关键词： 高糖环境   巨噬细胞   线粒体应激   环鸟苷酸-腺苷酸合成酶   Ⅰ型干扰素  

摘要： 目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病患者最严重并发症之一,同时也是终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的最主要原因。目前DN的发病机制尚未完全阐明,大量研究证实巨噬细胞活化在糖尿病肾病进展中扮演着重要的角色。cGAS是一种胞质DNA传感器,可通过活化cGAS-STING信号通路使下游分子TBK1及IRF3磷酸化并产生Ⅰ型干扰素(如IFN-β)。IFN-β虽然在介导先天性免疫应答中起着重要作用,但IFN-β的上调也可促进炎症反应。近来研究发现,巨噬细胞于高糖环境下可发生线粒体应激,可能导致线粒体DNA(mtDNA)进入胞质中。根据这一特性,巨噬细胞于高糖环境下是否可以通过cGAS-STING信号通路产生Ⅰ型干扰素尚需进一步验证。本研究拟通过体外培养RAW264.7细胞,探讨cGAS-STING信号通路在高糖环境下巨噬细胞活化中的作用,为利用cGAS-STING信号通路调控巨噬细胞活化状态来防治疾病的发生和发展提供可能。 方法:通过高糖诱导,构建糖尿病巨噬细胞活化的体外模型,从细胞水平揭示cGAS-STING信号通路在糖尿病巨噬细胞活化过程中的重要作用。采用CCK8法检测最佳药物干预浓度,将适宜浓度的STING抑制剂C-176、cGAS抑制剂RU.521及线粒体抗氧化剂Mito-TEMPO分别作用于高糖环境下的小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过Western blot法及RT-PCR法检测不同干预下细胞中炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IFN-β)、促纤维化因子(TGF-β)及 cGAS-STING信号通路中各因子(cGAS、STING、p-TBK1、p-IRF3)蛋白及基因表达情况。利用荧光探针标记法检测细胞线粒体ROS含量。通过胞质裂解液及DNA提取试剂盒提取不同干预组中胞质DNA,采用RT-PCR法检测不同干预下胞质中mtDNA的含量,从而验证高糖环境下巨噬细胞活化模型中是否存在cGAS-STING信号通路的介导。 结果:高糖促进了 RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β、IFN-β及TGF-β的表达,而对照组和等渗甘露醇组之间无明显差异,排除了高渗效应。同时也证明了p-TBK1及p-IRF3参与了高糖环境下RAW264.7细胞的活化。根据CCK8检测结果,将适宜浓度C-176和RU.521干预高糖环境下的RAW264.7细胞后可明显抑制cGAS-STING信号通路中下游因子的表达。免疫荧光检测结果提示高糖可诱导线粒体ROS含量增加,且RT-PCR结果提示高糖环境下胞质中mtDNA高表达,说明高糖环境下RAW264.7细胞线粒体应激,使mtDNA进入胞质中,而适宜浓度的Mito-TEMPO则可保护线粒体免受ROS的伤害,避免mtDNA进入胞质,同时也抑制了 cGAS-STING信号通路中各因子的表达。 结论:1.高糖环境可活化巨噬细胞促进IFN-β等炎性因子及促纤维化因子TGF-β的表达;***-STING信号通路参与了高糖环境下巨噬细胞的活化;3.高糖环境下巨噬细胞线粒体ROS增多,即线粒体应激,导致mtDNA进入细胞质,进而激活cGAS。故cGAS-STING信号通路可能为延缓糖尿病肾病进展提供新的思路或方向。

关键词： 支气管哮喘   气道炎症表型   异质性   安喘颗粒   网络药理学   UPLC-Q-TOF/MS   分子机制  

摘要： 背景:支气管哮喘是呼吸系统常见病,也是一种复杂难治的气道疾病。现代医学研究进展表明,哮喘的复杂难治在于本病具有异质性的特点,存在不同的气道炎症表型[1]。因此,对于哮喘患者不同气道炎症表型的研究成为当今热点,并为未来哮喘的精准化治疗提供依据。安喘颗粒由炙麻黄、巴戟天、灵芝、乌梅、葶苈子、苦参、老鹳草、甘草8味中药组成,是临床长期使用并证实有效的中药复方,已经制作成院内制剂供临床使用。前期临床研究证实安喘颗粒对支气管哮喘急性发作具有良好治疗作用。前期实验研究证实安喘颗粒可调节卵清蛋白(OVA)小鼠辅助性T淋巴细胞2(Th2)、调节性T细胞(Treg)亚群水平,进而减少OVA小鼠气道白细胞介素4(IL4)、白细胞介素5(IL-5)产生,减少嗜酸细胞等炎症细胞的激活,起到缓解气道炎症的作用。但是,哮喘的气道炎症具有异质性,安喘颗粒对不同气道炎症表型患者的临床治疗作用是否存在差异尚不能确定,需要进一步临床研究来证实。同时,安喘颗粒作为中药复方,具备多化合物-多靶点-多途径的特点,对于安喘颗粒组成的主要化合物以及免疫靶点网络进行研究可有助于探明其分子机制。同时,有必要建立OVA哮喘小鼠模型进一步深入研究安喘颗粒治疗气道炎症的分子机制。目的:本文旨在从临床研究、网络药理学研究、物质基础研究、分子机制研究四个方面,进一步探讨安喘颗粒在支气管哮喘急性发作期的治疗作用,并分析其作用靶点、化学组分以及分子机制。为进一步观察安喘颗粒对于不同气道炎症表型的哮喘病人的治疗作用,本研究设计前瞻性病例对照研究,观察其是否存在疗效差异。同时,使用网络药理学的方法进行靶点分析,使用超高效液相串联四极杆飞行时间质谱技术(UPLC-Q-TOF-MS/MS)对安喘颗粒的化学成分进行定性分析,建立OVA哮喘小鼠模型进一步深入研究安喘颗粒治疗气道炎症的分子机制。方法:1.临床研究:本研究采用前瞻性病例对照研究,筛选江苏省中西医结合医院2015年01月-2019年12月在门诊因支气管哮喘急性发作(轻、中度)就诊的患者80例,年龄18-70岁,辨证分型为风寒哮,根据诱导痰细胞分类分为4组,分别为嗜酸性粒细胞型组、中性粒细胞型组、混合粒细胞型组和寡粒细胞型组。每组20例。2周为1疗程。每组均给予服用安喘颗粒(1次1包,每日3次),同时使用布地奈德/福莫特罗(阿斯利康公司生产,160μg/4.5μg*60吸,每次1吸,每日2次)作为支气管哮喘的基础治疗,按需使用硫酸沙丁胺醇气雾剂(葛兰素史克公司生产,100μg/揿,200揿/只)。治疗前后分别记录患者中医临床证侯评分和肺功能指标。肺功能包括:第一秒用力呼气容积占预计值的比值(FEV1%)、第一秒钟用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)、呼气流量峰值(PEF)、25%肺活量最大呼气流量(MEF25)、50%肺活量最大呼气流量(MEF50)、75%肺活量最大呼气流量(MEF75)。采用统计学方法研究各组治疗前后的中医临床证候评分、各项肺功能指标的变化,比较4组间是否存在统计学差异(P<0.05为具有显著性差异)。2.网络药理学研究:本研究基于网络药理学的方法来阐明安喘方治疗哮喘的潜在的多组分、多靶点、多途径的作用模式。首先通过中国科学院化学数据库(CASC)、中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)和相关文献提取安喘方组成数据,建立成分数据库。通过口服利用度(OB)与药物相似性(Drug-likeness,DL)参数筛选出安喘方组成的候选化合物。然后通过整合化学,基因组学等信息推测候选化合物的可能靶点。在马六甲人类疾病数据库(https://***)等5个数据库中收集哮喘已知靶点。使用Cytoscape软件建立安喘方治疗哮喘的候选化合物和候选靶点的网络图。然后将候选化合物的候选靶点与哮喘的已知靶点进行交集及拓扑学参数分析,筛选得出安喘方治疗哮喘的核心靶点,进一步使用Omicshare工具进行基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,筛选出主要的生物学过程和信号通路。3.安喘颗粒物质基础研究:本研究应用UPLC-Q-TOF/MS技术,将安喘颗粒水提取液进样测定,采取正、负离子模式,通过质谱检测器捕获分子离子峰、化学物质保留时间、元素组成、精确分子量、误差范围等结构信息、以及二级质谱提供的碎片信息,结合文献报道和已知对照品的质谱裂解规律,鉴定和推测样品中的色谱峰。4.安喘颗粒对小鼠气道炎症影响的实验研究:用卵清蛋白(OVA)建立小鼠哮喘模型,分成4组,包括空白对照组、模型组、地塞米松组(1mg/kg/d)和安喘颗料组(2.25g/kg/d),每组8只。观察用药

关键词： PD-1抑制剂   放射治疗   免疫炎症反应   心肌损伤  

摘要： 目的:PD-1抑制剂联合放疗可协同活化T淋巴细胞,增强抗肿瘤效应。但联合胸部放疗有加重放射性心肌损伤的风险。本课题通过构建小鼠放射性心肌损伤(Radiation Induced Heart Disease,RIHD)模型,观察PD-1抑制剂对RIHD的影响,并从免疫微环境的角度初探其潜在机制。方法:将20只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组5只;A组为对照组;B组为PD-1抑制剂组;C组为心脏照射组,心脏单次照射15 Gy;D组为心脏照射+PD-1抑制剂组,心脏照射方法同C组,PD-1抑制剂给药方法同B组。照射后1个月麻醉处死小鼠,留取心脏组织。HE染色观察心肌组织形态学改变;Masson染色并计算心肌胶原容积分数(CVF)评估心肌纤维化情况;流式细胞术检测心肌CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴细胞亚群;流式CBA法检测心肌组织细胞因子(IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1、IFN-γ)水平;TUNEL检测心肌细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数(AI)。结果:照射后1个月,HE染色B组未见明显心肌损伤,C组和D组可见心肌细胞水肿、断裂,且D组损伤重于C组。Masson染色,B组未见明显的心肌纤维化表现,C组和D组可见胶原纤维分布于心肌细胞间质。半定量分析结果显示A、B、C和D各组心肌胶原容积分数(CVF)分别为(1.97±0.36)%、(2.83±1.03)%、(5.39±0.77)%、(7.72±1.43)%,A组与B组间的CVF相似(P=0.314),其余各组间相互比较CVF差异均有统计学意义(P<0.05)。A、B、C和D组的CD3+T淋巴细胞百分比分别为(9.32±1.05)%、(15.90±1.55)%、(15.8±0.67)%和(23.17±3.33)%,各组CD3+T淋巴细胞绝对值分别为(114±8)个/ul、(142±10)个/ul、(166±4)个/ul、(213±10)个/ul。与A组比较,B、C及D组的CD3+T淋巴细胞的绝对值和百分比均增高(P<0.01),D组高于B组和C组(P<0.001)。各组间CD3+CD4+T淋巴细胞百分比及绝对值相近,组间比较差异无统计学差异(P>0.05)。各组CD3+CD8+T淋巴细胞百分比分别为(34.32±2.30)%、(33.72±2.26)%、(41.12±1.81)%、(56.47±3.13)%,B组(P=0.758)、C组(P=0.432)与A组百分比相近,且D组高于A组、B组和C组(P<0.001)。CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值分别为(21±2)个/ul、(62±3)个/ul、(89±2)个/ul、(129±7)个/ul,与A组比较,B组(P<0.001)、C组(P<0.001)及D组(P<0.001)的CD3+CD8+T淋巴细胞绝对数增高,D组也高于B组(P<0.001)和C组(P<0.001)。A、B、C和D组IL-6表达水平分别为(27.67±4.33)pg/ml、(79.52±3.83)pg/ml、(129.91±14.92)pg/ml和(207.18±6.43)pg/ml,IL-17A表达水平分别为(1.33±0.97)pg/ml、(20.26±3.49)pg/ml、(54.75±6.98)pg/ml和(122.21±4.80)pg/ml,TGF-β1表达水平分别(95.51±4.34)pg/ml、(180.78±4.33)pg/ml、(373.28±5.32)pg/ml、(543.63±7.63)pg/ml,D组的IL-6、IL-17A、TGF-β1水平均高于A组,差异有统计学意义(P值均<0.001)。各组凋亡指数分别为(2.16±0.22)%、(5.03±0.24)%、(9.37±0.35)%、(15.62±0.48)%,各组间相互比较凋亡指数差异均有统计学意义(P<0.001)。结论:PD-1抑制剂可通过促进心肌免疫炎症反应加重RIHD,心肌中CD3+CD8+T淋巴细胞浸润及细胞因子IL-6、IL-17A、TGF-β1构成的免疫炎症微环境在PD-1抑制剂加重RIHD中起着重要作用。

关键词： 老年弥漫大B细胞淋巴瘤   全身免疫炎症指数   预后  

摘要： 研究目的:本文旨在探究全身免疫炎症指数(Systemic Immune-inflammation Index,SII)对老年弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL)患者的预后价值。材料和方法:收集了就诊于浙江大学医学院附属第二医院血液内科的224例初诊的年龄≥60岁的DLBCL患者,应用ROC曲线确定SII的截断值,应用SPSS 25.0软件,采用卡方检验比较SII与患者临床特征的关系。Kaplan-Meier分析绘制生存曲线,用log-rank秩检验进行单因素分析,通过COX回归模型进行多因素分析评估预后相关因素。应用R 3.6软件计算时间依赖的ROC曲线、曲线下面积及C指数比较各个炎症指标的预后价值。研究结果:SII的最佳截断值为888.72,SII升高与患者乳酸脱氢酶水平升高、Ann-arbor分期较晚,较差的体能分级,多个结外器官累及和较高的IPI评分有关。通过生存分析发现,低SII患者(n=141)3年总体生存率(Overall Survival,OS)为82.5%,高SII患者(n=83)的3年OS为51.9%,低SII组的OS显著高于高SII组的患者(P<0.001)。低 SII 患者(n=141)3 年无进展生存率(Progression-free Survival,PFS)为67.3%,高SII患者(n=83)的3年PFS为41.3%,低SII组的PFS显著高于高SII组的患者(P<0.001)。多因素分析显示 IPI>3(HR:2.591,P=0.028)和 SII≥888.72(HR:3.932,P=0.041)是 OS 的独立预后因素,仅 IPI>3(HR:2.307,P=0.005)是PFS的独立预后因素。将IPI及SII联合形成新型预测因子,根据预测因子将患者分为3组,各组间的OS均有显著差异(P<0.05),且新型预测因子的C指数(0.727 vs.0.677)及对1年、3年及5年的总体生存率预测的AUC值均大于IPI评分。结论:SII是一项简便易行的临床指标,高SII患者生存期显著低于低SII患者,联合SII和IPI在对老年DLBCL患者的预后预测上明显优于IPI单独使用。

关键词： 缺血性中风   Th17细胞   Treg细胞   免疫炎症反应   通脉舒络胶囊   炎症反应  

摘要： 目的：　　通过建立大脑中动脉栓塞大鼠模型，观察缺血性中风后24小时、3天、7天、14天大鼠脑及脾脏中辅助性T细胞17（Th17）与调节性T细胞（Treg）所参与的免疫炎症反应以及通脉舒络胶囊对于缺血性中风后脑损伤的干预作用，探讨通脉舒络胶囊是否可以通过影响神经局部及外周免疫中Th17/Treg细胞亚群功能的失衡状态，改善相关脑缺血后神经炎症及外周炎症，以达到神经保护的作用，为缺血性脑卒中的治疗提供新思路。　　方法：　　选用健康成年雄性SD大鼠，通过建立大脑中动脉栓塞大鼠模型及通脉舒络胶囊灌胃处理将其分为5组，包括假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。各组大鼠分别于脑缺血再灌注后24小时、3天、7天及14天四个时间点进行神经功能缺损评分;用HE染色观察各组大鼠缺血脑组织及脾脏组织病理形态变化;用ELISA法测定脑、脾脏中Treg细胞特异性转录因子Foxp3及其分泌的炎性因子IL-10、Th17细胞特异性转录因子RORγt及其分泌的炎性因子IL-17含量。　　结果：　　1.神经功能缺损评分:I/R24h、3d、7d、14d时，各假手术组大鼠神经功能缺损评分均为0分;模型组神经功能缺损评分与假手术组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。I/R24h时，各治疗组与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;I/R3d至14d时，低、中、高剂量组与模型组的神经功能缺损评分差异有统计学意义(P＜0.05)，其中中剂量组疗效最为显著（P＜0.01）。　　2.脾质量指数：I/R24h时，模型组大鼠脾质量指数与假手术组比较无统计学意义(P＞0.05)，各剂量组与模型组比较也无明显差异（P＞0.05）;I/R3d至14d时，模型组大鼠脾质量指数与假手术组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），中剂量组大鼠脾质量指数与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　3.病理组织学变化:与假手术组正常海马及脾脏组织细胞形态相比，模型组大鼠海马CA1区表现为组织结构紊乱，呈现出区域性溶解、肿胀等坏死特征，空泡样改变明显，炎性细胞浸润现象明显。脾实质内白髓、红髓分布不清晰，生发中心显著缩小，轮廓不清，有些甚至不能形成生发中心，只是淋巴细胞的松散聚集。通过通脉舒络胶囊给药7d以后，可以观察到海马CA1区炎性细胞损伤现象有所缓解，细胞排列较整齐，间质水肿程度减轻，细胞皱缩畸形、胞核固缩深染等表现明显减轻;脾脏白髓体积变小、数目减少，淋巴细胞浸润也明显改善，几乎无红髓堵塞充血和生发中心生成，其中中剂量组改善最为显著。　　4.脑组织匀浆中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17含量:与假手术组相比，模型组大鼠脑内Foxp3、IL-10含量在造模后24h降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），3d后逐渐升高，与假手术组相比差异无统计学意义（P＞0.05），7d时模型组大鼠脑内Foxp3、IL-10含量对比假手术组明显升高（P＜0.01），14d时与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;模型组脑内RORγt、IL-17含量在造模后逐渐升高，在24h时高于假手术组，差异具有统计学意义（P＜0.01），在I/R第3d时升至高峰，第7d、14d时模型组的含量仍显著高于假手术组（P＜0.01）;通脉舒络胶囊中剂量组大鼠脑内Foxp3、IL-10、RORγt、IL-17含量与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。　　5.脾脏组织匀浆中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17含量：与假手术组比较，在造模后24h，模型组大鼠脾脏内Foxp3、IL-10含量有所降低（P＜0.01），3d后逐渐升高,与假手术组相比差异无统计学意义（P＞0.05），7d时模型组大鼠脾脏内Foxp3、IL-10含量对比假手术组明显升高（P＜0.01），14d时与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;模型组脾脏内RORγt、IL-17含量在造模后逐渐升高，第24h、3d、7d、14d的含量均显著高于假手术组（P＜0.01），其中I/R3d时含量最高;通脉舒络胶囊中剂量组大鼠脾脏中Foxp3、IL-10、RORγt、IL-17含量与模型组比较有显著差异（P＜0.01）。　　结论：　　脑缺血后出现Th17/Treg细胞功能失衡，局部及外周免疫炎症反应被激活。通脉舒络胶囊可能通过抑制脑缺血后局部脑组织及外周脾脏的免疫炎症反应和抑制炎性细胞因子的产生，提高脾质量指数，改善缺血性中风引起的Th17/Treg细胞亚群功能的失衡状态，来发挥其神经保护作用。

关键词： 脑缺血   香椿子提取物   NLRP3炎症小体  

摘要： 研究背景:作为一种老年性疾病,缺血性脑血管病发病年龄越来越年轻化,而缺血后的治疗手段有限,严重威胁了人们的生命健康,加重家庭及社会经济负担。因此,寻求脑缺血预防和治疗的药物及其相应的靶点尤为重要。目的:研究香椿子四种不同极性提取物(香椿子石油醚提取物/CTFPEE、香椿子乙酸乙酯提取物/CTFEAE、香椿子正丁醇提取物/CTFBE、香椿子水提取物/CTFWE)对缺血性SD大鼠的神经保护作用,筛选出具有最佳神经保护作用的提取物,然后从NLRP3炎症小体途径探索其抗脑缺血作用分子机制。方法:(1)将干燥成熟的香椿子予以95%乙醇提取,得粗提物,然后取水溶性部分依次予以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到香椿子四种不同极性提取物;(2)将随机分组的SD大鼠分别灌胃给药一周,予以硅胶线栓行大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型制作,缺血2 h再灌注22 h,通过TTC染色及神经行为学评分,评估各提取物对缺血性SD大鼠脑梗死体积以及神经行为学评分的影响,筛选出具有最佳神经保护作用的香椿子提取物;(3)对筛选出的香椿子提取物进行剂量的摸索,分别予以低剂量及高剂量的提取物灌胃给药一周后行MCAO手术,缺血2 h再灌注22 h,通过TTC染色、神经行为学评分以及HE染色,评估各剂量对缺血性SD大鼠脑梗死体积、神经行为学评分以及神经元损伤的影响,从中筛选出最佳剂量;(4)予以NLRP3特异性抑制剂MCC950后,通过TTC染色以及神经行为学评分,评估NLRP3抑制对缺血性SD大鼠的神经保护作用;(5)在最佳剂量下灌胃给药一周,行MCAO术,缺血24 h后处死,分离皮层及海马,分别提取组织总蛋白、细胞核蛋白及细胞浆蛋白,应用免疫印迹法(Western Blot,WB)检测香椿子提取物对缺血性SD大鼠NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC以及Caspase-1表达水平的影响;(6)应用酶联吸附免疫测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测香椿子提取物对大脑皮层及海马组织中IL-1β、IL-18表达的影响。结果:(1)香椿子四种不同极性提取物的筛选实验中,缺血后脑梗死体积明显增加(P<0.01),神经行为学评分明显升高(P<0.05),CTFBE明显减少缺血后脑梗死体积(P<0.05),改善了神经行为学评分(P<0.05),其余提取物组均没有明显改善。(2)对CTFBE进行剂量的筛选实验中,脑梗死体积统计结果显示:缺血后脑梗死体积明显增加(P<0.01),CTFBE减少了缺血后脑梗死体积,且高剂量组较低剂量组脑梗死体积进一步减少(P<0.01)。神经行为学评分结果显示:缺血后神经行为学评分明显增加(P<0.01),CTFBE高剂量组明显改善了神经行为学评分(P<0.01),且较低剂量组相比,神经行为学评分明显改善(P<0.05)。HE结果显示:缺血后脑组织结构疏松,间质水肿,神经细胞核固缩深染,细胞呈空泡样改变,损伤神经元数量明显增加,CTFBE高剂量组明显减少了皮层、海马CA1、CA3及DG区损伤神经元百分比(分别为P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.05);在海马CA1及CA3区,较低剂量组相比,高剂量组损伤神经元百分比也明显下降(P<0.01)。(3)缺血后,脑梗死体积及神经行为学评分明显增加(P<0.01),CTFBE组、MCC950组以及两者联合给药组明显降低了缺血后脑梗死体积(P<0.01),改善了神经行为学评分(P<0.05)。(4)应用免疫印迹法检测皮层组织总蛋白,结果显示:缺血后,NLRP3的表达水平明显增加(P<0.05),ASC及Caspase-1的表达水平有增加趋势,但没有统计学意义,CTFBE对缺血后NLRP3的表达水平没有显著的影响。细胞核蛋白结果显示:缺血后,NLRP3、ASC及Caspase-1在细胞核内的表达均有显著的减少(P<0.01),CTFBE进一步降低了NLRP3在细胞核内的表达(P<0.01),对ASC及Caspase-1在细胞核内的表达没有明显影响。细胞浆蛋白结果显示:缺血后,NLRP3和ASC在细胞浆中的表达均有显著增加(P<0.01),CTFBE对NLRP3和ASC细胞浆中的表达均没有显著影响。(5)应用免疫印迹法检测海马组织总蛋白,结果显示:缺血后NLRP3和Caspase-1总蛋白表达明显增加(P<0.05),CTFBE对缺血后NLRP3和Caspase-1总蛋白表达没有明显影响,CTFBE和MCC950联合给药明显降低了Caspase-1总蛋白的表达(P<0.05),且与CTFBE组相比没有显著差异。细胞核蛋白结果显示:缺血后,NLRP3和ASC在细胞核内的表达明显下

关键词： 促红细胞生成素   钙化   GATA6   BMP2   炎症  

摘要： 研究背景与目的有临床研究发现使用高剂量促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)会增加慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)患者心血管事件发生率。而血管钙化也是CKD患者发生心血管事件的重要危险因素。虽然还没有临床研究表明EPO与血管钙化有直接关系,但有体外实验证明,EPO在高剂量下能够导致血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化,但其机制不清。此外,CKD患者长期处于微炎症状态,而炎症也是血管钙化的危险因素。那么在EPO诱导的血管钙化中,炎症是否能够发挥叠加或者协同效应目前也不清楚。因此,本研究的目的是探讨EPO导致血管钙化的分子调控机制以及炎症状态下EPO对血管钙化的影响。实验方法1.体外实验(1)从Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主动脉提取原代血管平滑肌细胞,用组织块贴壁法培养。(2)用不同浓度EPO(0 U/m L,50 U/m L,150 U/m L,250 U/m L)刺激原代血管平滑肌细胞(VSMCs)。通过茜素红染色,钙盐定量,碱性磷酸酶(ALP)活性测定血管平滑肌细胞钙化水平。用DCFH-DA探针检测细胞活性氧水平。(3)选择EPO诱导钙化最佳浓度刺激VSMCs。加入活性氧清除剂NAC观察细胞钙盐沉积。通过转录组测序对EPO刺激下产生的差异表达基因进行筛选,用PCR,Western Blot验证差异基因并检测VSMCs标志蛋白SM22α和α-SMA。用DNA下拉(Pull down),染色质免疫沉淀(Ch IP)和双荧光素酶实验证实目的基因与钙化相关蛋白的相互作用关系。用慢病毒分别敲低和过表达目标基因以验证其促钙化效应,接着在EPO刺激下敲低目标基因进行回复实验。(4)用EPO和TNF-α刺激VSMCs。通过茜素红染色,钙盐定量,碱性磷酸酶(ALP)活性测定细胞钙化水平。用DCFH-DA探针检测细胞活性氧水平。用PCR,Western Blot检测成骨相关蛋白表达以及抗钙化蛋白MGP的表达。分别用EPO,TNF-α或二者同时刺激细胞0,5,10,60分钟,用Western Blot检测pp38与p38蛋白水平。加入p38抑制剂SB203580后观察细胞的钙化情况,活性氧水平和钙化相关蛋白表达。2.体内实验将30只SD大鼠随机分为6组(每组5只):对照组(n=5),低剂量EPO(1000 U/kg/W)组(n=5),中剂量EPO(1500 U/kg/W)组(n=5),高剂量EPO(2000 U/kg/W)组(n=5),酪蛋白组(n=5)和酪蛋白+高剂量EPO组(n=5)。EPO经腹腔注射,每周三次连续20周。10%酪蛋白隔日经皮下注射(1.2 g/kg)连续20周以建立全身慢性炎症模型。所有大鼠喂以高磷饮食(1.2%磷)。取血液标本检测炎症因子(IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-10)水平。取腹主动脉用茜素红染色检测钙化水平;用Western Blot,免疫荧光染色检测组织中成骨相关蛋白表达水平;用PCR检测组织中成骨相关蛋白m RNA表达水平。结果1.体外实验结果(1)EPO以浓度依赖的方式显著上调VSMCs钙盐沉积,ALP活性和活性氧水平。(2)与EPO组相比,EPO+NAC组细胞钙盐沉积明显减少。转录组测序结果显示与对照组相比,EPO组有88个上调基因和59个下调基因,其中与骨形成相关的基因表达显著增加,即GATA6,BMP2,RUNX2,OPN和OCN。PCR,Western Blot与免疫荧光结果显示EPO确实能上调GATA6,BMP2,RUNX2,OPN和OCN的表达并且下调SM22α和α-SMA的表达。(3)Pull down,Ch IP与双荧光素酶实验证实GATA6可以与BMP2启动子区结合并促进BMP2的转录。与对照组相比,过表达GATA6能显著升高细胞的活性氧,钙盐沉积与ALP活性;而敲低GATA6后以上指标都显著下降。与EPO组相比,在EPO刺激下敲低GATA6会显著下调细胞活性氧,钙盐沉积与ALP活性。(4)与对照组相比,EPO组和TNF-α组中钙盐沉积,活性氧和GATA6,BMP2的表达显著上升,MGP显著下降;与EPO组相比,TNF-α+EPO组中钙盐沉积,活性氧和GATA6,BMP2的表达显著上升,MGP显著下降。(5)pp38/p38比值在不同时间点TNF-α和EPO+TNF-α刺激下显著上升,而在不同时间点EPO刺激下改变无统计意义。在TNF-α刺激下,不论有无EPO干预,加入p38抑制剂SB203580后与不加抑制剂组相比细胞的钙化,活性氧水平和GATA6,BMP2表达显著下降,抗钙化蛋白MGP显著升高。2.体内实验结果(1)EPO以剂量依赖的方式上调大鼠腹主动脉组织GA

关键词： 丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)   糖酵解   炎症环境   骨愈合   氧化应激  

摘要： 外部创伤、牙周炎、根尖周疾病等因素会导致牙槽骨缺损。可因长期的口腔卫生不良及各类疾病导致牙槽骨组织局部微环境被改变,形成炎症状态。炎症可导致成骨细胞成骨分化活动减弱,新骨形成减少,影响骨愈合。临床研究表明,控制牙槽骨缺损区炎症可保证牙槽骨的有效愈合,维持牙槽嵴的高度和宽度,以提升后期修复的成功率。氧化应激作为在炎症反应中的重要环节,会阻碍成骨细胞增殖分化,加速成骨细胞死亡并放大炎症反应。 成骨细胞通过高速低效率的有氧糖酵解产生ATP供给能量,成骨细胞中葡萄糖的主要代谢产物为乳酸。有氧糖酵解是成骨细胞独特的能量代谢方式,近年来的研究有氧糖酵解已成为研究成骨细胞的热点之一。丙酮酸脱氢酶激酶1(Pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1)是糖酵解途径中重要的限速酶,促进丙酮酸在胞浆内进行糖酵解。现有研究发现在成骨细胞中抑制PDK1会显著抑制骨合成代谢信号的骨合成促进作用,然而在炎症中PDK1对成骨细胞的调控作用还尚未涉及。 本研究将从分子、细胞以及动物组织三个层面,构建小鼠下颌骨炎性缺损模型和成骨细胞系体外炎症损伤模型,探索PDK1通过调控成骨细胞糖酵解对炎症状态下骨愈合的影响及机制。 主要研究方法和结果如下: 1、构建小鼠下颌骨缺损模型,观察炎症牙槽骨缺损区骨愈合情况及糖酵解酶的改变。将C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照组(PBS组)、炎症刺激组(LPS组)。通过拔除小鼠下颌左侧中切牙,构建牙槽骨缺损模型,同期颅顶皮下注射注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导下颌骨缺损区域发生炎症反应。3周后处死小鼠,取下颌骨组织进行μCT扫描重建,分析骨量,q PCR检测,将脱钙后的骨组织制作切片进行免疫组化染色,检测炎性相关因子IL-6、MCP-1;成骨相关蛋白ALP、OPG、OCN、RANKL;氧化应激相关蛋白HO-1、GPX1、SOD1及糖酵解酶乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)、PDK1的表达。结果表明: (1)LPS造成下颌骨骨缺损区域炎症反应并骨愈合不良,局部组织氧化应激水平升高; (2)炎症环境中下颌骨骨缺损区域糖酵解酶LDHA及PDK1表达降低。 2、体外培养成骨细胞,探究炎症环境下激活PDK1对成骨细胞糖酵解及成骨功能的影响。利用LPS刺激小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1),为成骨细胞构建一种炎症微环境。实验分组前MC3T3-E1细胞均提前用成骨诱导培养基培养7天,而后添加LPS浓度分别为10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的成骨诱导培养基培养细胞。将MC3T3-E1细胞分为三组:空白对照组(Control组)、炎症刺激组(LPS组)及LPS炎症刺激下加入糖酵解酶PDK1的激动剂PS48组(LPS+PS48组)。分别在不同时间点检查细胞活性情况,q PCR检测糖酵解酶LDHA及PDK1的表达。Seahorse细胞能量代谢分析仪分析成骨细胞糖酵解情况。检测成骨细胞分化情况,q PCR和免疫印迹法检测成骨相关蛋白ALP、OPG等及炎性因子TNF-α的表达。结果表明: (1)随着LPS浓度的增高,糖酵解相关酶的基因表达下降,在LPS浓度为100 ng/ml时达到最低;炎症环境下MC3T3-E1细胞糖酵解活动降低,而糖酵解能力无明显改变。 (2)炎症环境下MC3T3-E1细胞中PDK1表达水平降低,PS48可提升炎症环境下成骨细胞PDK1的表达; (3)炎症环境下MC3T3-E1细胞增殖分化能力降低,炎症因子TNF-α表达升高,ALP、OPG等成骨相关蛋白表达降低,细胞成骨分化受到抑制;通过PS48激动PDK1可提升糖酵解水平,提高炎症环境下MC3T3-E1细胞最大糖酵解能力,可显著减轻LPS导致的成骨功能损伤。 3、探究炎症环境下激活PDK1对成骨细胞氧化应激反应及线粒体功能的影响。MC3T3-E1细胞分为三组:空白对照组(Control组)、炎症刺激组(LPS组)及LPS炎症刺激下加入糖酵解酶PDK1的激动剂PS48组(LPS+PS48组),检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,q PCR和免疫印迹法检测氧化应激调控蛋白血红素氧合酶-1(Heme oxygenase 1,HO-1)的表达情况,共聚焦检测MC3T3-E1细胞线粒体内ROS的水平及细胞膜电位。结果表明: (1)LPS导致成骨细胞中氧化应激反应增高,PS48激活PDK1后氧化应激反应降低; (2)LPS导致线粒体中ROS水平增加,线粒体膜电位降低;PS48激活PDK1后线粒体功能趋于正常。 4、炎症环境下AKT参与PDK1调控成骨细胞功能。使用不同培养基培养细胞,免疫印迹法检测蛋白激酶B(Protein kina

关键词： 芪术胶囊   维持性血液透析   微炎症状态   Th1/Th2  

摘要： 目的观察芪术胶囊对维持性血液透析（MHD）患者的临床疗效，探讨芪术胶囊MHD患者微炎症状态的影响，观察MHD患者在芪术胶囊治疗前后Th1/Th2的变化。　　方法纳入符合标准的MHD患者60例，运用随机数字表法将其分为对照组与治疗组。对照组行规律血液透析并给予饮食调控，控制血压、控制血糖、纠正贫血等一般治疗;治疗组在对照组基础上加用芪术胶囊，0.25g，每次4粒，每日3次，治疗时间为12周。详细记录、观察两组患者治疗前后的相关研究资料（一般资料、中医证候、实验室指标等）。采用SPSS24.0软件对研究数据进行统计分析。　　结果（1）治疗前两组间各项资料（一般资料、中医证候积分、实验室指标）均无明显差异（P＞0.05）。（2）治疗后，两组中医疗效差异有统计学意义（P＜0.05），表明治疗组疗效优于对照组。（3）治疗后，两组中医证候积分组内及组间比较均有显著差异（p＜0.05），表示两组干预方式均能对MHD患者的中医临床症状有改善作用，治疗组改善优于对照组。（4）治疗后，两组肾功能指标疗效比较，差异无统计学意义（p＞0.05），表明芪术胶囊对MHD患者Scr及BUN无明显改善。（5）治疗后，对照组ALB、HGB较治疗前，无明显差异（p＞0.05）;治疗组ALB、HGB较治疗前，明显升高（p＜0.05），与对照组治疗后比较，差异有统计学意义（p＜0.05），表明芪术胶囊能提升MHD患者ALB、HGB水平。（6）治疗后，对照组hs-CRP、IL-6、TNF-α较治疗前，无明显差异（p＞0.05）;治疗组hs-CRP、IL-6、TNF-α均较治疗前明显降低（p＜0.05），与对照组比较，差异有统计学意义（p＜0.05），表明治疗组对改善MHD患者微炎症状态的疗效优于对照组。（7）治疗后，两组Th2较治疗前比较，无明显差异（p＞0.05）;对照组Th1及Th1/Th2较治疗前比较，无明显差异（p＞0.05），治疗组Th1及Th1/Th2均较12周前明显降低（p＜0.05），与对照组疗效比较，差异有统计学意义（p＜0.05），表明治疗组对改善Th1/Th2的效果优于对照组。（8）治疗后，两组WBC、PLT、ALT、AST较治疗前，无明显差异（p＞0.05）。　　结论（1）芪术胶囊能显著改善MHD患者中医临床证候，提高MHD患者血浆白蛋白、血红蛋白水平，改善患者贫血状态及营养状况。（2）芪术胶囊能显著降低MHD患者炎症因子水平，从而改善MHD患者微炎症状态。（3）芪术胶囊能降低Th1水平来调节MHD患者Th1/Th2失衡。

关键词： 输尿管镜碎石术   全身炎症反应综合征   手术时间   预测指标  

摘要： [目 的]分析输尿管镜联合钬激光(URSLL)治疗成年人泌尿系结石病患者术后出现全身炎症反应综合征(SIRS)的术前临床资料,探究相关危险指标,以期为预防临床URSLL术后SIRS的发生提供参考。[方 法]选择2018年1月—2020年12月因泌尿系结石病在昆明医科大学第六附属医院就诊且住院治疗并行输尿管镜钬激光碎石术的病患,收集病患的临床指标资料,共计329名病患被选基于纳入标准及排除标准。病患依照术后是否发展为SIRS分为SIRS组和非SIRS组并进行回顾性分析。通过对基本及临床指标:年龄(Age)与性别(Sex)及身高体重指数(BMI)、高血压与糖尿病史、结石位置及大小、术前外周血白细胞、术前中性粒细胞、术前淋巴细胞、术前单核细胞、术前血小板、术前肌酐、术前尿白细胞、中性粒细胞绝对值与淋巴细胞绝对值比值(NLR)、淋巴细胞绝对值与单核细胞绝对值比值(LMR)、血小板绝对值与淋巴细胞绝对值比值(PLR)、手术时间、ASA分级与术后SIRS的相关性进行统计学分析(P<0.05认为有统计学意义)。首先进行单因素分析,后对单因素分析中意义的指标采用Logistics多因素回归分析中基于最大偏似然估计的似然比检验法进行变量分析,并根据结果绘制ROC联合曲线。[结 果]329名入选的患者,72(21.88%)名病患术后发展为SIRS。单因素分析:年龄(P=0.013)、高血压(P=0.005)、术前肌酐(P=0.001)、术前外周血白细胞(P=0.008)、术前中性粒细胞(P=0.007)、NLR(P=0.021)、PLR(P=0.041)、术前尿白细胞(P=0.027)和手术时间(P=0.001)为输尿管镜联合钬激光碎石术术后发展为SIRS的关联指标;性别(P=0.93)、BMI(P=0.47)、糖尿病(P=0.259)、结石位置(P=0.451)、结石大小(P=0.697)、ASA分级(P=0.944)、术前淋巴细胞(P=0.314)、术前单核细胞(P=0.218)、术前血小板(P=0.829)、LMR(P=0.149)与URSLL术后SIRS无明显相关。多因素分析表明年龄(P=0.015,OR=1.027)、术前中性粒细胞(P=0.011,OR=1.265)、术前肌酐(P=0.030,OR=2.033)、术前尿白细胞(P=0.043,OR=2.180)、手术时间(P=0.002,OR=1.021)是行输尿管镜联合钬激光碎石术术后病患发展为SIRS的独立预测指标。ROC曲线显示术前中性粒细胞、手术时间、年龄、术前尿白细胞、术前肌酐五指标联合具有一定的预测价值(AUC=0.719,95%CI:0.650-0.788)。[结 论]年龄、高血压、术前外周血白细胞、术前中性粒细胞、术前肌酐、NLR、PLR、术前尿白细胞、手术时间为输尿管镜联合钬激光碎石术术后发展为全身炎症反应综合征的危险指标。年龄、术前中性粒细胞、术前肌酐、术前尿白细胞和手术时间是病患行输尿管镜联合钬激光碎石术术后发展为SIRS的独立预测指标。预测模型中五指标(年龄、术前中性粒细胞、术前肌酐、术前尿白细胞和手术时间)联合ROC曲线的预测效能(AUC=0.719,95%CI:0.650-0.788)优于单个指标的预测效能。