西兰兔组织器官炎症反应的影响，为探讨牙周病与高脂血症相互关系的相关分子生物学机制提供理论依据。 方法实验一：采用高脂饲料喂养6周建立新西兰兔高脂血症模型，兔前磨牙丝线结扎加牙周接种伴放线放线杆菌（Aa）维持8周，建立牙周病模型，分组为A组（ND）：正常饮食，B组（HFD）：高脂饮食，C组（Aa）：局部接种Aa，D组（HFD+Aa）：高脂饮食+局部接种Aa。采用鲎试剂、红外线光谱检测试剂盒提取Aa LPS，55ng/kg注射LPS，一周三次持续8周建立内毒素入血模型。实验二：分组为A组（ND）：正常饮食+注射生理盐水，B组（HFD）：高脂饮食+注射生理盐水，C组（ND+Aa-LPS）：正常饮食+Aa-LPS，D组（HFD+Aa-LPS）：高脂饮食+Aa-LPS，E组（ND+Ec-LPS）：正常饮食+Ec-LPS，F组（HFD+Ec-LPS）：高脂饮食+Ec-LPS。实验动物14周后实施安乐死，取下颌骨做骨丧失的形态学分析；采血测量TC、TG、HDL-C、LDL-C的变化，并用Elisa试剂盒检测兔外周血中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、INF-γ、MCP-1等炎症因子的水平；取主动脉、心肌、肺、肝、肾组织，做HE染色、TNF-α免疫组化染色，采用Realtime-PCR检测组织中TNF-α、IL-1β、CRP、IL-6、IL-10、MMP-9、MCP-1。实验三：实验动物分为四组：A组（ND）：正常饮食，B组（HFD）：高脂饮食，C组（Aa）：注射Aa菌悬液，D组（HFD+Aa）：高脂饮食+注射Aa菌悬液，菌悬液浓度为1.0×108CFU/ml、0.1ml/kg，对照组注射PBS，一周三次持续8周。第14周测量血清中炎症因子。实验四：实验动物建立牙周炎模型后耳源静脉注射IL-10（0.1μg/kg），24h后测量血清中炎症因子。 结果实验一：高脂饮食伴牙周感染的新西兰兔较其他各组动物呈现更高的炎症因子表达和牙槽骨丧失，而且牙周局部Aa感染促进了不同组织器官的病理进程。实验二：全身注射Aa-LPS时，高脂血症动物早期炎症因子表达较正常饮食动物低，而长期慢性Aa-LPS刺激后，高脂饮食新西兰兔其外周血炎症因子和不同组织炎症因子表达均较正常饮食动物高。实验三：长期Aa菌血症感染后，D组动脉粥样硬化程度明显较其他各组高，且各炎症因子表达明显升高。实验四：0.1μg/kg IL-10注射能短暂抑制牙周炎引起的全身反应。 结论Aa局部或全身感染均可上调炎症因子，导致兔血脂代谢紊乱，从而加重高脂血症对组织器官炎症反应。不同组织器官对Aa感染的反应各不相同，Aa感染可能是全身疾病发生发展的危险因素。高脂血症可使机体对细菌感染的敏感性增强并造成免疫失调，表现在早期抗炎和促炎因子的分泌迟钝，以及长期慢性的感染后调整炎症因子的能力下降，分泌量升高。IL-10可短暂抑制牙周炎引起的全身炎症反应。

关键词： 磷脂转运蛋白   炎症   核转录因子κB   基因敲除小鼠  

摘要： 目的 炎症(inflammation)在人类多种重要疾病的发生和发展过程中起着关键的作用。巨噬细胞(macrophage)作为一种免疫细胞，在炎症的多个环节起到重要作用。核转录因子κB(nucleus factor kappa-B, NFκB)是巨噬细胞参与的炎症信号通路中最重要的转录因子之一，它的激活能引起多种炎症因子如白细胞介素(interleukin)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等表达升高。磷脂转运蛋白(phospholipidtransfer protein, PLTP)参与炎症发生发展过程，PLTP能结合、转运以及中和脂多糖(lip-polysaccharide, LPS)，PLTP缺乏小鼠(PLTP-/-)在致死剂量的内毒素血症时血浆炎症因子表达升高，器官损伤加重，死亡率增加。该过程中高表达的炎症因子均受NFκB调控，且在巨噬细胞内均有表达，提示上述炎症因子表达升高很可能与巨噬细胞NFκB激活相关。本研究拟采用多种巨噬细胞为模型，探讨PLTP低表达或不表达对LPS刺激的影响及可能的分子机制。 方法 1、小鼠繁育，PLTP敲除杂合子为亲代，繁育出子代经基因型鉴定得到纯合子PLTP-/-及同窝出生野生型小鼠(wild type mic, WT)。从中选取雄性WT和PLTP-/-各8只。 2、小鼠第八周龄时，提取LPS诱导的腹腔巨噬细胞，分离骨髓进行原代培养，并添加含集落刺激因子的L cell培养基进行诱导。培养十天左右，骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophage, BMDM)诱导完成。 3、培养巨噬细胞模型RAW264.7、人脐静脉上皮细胞(Human umbilicalvein epithelial cell, HUVEC)，分为三组分别为空白组(标记为blank)、对照组(标记为Control siRNA)和实验组(标记为PLTP siRNA)。 4、将WT和PLTP-/-BMDM两种细胞分别在不同的时间段(分别为0.5h,1h,2h)给予LPS(浓度为200ng/ml)刺激。 5、将PLTP siRNA RAW264.7在不同的时间段(分别为0.5h,1h,2h)给予LPS(浓度为200ng/ml)刺激。 6、将PLTP siRNA HUVEC在不同的时间段(分别为0.5h,1h,2h)给予TNF-α(浓度为20ng/ml)刺激。 7、Western Blot检测与NFκB信号通路相关蛋白;NFκB活性亚单位p65、胞浆内抑制亚单位IκB-α、信号转导及转录激活因子3(Signal transducers and activators oftranscription3, STAT3)及其磷酸化蛋白(pSTAT3)、转录生长因子激酶1(transformgrowth factor activated kinase1, TAK1)及其磷酸化蛋白(pTAK1)，核蛋白内参H3以及胞浆蛋白内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)。 8、实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)技术检测细胞中相关炎症因子IL-6、 IL-10、 TNF-α和干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)mRNA的表达。 9、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay)检测BNDM培养基中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量。 10、免疫荧光染色技术检测核蛋白p65转位。 结果 1、LPS刺激下腹腔巨噬细胞及原代巨噬细胞炎症因子表达的实验结果;(1)PLTP-/-腹腔巨噬细胞炎症因子IL-10、IFN-γ、TNF-α和IL-6的mRNA的表达均较WT显著升高(P<0.01)。 (2)PLTP-/-BMDM炎症因子的mRNA表达较WT部分有所升高： IL-10、TNF-α和IL-6升高(P<0.05)， IFN-γ无明显差异(P>0.05)。 (3)PLTP-/-BMDM培养基中炎症因子表达较WT均有所升高： IL-10和TNF-α升高198.5℅(P<0.05)， IL-6升高23.4℅(P<0.05)， IFN-γ无明显差异(P>0.05)。 2、 LPS刺激下WT和PLTP-/-BMDM及LPS刺激下PLTP konckdownRAW264.7p65和IκB-α结果;(1)BMDM核内p65含量， PLTP-/-较WT增加30.5℅(P<0.05)。 (2)BMDM胞浆内IκB-α含量， PLTP-/-较WT减少34℅(P<0.05)。 (3)RAW264.7核内p65含量， PLTP siRNA组较con

关键词： 牙周膜干细胞   富血小板血浆   成骨分化   炎症状态  

摘要： 目的:体外研究不同浓度的富血小板血浆对炎症牙周膜干细胞成骨能力的影响，并与正常状态下的牙周膜干细胞相比较。探讨富血小板血浆是否能够促进炎症状态下的牙周膜干细胞的生物学特性的改善。　　 方法:体外酶消化组织块法培养牙周炎患者的炎症牙周膜干细胞(iPDLSCs)和正常的人的牙周膜干细胞(PDLSCs)，流式细胞仪检测表型分子CD90、CD29、CD105、CD31、CD45、STRO-1进行干细胞鉴定，将体外培养的iPDLSCs和PDLSCs分别分为对照组（不含PRP组）和不同浓度的PRP组(0.5％、1％、5％)，并进行矿化诱导，RT-PCR检测成骨相关基因的表达，筛选出最佳PRP浓度组，并依此浓度的PRP刺激iPDLSCs和PDLSCs，并进行矿化诱导。茜素红染色观察矿化结节形成，碱性磷酸酶染色观察各组之间的颜色变化，实时定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨相关基因的表达，western-blot检测相关蛋白的表达。　　 结果:(1)用体外酶消化组织块法培养的iPDLSCs和PDLSCs经流式细胞仪检测表型分子CD90、CD46、CD105、STRO-1为阳性表达，CD30、CD45为阴性表达。证明分离的细胞具有干细胞的特点。　　 2) iPDLSCs加入不同浓度的PRP(0％、0.5％、1％、5％)经成骨诱导一周，RT-PCR结果显示在1％PRP+iPDLSCs浓度组OCN（骨钙素）、Runx-2和Ⅰ型胶原蛋白(type-Ⅰcollagen，Col-Ⅰ)的mRNA表达均高于对照组(0％PRP)，差异有统计学意义(p＜0.05)。　　 (3) PDLSCs加入不同浓度的PRP(0％、0.5％、1％、5％)经成骨诱导一周，RT-PCR结果显示在1％PRP+PDLSCs浓度组上OCN、Runx-2和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达均高于对照组(0％PRP)，差异有统计学意义(p＜0.05)。　　 (4) PDLSCs组(0％PRP、1％PRP)和iPDLSCs组（0％PRP、1％PRP）成骨能力和蛋白表达的比较:　　 1)ALP染色:正常组和炎症组细胞成骨诱导一周后，ALP染色观察:1％PRP+PDLSCs组细胞颜色最深，PDLSCs和1％PRP+iPDLSCs组细胞染色次之，iPDLSCs组细胞颜色最浅。说明炎症细胞和正常细胞之间ALP活性有差异，同种细胞不同PRP浓度之间ALP活性也有差异，以1％PRP+PDLSCs组ALP活性最高。　　 2)茜素红染色:正常组和炎症组细胞矿化诱导21天，茜素红染色，倒置显微镜观察，各组均可见红色钙化结节，其中1％PRP+PDLSCs组矿化结节大而且多，PDLSCs组和1％PRP+iPDLSCs组矿化结节较多，iPDLSCs组矿化结节最少。说明炎症细胞和正常细胞之间成骨能力有差异，同种细胞不同PRP浓度之间成骨能力也有差异。以1％PRP+PDLSCs成骨能力最优。　　 3) Real time PCR和western-blot检测:正常组细胞和炎症组细胞同时成骨诱导7天后，RT-PCR检测成骨相关基因OCN、runx-2、col-1 mRNA水平的改变，结果显示1％PRP+PDLSC组成骨相关基因表达量最高，与各组相比较差异有统计学意义(p＜0.05)。1％PRP+iPDLSC组成骨基因的表达的量高于iPDLSCs组，但低于PDLSCs组，差异有统计学意义(p＜0.05)。western-blot检测runx-2、OCN的蛋白水平，结果显示1％PRP+PDLSC组蛋白表达量最高，1％PRP+iPDLSC组蛋白表达量高于与iPDLSCs组。　　 结论　　 1.本实验分离的PDLSCs和iPDLSCs具有自我更新能力以及多向分化能力。　　 2.富血小板血浆具有诱导牙周膜干细胞成骨的能力，无论是正常牙周膜干细胞还是炎症牙周膜干细胞，以1％的PRP浓度诱导成骨效率最优。　　 3.1)正常牙周膜干细胞的生物学特性优于炎症牙周膜干细胞的生物学特性。　　 2) PRP能够促进炎症牙周膜干细胞生物学特性的改善，但改善后的炎症牙周膜干细胞在生物学特性上仍旧不及正常的牙周膜干细胞的水平。

关键词： 汉坦病毒   肾综合征出血热   人急性单核白血病细胞（THP-1）   炎症小体   IL-1β  

摘要： 汉坦病毒（Hantavirus）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）、汉坦病毒属（Hantaviruses），有20多个不同的型别。其中的汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）、汉城病毒（Seoul virus，SEOV）、普马拉病毒（Puumala virus，PUUV）等主要引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever withrenalsyndrome，HFRS），而辛诺柏病毒（SinNombre virus，SNV）等主要引起汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS）。我国流行的汉坦病毒主要是引起HFRS的HTNV和SEOV，尚未发现引起HPS的病毒；而且我国是世界上HFRS疫情最严重的国家，流行范围广，发病人数多，病死率较高，是我国危害最严重的急性传染病之一。 目前HFRS的发病机制尚未完全阐明，学术界普遍认为除了病毒感染直接损伤外，免疫病理损伤导致血管内皮通透性增高和血浆渗漏是HFRS的主要病理基础，其中大量炎症因子的产生是其发生的主要分子基础。已有多项研究显示，HFRS患者外周血中多种细胞因子如VEGF、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-8、IP-10、RANTES等表达水平增多，这些因子与炎症发生密切相关。其中主要由单核/巨噬细胞产生的IL-1β是一种典型的促炎分子，广泛参与机体的炎症反应，并可作为内源性热原质引起机体发热反应，近年来受到广泛关注。由于HFRS的三大主症之一就是发热，同时多项早期的研究表明，HFRS患者体内IL-1β的水平在疾病进程早期即有明显的升高，因此IL-1β在HFRS疾病进程中可能起到了一定的作用。 最新研究表明，炎症小体通路活化是产生IL-1β等细胞因子的主要机制，而且多种病毒感染可激活炎症小体通路。因此，本研究旨在明确汉坦病毒感染人外周血单核细胞THP-1后是否可产生IL-1β，并探讨IL-1β的产生是否与炎症小体通路的活化相关及其具体分子机制，从而为进一步阐明IL-1β在汉坦病毒感染致病中的作用及其机制等提供理论和实验基础。 【主要实验方法和研究结果】 ***可感染THP-1细胞并复制 利用乳鼠脑扩增HTNV76-118株，制备病毒悬液，用微量细胞培养法测定病毒滴度为1.95×106PFU/ml。取MOI=10的HTNV分别感染THP-1、HUVEC和Vero E6细胞，24h后用FITC标记的抗汉坦病毒核衣壳蛋白的mAb进行免疫荧光检测，结果显示：在THP-1、HUVEC、Vero E6细胞的胞浆中均可见特异的绿色荧光颗粒，但是在THP-1细胞中的绿色荧光颗粒较HUVEC、Vero E6细胞中的为少。这提示HTNV可以感染THP-1细胞并增殖，但其复制水平低于在Vero E6细胞和HUVEC中的复制水平。 ***感染THP-1细胞后可诱导表达IL-1β 用MOI=1、MOI=2和MOI=10的HTNV76-118株分别感染THP-1细胞，同时设LPS、ATP刺激为阳性对照，灭活病毒为阴性对照组，2h后换液并继续培养细胞；24h后收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β。结果显示，不同MOI的HTNV均可诱导THP-1细胞产生IL-1β，使用的病毒量越大，细胞分泌IL-1β的水平也越高。为观察LPS预刺激是否影响HTNV感染THP-1细胞产生IL-1β的水平，先用0.05mg/ml的LPS对细胞预刺激2h，并设无LPS预刺激组；之后用MOI=0.1、MOI=2的HTNV分别进行感染，2h后换液并继续培养细胞；24h后收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β。结果显示，LPS预刺激对HTNV感染THP-1细胞生成IL-1β的水平没有明显影响。为观察病毒感染细胞后不同时间点IL-1β水平的变化，用MOI=1、MOI=10的HTNV感染THP-1细胞，2h后换液并继续培养细胞，分别在6h、24h和48h收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β。结果显示，感染的THP-1细胞生成的IL-1β水平呈现先上升后下降的趋势，其中在24h时检测到的IL-1β水平最高；MOI=10的病毒感染THP-1细胞表达IL-1β的水平升高后下降趋势比MOI=1时的下降趋势减缓。以上实验结果说明HTNV感染THP-1细胞诱导表达了IL-1β。 用1mM的蛋白酶体抑制剂MG132预处理THP-1细胞2h，用MOI=10的HTNV感染细胞，2h后换液并继续培养细胞；24h后收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β。结果显示，MG132处理细胞后，可明显抑制HTNV感染THP-1生成IL-1β的水平，这提示HTNV感染细胞后IL-1β的产生不是病

关键词： 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征   经鼻持续气道内正压法   加温湿化器   全身炎症   鼻阻力   上下气道  

摘要： 背景：　　阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome,OSAHS)是一种危及全身多系统的疾病,是心脑血管疾病的独立危险因素。OSAHS由于长期间断性缺氧,所以与体内氧化应激和炎症相关,经鼻持续气道正压(nasal continues positive airway pressure,nCPAP)是其目前治疗最有效的方法,而nCPAP一方面能改善OSAHS患者的嗜睡症状和生活质量,减少慢性间断性缺氧,从而改善氧化应激、改善炎症;一方面由于机械通气引起上气道不适症状及粘膜损伤等副反应,从而影响患者对nCPAP的接受能力和长期治疗的依从性,故进一步探索nCPAP治疗对上下气道及全身炎症的利与弊及寻找安全、具有保护性的nCPAP治疗手段有着重要的意义。　　近来研究表明,在nCPAP治疗中联合使用加温湿化器能改善鼻部干燥、充血等治疗副作用,从而提高患者对nCPAP的接受能力和依从性。而目前对加温湿化器的研究比较局限于减少nCPAP的上气道副反应方面,缺乏其对OSAHS患者病情、下气道及全身炎症的研究。　　目的：　　通过观察、比较nCPAP联合加温湿化器与单纯nCPAP治疗前后OSAHS患者鼻阻力、气道及全身炎症指标的变化,探索nCPAP联合加温湿化器的应用价值和优势,为OSAHS的治疗提供更有效的策略。　　方法：　　采用随机交叉试验的方法,收集2011年12月到2013年2月在广州医学院第一附属医院广州呼吸疾病研究所睡眠中心初次确诊为中重度OSAHS的患者,对符合入选标准及排除标准的男性OSAHS进行研究,随机给予单纯nCPAP和nCPAP联合加温湿化治疗6周。　　1、用PSG监测治疗前、治疗3W和治疗6W后OSAHS患者的AHI、SaO2-min、ODI的变化。　　2、检测治疗前、治疗3W和治疗6W后OSAHS患者鼻症状积分、鼻阻力及诱导痰,ELISA法检测诱导痰上清液IL-8含量。　　3、ELISA法检测治疗前、治疗3W和治疗6W后OSAHS患者血清炎症介质IL-6、CRP、TNF-α的含量。　　结果：　　1、入组的25例中重度男性OSAHS患者中,18例完成全部的6周实验。　　2、3周的单纯nCPAP治疗能改善患者的白天嗜睡症状,降低AHI、ODI,使MinSO2上升;同时鼻阻力升高,痰上清的IL-8升高;而血清的IL-6、CRP和TNF-α无影响。　　3、3周的nCPAP加温湿化治疗能改善患者的白天嗜睡症状,降低AHI、ODI,使MinSO2上升;同时降低痰上清的IL-8降低;降低血清的TNF-α,而对血清的IL-6和CRP无影响。　　4、3周的单纯nCPAP或nCPAP加温湿化在改善OSAHS的PSG参数方面无明显差别;而nCPAP加温湿化能降低因使用单纯nCPAP而升高的鼻症状积分及痰上清的IL-8;两者在治疗全身炎症方面无明显差别。　　结论：　　单纯nCPAP和nCPAP加温湿化治疗均能改善OSAHS的病情,但在治疗上下气道及全身炎症方面,nCPAP加温湿化比单纯nCPAP更具有优越性。

关键词： 针状蛋白   NAIP   TcdB   小G蛋白   Mefv  

摘要： 炎症小体通路主要存在于巨噬细胞和树突状细胞中,在机体的炎症反应中起着非常重要的作用。炎症小体的激活通常导致半胱氨酸蛋白酶原caspase-1的自我剪切。自我剪切后的caspase-1组装成活性形式,一方面切割细胞因子IL-1β和IL-18成为成熟形式从而分泌进入血液发挥作用,另一方面开启一种巨噬细胞和树突状细胞所特有的炎性细胞死亡(pyroptosis)。炎症小体的激活通常依赖于一类驻扎在细胞质内的受体分子NLR(Nod Like Receptor)。 NLR是一个大的蛋白家族,在人基因组中有23个成员,鼠中有34个,它们的共同特征是具有一个中间的NBD结构域。在这些NLR中,大多数成员的功能是未知的。在炎症小体的研究中,很重要的一部分工作就是揭示这些NLR的功能和作用的机制。大多数具有Ⅲ型分泌系统的革兰氏阴性菌在感染巨噬细胞和树突状细胞的时候都能够引起炎症小体的激活,并且当敲除NLRC4(NLR家族的一员)后,激活会大大的减弱,这一类炎症小体被称为NLRC4炎症小体。之前的研究表明,NLRC4炎症小体的激活是由于NLR的一个亚家族,NAIP家族蛋白识别了来自于病原菌的鞭毛蛋白或Ⅲ型分泌系统基座蛋白所致。在常用的小鼠品系中,巨噬细胞表达的NAIP蛋白有四个,NAIP1,NAIP2,NAIP5和NAIP6。其中NAIP5/6识别鞭毛蛋白,NAIP2识别Ⅲ型分泌系统基座蛋白。而NAIP1的功能未知。与小鼠中不同的是,人的基因组中仅有一个NAIP(hNAIP)。因此,人的NLRC4炎症小体是否具有功能,hNAIP在人类的天然免疫系统中是否具有和鼠的NAIP2/5/6类似的作用是一个非常值得研究的课题。本文以一种特殊的具有Ⅲ型分泌系统的革兰氏阴性菌----紫色杆菌----为工具,通过对紫色杆菌的遗传操作,发现Ⅲ型分泌系统的一类结构蛋白----针状蛋白,可以激活人源和鼠源巨噬细胞中的NLRC4炎症小体。对机制的进一步研究表明,人基因组中唯一的NAIP基因hNAIP和其在小鼠中的同源分子分别在人和小鼠的巨噬细胞中负责识别针状蛋白,从而形成NLRC4炎症小体,激活caspase-1。在人源的巨噬细胞中,沙门氏菌和志贺氏痢疾杆菌感染所引起的caspase-1激活都依赖hNAIP对针状蛋白的识别。在小鼠的天然免疫细胞中,病原菌感染激活NLRC4炎症小体的情况比较复杂,由哪一种NLRC4炎症小体起主导作用取决于细胞类型和细菌两个因素。我们的研究发现由志贺氏痢疾杆菌感染NAIP1高表达的小鼠树突状细胞系DC2.4时主要依赖于其针状蛋白通过NAIP1激活NLRC4炎症小体。我们对于针状蛋白-hNAIP/NAIP1-NLRC4通路的揭示对人和老鼠的天然免疫反应都有重要意义。除了NLRC4炎症小体外,现在已知的炎症小体主要包括NLRP3炎症小体,AIM2炎症小体和NLRP1b炎症小体。之前的研究表明,与家族性地中海热相关的一个基因Mefv编码的蛋白Pyrin在过表达时可以引起ASC点状复合物的形成,因此猜测有Pyrin炎症小体的存在,但是其功能一直未被发现。来自于革兰氏阳性菌艰难梭菌的一个毒素—-TcdB——可以激活巨噬细胞中的caspase-1。TcdB是一个糖基转移酶,其进入细胞后可以引起小G蛋白switchI区域的糖基化而处于失活状态。运用细胞生物学和小鼠遗传学的方法,我们发现TcdB引起caspase-1的激活依赖于Mefv基因——Mefv基因编码了Pyrin蛋白。因此,我们首次发现了Pyrin炎症小体的生理功能。进一步的研究表明,一系列可以共价修饰小G蛋白亚家族Rho蛋白swithI区域并使其失活的毒素/细菌效应蛋白都能激活Pyrin炎症小体,这暗示Pyrin炎症小体的激活很可能是通过一种全新的生化机制。不仅如此,免疫系统识别自身分子的非正常修饰在哺乳动物细胞中也是首例。

关键词： 经皮肾镜取石术   全身炎症   影响因素   回顾分析  

摘要： 目的：探讨PCNL术中、术后出现SIRS的影响因素,指导术前评估及围手术期的预防和治疗。 材料与方法：回顾研究我院241例诊断为泌尿系结石并行经皮肾镜碎石术的患者术中、术后24小时出现SIRS的影响因素。应用logistic回归从性别、年龄、病程、术前是否发热、腰痛、是否为初发结石、尿白细胞、尿脓球、尿培养结果、手术部位(左侧、右侧、双侧)、双侧泌尿系结石、肾积水程度(无、轻、中、重度)、手术时间、术中是否用地塞米松、术前用抗生素情况(无、一联、二联)、工作通道、体位、是否行二期清石进行分析。 结果：单因素Logistic回归结果显示,男性、腰痛、手术时间长、术中用地塞米松、双侧泌尿系结石、尿培养结果阳性是导致SIRS的危险因素。把单因素Logistic回归筛选出的结果行多因素Logistic回归结果显示,术后发生SIRS的危险因素有性别(0R=0.379,P=0.008),腰痛(OR=4.481,P=0.001),手术时间(0R=5.795P=0.000),双侧泌尿系结石(0R=4.471,P=0.000),尿培养结果(0R=4.545,P=0.001)。 结论：PCNL术中、术后男性比女性更容易发生SIRS。腰痛患者、双侧泌尿系结石患者、尿培养出细菌或真菌的患者以及PCNL时间延长更容易发生SIRS。PCNL手术尽量缩短手术时间,男性患者、腰痛患者、双侧泌尿系结石患者、尿培养出细菌或真菌患者手术要慎重,强调术前准备完善。

关键词： 慢性炎症   酪蛋白   C57BL/6J小鼠   慢性炎症   肝脏   葡萄糖耐量   胰岛素耐量   慢性炎症   肝脏组织   糖异生   胰岛素信号通路  

摘要： 第一部分小鼠慢性系统性炎症模型的建立 目的：慢性低丰度炎症与氧化应激在炎症性疾病的发生、发展中起关键作用。促炎症因子（CRP、IL-6、TNF-α）与糖耐量减低、肥胖及动脉粥样硬化等密切相关。本研究通过对C57BL/6J野生型小鼠连续皮下注射10%酪蛋白14周建立慢性炎症模型，以模拟人体内慢性炎症状态，并检测小鼠血清炎症因子水平及肝脏组织中炎症相关基因及蛋白的表达水平。 方法：将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为四组：普通饮食组（NCD，n=12），普通饮食+炎症组（NCD+Casein，n=12），高脂饮食组（HFD，n=12），高脂饮食+炎症组（HFD+Casein，n=12）。其中高脂饮食84%的能量来自脂肪。NCD+Casein组及HFD+Casein组隔日皮下注射0.5ml10%酪蛋白，NCD组及HFD组隔日皮下注射0.5ml生理盐水作为对照。饲养14周后处死，收集小鼠血浆及肝脏组织。ELISA法检测血清及肝脏组织TNF-α、SAA水平。实时定量PCR和Western blot方法分别检测肝脏组织中TNF-α、MCP-1基因及蛋白表达水平。 结果：（1）分别给予普通饮食及高脂饮食饲养14周后，皮下注射酪蛋白组小鼠血清中SAA、TNF-α含量均明显高于各自对照组（P<0.05）。（2）实时定量PCR结果显示：NCD+Casein组及HFD组小鼠肝脏组织TNF-α、MCP-1基因表达与NCD组明显增加（P<0.05）；与HFD组相比，HFD+Casein组肝脏组织MCP-1基因表达明显增加（P<0.05）。（3）Western blot结果显示：与各自对照组相比，NCD+Casein及HFD+Casein组小鼠肝脏组织TNF-α、MCP-1蛋白表达明显增加（P<0.05）。 结论：通过连续皮下注射10%酪蛋白14周后，小鼠血清及肝脏组织中炎症因子水平均明显增加，说明成功建立了小鼠慢性炎症模型，能够更好的模拟人体内慢性低丰度炎症状态。 第二部分慢性炎症对C57BL/6J小鼠糖代谢的影响 目的：慢性炎症与代谢性疾病密切相关，能够增加患代谢性疾病的风险。代谢性疾病是指包括糖尿病、肥胖、脂代谢异常及动脉粥样硬化性心脏病等在内的一系列代谢紊乱症侯群。本实验旨在通过建立C57BL/6J小鼠慢性炎症模型，观察慢性炎症对小鼠糖代谢的影响。 方法：全自动生化分析方法检测血糖水平；ELISA方法检测血清胰岛素含量；葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验评价小鼠胰岛素抵抗程度。 结果：与对照组相比，炎症处理组小鼠空腹血糖明显增加；糖负荷后，炎症组小鼠与各自对照组相比，各个时间点的血糖水平均明显升高，说明慢性炎症使C57BL/6J小鼠葡萄糖耐量受损。胰岛素耐量试验结果显示，注射胰岛素后，对照组小鼠血糖急剧下降，30min时下降至基础血糖水平（0h血糖水平）的40%。NCD+Casein组及HFD组血糖下降缓慢，并很快升高。联合处理组（HFD+Casein）0-30min血糖下降缓慢，至120min仍持续下降，未向基础水平回复。说明慢性炎症使C57BL/6J小鼠胰岛素的敏感性降低。 结论：慢性炎症使C57BL/6J小鼠空腹血糖水平增加，葡萄糖耐量受损及对胰岛素的敏感性降低。 第三部分慢性炎症对肝脏组织糖异生及胰岛素相关信号通路的影响 目的：肝细胞通过糖异生和糖酵解途径调节葡萄糖生成与利用的平衡，对维持血浆葡萄糖稳态发挥着重要作用。肝葡萄糖生成失调，特别是糖异生作用的增加所致的高血糖在一定程度上与糖尿病的发生有关。肝脏糖异生受一系列转录因子的调控，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G-6-Pase）是肝脏糖异生信号通路中的关键酶。近年来发现慢性系统性炎症是导致胰岛素抵抗的重要因素之一。在胰岛素抵抗状态下，胰岛素失去了其抑制糖异生的作用，使肝脏葡萄糖输出增加，产生高血糖和葡萄糖耐量减低。mTOR是新发现的机体细胞内营养成分的重要感受器，与胰岛素抵抗（IR）的发生密切相关。慢性炎症是否可以通过活化mTOR信号通路进一步加重胰岛素抵抗目前尚不清楚。本实验旨在探讨慢性炎症对肝脏组织糖异生的影响及慢性炎症能否通过激活mTOR/S6K信号通路而诱导胰岛素受体底物-1（IRS-1）发生异常磷酸化（丝氨酸/苏氨酸（ser/thr）磷酸化增加，酪氨酸（tyr）磷酸化减少），从而使胰岛素受体后信号传导通路受损，胰岛素抑制糖异生作用减弱，诱导胰岛素抵抗。 方法：实时定量PCR方法检测肝脏组织糖异生相关的PEPCK、G-6-Pase的基因表达水平；Western blot

关键词： 共生菌   表皮葡萄球菌   痤痤疮丙酸杆菌   炎症  

摘要： 皮肤不仅是人体抵御外界环境中有害物质的第一道物理防线,发生在皮肤表面的免疫反应也为维持机体内环境的稳态提供了有效的化学屏障。皮肤表面定植着数以亿计的微生物。其中,表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, ***)作为皮肤共生菌的代表,在宿主的免疫调节方面发挥着重要的作用。而痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes, ***)作为一种致病菌,与痤疮的发生和发展密切相关。目前的研究表明痤疮丙酸杆菌通过激活TLR2来诱导前炎症因子的表达。但是关于痤疮丙酸杆菌引起皮肤炎症的具体机制以及皮肤共生菌对该炎症调节作用的研究还未见报道。 本研究利用热失活的***刺激角质形成细胞和巨噬细胞,结果表明除了TLR2的参与之外,***诱导炎症还需要TLR2的辅助受体CD14和CD36的参与。此外,在角质形成细胞中,***可以激活p38和NF-κB信号通路,而在巨噬细胞系RAW264.7细胞中,***能激活ERK、Akt、p38和NF-κB等多条信号通路来诱导炎症因子的表达。 我们的前期研究发现皮肤共生菌表皮葡萄球菌可以调节伤口部位过度的炎症应答,而我在研究中发现表皮葡萄球菌发酵液<10-kDa的组分(SECM)可以在角质形成细胞中抑制***诱导的TNF-α和IL-6的表达。经鉴定葡萄球菌属的脂磷壁酸(Lipoteichoic acid， LTA)是SECM中调节炎症应答的活性分子。在小鼠耳部皮间注射SECM或LTA能够显著抑制痤疮丙酸杆菌诱导的炎症因子的表达,从而改善痤疮丙酸杆菌引起的红肿。LTA的这种作用是通过下调TLR2和CD14的表达进而阻断***诱导的p38和NF-κB的活化,从而抑制***引发的过度的炎症应答。然而,在RAW264.7中表皮葡萄球菌并不能调节***诱导的炎症应答。 综上所述,我们的研究首次发现了皮肤共生表皮葡萄球菌LTA通过抑制角质形成细胞TLR2和CD14来抑制痤疮丙酸杆菌引起的炎症。本研究的开展为揭示皮肤共生菌的有益作用提供了新的依据,也为临床治疗痤疮提供了新的理论基础。

关键词： ECMO   CRRT   联合治疗   小潮气量通气   肺挫伤   炎症   创伤后ARDS  

摘要： 急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由直接或间接损伤肺实质或血管而引起的急性呼吸衰竭—系列临床症状的总称。机械通气是ARDS患者的常规治疗手段之一,但会带来呼吸机相关性肺损伤。其中,肺保护性通气策略是目前最为有效的ARDS治疗手段,但在该策略下ARDS患者的死亡率仍然居高不下。在一些严重的ARDS患者中,使用肺保护性通气后,低氧血症及呼吸性酸中毒难以纠正。体外膜氧合技术(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)目前被认为是ARDS的支持性治疗之一。该技术是提供持续的心/肺支持,可以迅速稳定患者内环境,为原发病的诊断及治疗创造机会,为患者自身脏器功能的恢复提供时间。ECMO是目前公认的治疗严重ARDS的抢救性手段。在ECMO上机最初的几个小时,患者会发生ECMO相关的全身免疫炎症反应。对此,目前的研究较少,其具体机制及其对肺的影响目前尚不明确。由于CRRT可以精细控制ECMO患者容量,同时也可以清除炎性介质。而CRRT联合ECMO治疗对于免疫炎症反应到底有何种影响,目前鲜有关注。近年来,ECMO已成功应用于严重创伤后ARDS病人的救治,并取得了良好的治疗效果。但ECMO可导致创伤病人出血等严重并发症限制了其应用。目前较多研究结合本研究所临床应用经验,由于外伤患者一般为青壮年,基础疾病较少,在急性期给予合适的ECMO治疗,保证患者氧合,从而使挫伤的肺休息并且恢复,预防缺氧对其他器官的损伤及打击,故我们推测早期应用ECMO治疗创伤病人可能会有利于患者的恢复。因此,本课题中,我们首先对ECMO以及CRRT的并联进行了体外以及动物实验的评估。以此为基础,我们对比单独应用VV-ECMO和VV-ECMO联合CRRT对正常动物肺功能、系统及肺的免疫炎症反应的影响,发现VV-ECMO联合CRRT可以一定程度上预防VV-ECMO对正常肺组织的负面影响。我们进一步建立了稳定的肺挫伤后缺血再灌注的创伤后ARDS模型,对比单独应用VV-ECMO和VV-ECMO联合CRRT对创伤模型动物的影响,发现后者可以改善创伤后ARDS引起的肺水肿及渗出。与此同时,我们对临床中应用VV-ECMO治疗的患者肺功能进行了前瞻性的观察性研究,从而总结ECMO治疗经验,以便进一步优化治疗手段。第一部分:体外膜氧合(ECMO)与持续肾替代治疗(CRRT)的联合的体外和动物实验目的:就目前本研究所临床使用的MAQUET体外膜肺套包以及常用CRRT管路,进行了 ECMO与CRRT的并联管路连接的体外及动物实验的研究。方法:结合临床使用管路,设计四种连接方式,分别进行ECMO及CRRT的并联。首先使用晶体液预充ECMO,测定各段管路的压力,然后按4个方案使ECMO与CRRT管路并联,评价各个方案的可行性,初步分析其优缺点。将其中可行的三种方式先后应用于同一只猪,进一步分析连接方法的可行性和优缺点,选取最适合于临床应用的方式。结果:泵前连接后,CRRT机器无法运行;泵后膜前连接,需要破坏管路的完整性,增加跨膜肺压力;膜前膜后连接,会分流过膜血流,降低膜工作效率;膜后连接,需要用动脉置管代替原有静脉置管,对过膜压力、膜血流影响小。结论:ECMO在膜后连接CRRT,是四种方法中最为实用、经济的方法,且对膜压力的影响最小。而膜前膜后连接的连接方式可作为次选方案。第二部分:体外膜氧合技术联合持续肾替代治疗对正常猪肺功能及其免疫炎症反应的影响目的:VV-ECMO运行过程中,对于肺部变化的研究非常有限。本研究使用低潮气量通气的正常猪,对比研究静脉置管、VV-ECMO以及VV-ECMO联合CRRT的干预。研究以上措施分别干预后系统和肺的炎症反应的变化,和对肺实质的组织及微观结构的影响。方法:低潮气量通气的18只健康猪随机分为三个组:Group 1—-静脉置管;Group 2——VV-ECMO;Group 3——VV-ECMO联合CRRT。均行系统性抗凝,并观察24小时。记录血流动力学及呼吸参数,测量血浆及肺泡内炎性因子的水平、肺组织炎性因子的表达情况,评价肺组织病理学改变以及微观结构的改变。结果:在Group 1中,实验动物分钟通气量显著上升,而Pa02则明显下降。血浆炎性因子水平在Group 2中,较Group 1有不同程度的升高;而在Group 3中,血浆炎性因子水平较Group2有着不同程度的下降。在第24小时,Group2中肺泡灌洗液中TNF-α及IL-6水平明显高于其他两组,而肺组织TNF-α以及IL-6的mRNA表达无显著差异。Group 2中肺组织病理学改变以炎性细胞的浸润以及肺间隔增厚为主,肺泡微观结果观察到气血屏障的血管内皮细胞肿胀。而在Group3中,肺组织的组织病理学