关键词： 牙周膜干细胞   基质细胞衍生因子-1α   趋化因子受体   4   肿瘤坏死因子-α   内皮向分化   炎症微环境  

摘要： 牙周炎是常见的慢性炎症性疾病，它可以导致牙周组织不可逆性的破坏，同时炎症可以刺激血管形成，破坏的牙周组织处有大量的炎性肉芽组织形成。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）定植在牙周膜中并具有多向分化能力。有研究证实间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）的分化是受组织微环境调节的。同样牙周膜干细胞的分化也受组织微环境的调控。有报道显示，由于炎症微环境中存在大量的血管形成因子，这些因子有利于干细胞向内皮细胞分化。那么牙周炎症微环境是否促进牙周膜干细胞的内皮向分化以及调节其内皮向分化的机制还不清楚。基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是存在于牙周炎症微环境中与牙周炎发展密切相关的重要因子。SDF-1α是重要的血管形成因子，它可以诱导趋化因子受体4[chemokine(c-x-c motif) receptor4，CXCR4]阳性表达的间充质干细胞分化为内皮样细胞。促炎因子TNF-α是SDF-1α/CXCR4轴的关键调节者，TNF-α可以通过上调SDF-1α或CXCR4的表达促进SDF-1α/CXCR4轴介导的反应。在本研究中将初步观察TNF-α和SDF-1α/CXCR4轴在牙周膜干细胞内皮向分化中的作用及二者之间的调控关系。 研究目的： 初步探讨炎症微环境下牙周膜干细胞内皮向分化能力及其分子机制。 研究方法： 1.采用酶消化联合组织块法培养正常及炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞；克隆形成实验观察两种干细胞的克隆形成能力；流式细胞仪检测两种干细胞表面分子标志物的表达；成骨诱导后茜素红染色并进行定量分析比较两种干细胞的成骨分化能力。 ***-time PCR检测两种干细胞中SDF-1α、CXCR4表达的差异；SDF-1α诱导两种干细胞，Real-time PCR检测血管内皮相关基因CD31、vWF的表达差异；Matrigel基质胶管腔形成实验观察两种干细胞管腔形成情况，倒置显微镜下拍照，统计管腔形成数量并进行比较。 ***-8法检测TNF-α对牙周膜干细胞生长的影响；Real-time PCR检测TNF-α对牙周膜干细胞SDF-1α、CXCR4表达的影响。 4.利用Real-time PCR和Western Blot比较单纯SDF-1α诱导组、TNF-α预处理后SDF-1α诱导组、TNF-α预处理后AMD3100阻断再加SDF-1α诱导组的血管内皮相关基因CD31、vWF、KDR和蛋白vWF、VE-cadherin的表达情况；Matrigel基质胶管腔形成实验观察TNF-α预处理后SDF-1α诱导组和TNF-α预处理后AMD3100阻断再加SDF-1α诱导组的管腔形成情况。 研究结果： 1.原代培养的两种牙周膜干细胞细胞形态为长梭形并呈漩涡状或放射状排列，具有间充质干细胞的形态特征及克隆形成能力；流式细胞仪结果显示两种干细胞均阳性表达CD105、CD90、CD29、CD146，阴性表达CD34、CD45、CD31；茜素红染色显示经诱导后的两种干细胞均可见矿化结节形成，定量分析结果显示炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞成骨能力较弱。 ***-time PCR结果显示炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞低表达SDF-1α、高表达CXCR4；两种干细胞经SDF-1α诱导后，血管内皮相关基因CD31、vWF表达水平和管腔形成能力均明显高于未经SDF-1α诱导的对照组，两种细胞间相比，经SDF-1α诱导后的炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞中的CD31mRNA、vWF mRNA的表达水平和管腔形成能力均明显高于正常牙周组织来源的牙周膜干细胞。 ***-8法结果显示1ng/mL TNF-α和10ng/mL TNF-α对牙周膜干细胞生长无明显影响，100ng/mL TNF-α明显抑制牙周膜干细胞的生长；Real-time PCR结果显示10ng/mL TNF-α抑制牙周膜干细胞表达SDF-1α，促进牙周膜干细胞表达CXCR4。 ***-time PCR和Western Blot显示牙周膜干细胞经TNF-α预处理后加SDF-1α诱导组其血管内皮相关基因和蛋白表达水平均明显高于单纯SDF-1α诱导组；同时经TNF-α预处理后加入CXCR4抑制剂AMD3100再加SDF-1α诱导的实验组，血管内皮相关基因和蛋白表达水平以及管腔形成能力均明显降低。 结论: 炎症微环境可以促进牙周膜干细胞的内皮向分化能力，其分子机制为TNF-α通过上调牙周

关键词： 高盐饮食   Th17   Treg   流式细胞术   BOLD-MRI   血流介导的血管舒张   (FMD)  

摘要： 研究目的：高盐(high salt, HS)饮食不仅是高血压的致病因素,还能独立于血压水平造成靶器官损伤。越来越多的证据显示免疫系统在高血压及其靶器官损伤发生中发挥重要作用,其中机体获得性免疫机制是引发靶器官炎症反应的关键因素之一。近来研究显示,辅助性T细胞17(T helper cell17, Th17)(生成白介素-17)和调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)(表达转录因子FoxP3)各自发挥促炎和抗炎效应。Th17/Treg免疫平衡的调控是目前研究的热点。由Th17/Treg免疫失衡所致炎症紊乱,即免疫-炎症轴失衡参与了靶器官炎症反应和损伤。高盐摄入是否可通过影响人类Th17/Treg平衡进而引起靶器官的炎症反应尚未见报道。本研究旨在对健康志愿者中通过慢性盐负荷试验,观察在此期间外周血Th17/Treg免疫平衡的动态变化,并探讨其可能机制,以及与靶器官炎症反应的关系。 研究内容与方法：共纳入健康男性志愿者15人。平均26.93±0.92岁。 (1)按照世界卫生组织(World Health Organization, WHO)每日低于5g食盐(即NaCl)的摄入量作为低盐饮食标准。高盐饮食的标准确定为15g/日。由研究者按以上食盐摄入标准,给所有志愿者统一提供饮食并在同一地点就餐。整个饮食干预时间共17天,分为基线期(第1-3天,志愿者依据个人口味在同一地点自由进餐,共3天),随后紧接高盐期(第4-10天,共7天),最后进入低盐期(第11-17天,共7天)。 (2)每天测量并记录收缩压、舒张压和心率。于基线期第3天(day3,D3),高盐第7天(day10,D10),低盐期第7天(day17, D17)收集24小时尿,进行常规生化等检验。 分别在基线第3天(day3, D3),高盐饮食第1天(day4, D4)、高盐饮食第2天(day5,D5)、高盐饮食第7天(day10,D10)、低盐饮食第7天(day17,D17)采集受试者外周血进行免疫细胞流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测,对CD4+和CD8+淋巴细胞亚群、B细胞(CD19),以及Th17和Treg细胞表面分子抗体(CD4、CD25、IL-17和FoxP3)进行四色流式分析。对基线第3天(day3,D3)和高盐第2天(day4, D4)采集外周血使用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,通过基因芯片技术对其进行表达谱分析。使用TRIzol试剂裂解单个核细胞后,提取总RNA；采用聚合酶链反应(PCR)对表达谱分析确定的感兴趣差异基因进行mRNA水平的验证。 分别于基线第3天(day3,D3),高盐饮食第1天(day4,D4)、高盐饮食第7天(day10,D10)、低盐饮食第1天(day11, D11),低盐饮食第7天(day17,D17)采用飞利浦Intera3.0T全身磁共振系统对受试者腹部横断面T2WI扫描及冠状面高清BOLD-MRI扫描并计算肾髓质的表观-自旋弛豫率(R2*,R2*值与局部组织氧合水平呈正相关) 分别于基线第3天(day3,D3),高盐饮食第1天(day4, D4)、高盐饮食第7天(day10, D10)、低盐饮食第7天(day17,D17)通过无创超声评价肱动脉血流介导性的血管舒张(flow mediated dilation, FMD)。 结果：15名志愿者完成全部饮食干预及血液和尿液的有关检测,并根据24小时尿量、尿钠总量、尿肌酐总量以及血钠水平等指标进行质量控制并判定所得实验数据可靠。 (1)尿量、尿电解质和尿肌酐的变化：与基线期相比,高盐饮食期第7天24小时尿量(2241±615mL vs.1773±918mL)尿钠(325.6±43.3mmolvs.152.9±52.1mmol)、尿钾(38.9±8.9mmol vs.30.2±9.7mmol)均明显升高,且均有统计学差异(P均<0.05)。与高盐饮食期第7天相比,低盐饮食期第7天尿量、尿Na+、尿K+显著降低且均有统计学意义(P均<0.001)。高盐饮食期与基线期和低盐饮食期相比24小时尿肌酐显著升高(P均<0.001)。 (2)血压、心率的变化：与基线期相比,高盐期收缩压和舒张压有上升趋势,低盐期呈现下降趋势,但变化无统计学意义(P>0.05),而心率在高盐饮食期明显增快(P<0.01),心率在低盐期较高盐期减慢(P<0.05)。 (3)流式分析结果：CD3+、CD4+T细胞亚群及B淋巴细胞(CD19)均无明显变化(P>0.05)。食盐摄入变化可导致Th17/Treg细胞比例发生变化,高盐第2天Th17细胞数量较基线水平下降(P<0.05),而Treg细胞数量较基线水平升高(

关键词： 四氯化碳   C57BL/6J小鼠   SREBP-2   四氯化碳   酪蛋白   炎症   C57BL/6J小鼠   SREBPs  

摘要： 第一部分四氯化碳致小鼠肝脂肪变性的分子机制 目的：探讨四氯化碳(CCl4)促进小鼠肝细胞脂肪变性的分子机制。 方法：将6～8周龄的C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组(control)（n=6）和CCl4组(CCl4)（n=6）。对照组和CCl4组分别给予皮下注射生理盐水（NS）和CCl42周，2周后处死小鼠，留取肝脏。化学酶促比色法检测小鼠肝脏总胆固醇（TC）含量，油红O染色观察肝脏脂肪变程度，实时荧光定量PCR和western bot检测小鼠LDLr、SCAP和SREBP-2的基因和蛋白表达水平。 结果：CCl4组的肝组织的TC含量表达比对照组的明显升高（P＜0.05），油红O染色显示CCl4组肝组织可见大量的脂质堆积。CCl4组的LDLr、SREBP-2、SCAP的mRNA和蛋白表达比对照组明显增高(P均＜0.05)。 结论：CCl4可能通过上调肝细胞LDLr、SREBP-2、SCAP的表达，导致小鼠肝细胞脂质异常堆积。 第二部分炎症促进四氯化碳诱导的小鼠脂肪变肝细胞脂质集聚的相关指标变化 目的：探讨炎症促进CCl4所致的脂肪变肝细胞进一步脂质集聚形成脂肪肝的分子机制。 方法：将6～8周龄的C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组（n=6）和炎症组（n=6）。2组均预先CCl4皮下注射2周，再分别给予对照组（CCl4+NS）和炎症组(CCl4+casein)生理盐水(NS)和酪蛋白(casein)皮下注射16周，18周后留取小鼠血清及肝组织，称量小鼠体质量及肝质量计算肝指数评估肝脏受损情况，ELISA法检测血清炎症因子，酶法检测小鼠血清脂质水平,化学酶促比色法检测小鼠肝组织的脂质水平，油红O染色观察小鼠肝组织的脂质集聚情况，实时荧光定量PCR检测小鼠SREBP-1、SREBP-2、LDLr、SCAP、HMGCR的基因表达水平，免疫组化和western blot检测上述靶基因的蛋白表达水平。 结果：炎症组的肝指数较对照组升高（P＜0.05）,炎症组的血清淀粉样蛋白（SAA）、IL-6和TNF-α的表达均比对照组的明显升高（P均＜0.05），炎症组的血清HDL-C、LDL-C、TC比对照组的明显降低（P均＜0.05）,肝脏TC含量较对照组升高（P＜0.05），HE及油红O染色显示炎症组可见大量的脂质堆积。炎症组的LDLr、SREBP-2、SCAP、SREBP-1、HMGCR的mRNA和蛋白表达比对照组明显增高(P均＜0.05)。 结论：炎症可能通过上调肝细胞LDLr、SREBP-2、SCAP、SREBP-1,HMGCR的表达，导致CCl4刺激下的脂肪变肝细胞摄入外源性胆固醇和内源性合成增加，加重肝脏脂质的异常集聚。

关键词： 糖尿病肾病   倍半萜内酯   microRNA146a   巨噬细胞   核转录因子Kappa B   炎症小体   NLRP3  

摘要： 研究背景：糖尿病肾病是糖尿病的并发症之一,治疗手段有限,亟待拓展。越来越多的研究表明肾脏局部慢性炎症是糖尿病肾病发生、发展的重要因素,但其分子机制还未明确。有研究提示炎症小体(NLRP3)、microRNA等炎症相关因素可能在多个层面影响着糖尿病肾病炎症状态的发生,作为胰岛素抵抗的推手,促进糖尿病肾病的发生。我们前期实验已表明倍半萜内酯(PTN)可缓解db/db小鼠模型糖尿病肾病临床和病理,降低MCP-1、IL-6等炎症因子表达及改善局部胰岛素抵抗状态。本文旨在探讨糖尿病肾病患者及db/db鼠DKD模型肾脏局部是否存在微炎症状态,探究PTN如何从基因层面、蛋白水平,通过直接抑制NF-κB、NLRP3,抑制肾脏局部的慢性炎症发生,延缓糖尿病肾病进展提供理论依据。 研究目的：了解糖尿病肾病患者肾脏局部炎症状态,观察巨噬细胞浸润、炎症小体(NLRP3)、NF-κB在肾脏表达变化。利用db/db小鼠模型研究糖尿病肾病中NLRP3、NF-κB通路及microRNA谱变化情况,探究PTN对肾脏局部微炎症的影响,延缓糖尿病肾病的可能机制。研究方法：(1)筛选2011年1月至2014年1月北京协和医院肾内科住院经肾穿刺病理活检确认为糖尿病肾病的患者37例,其中7例糖尿病病史短,病理仅有肾小球肥大,记为DKD1组,其余记为DKD2组。收集同期微小病变(CTL1)10例及膜性肾病患者(CTL2)15例与DKD组进行比较。通过免疫组织化学方法,检测CD68、NF-κB、炎症小体(NLRP3)表达情况以确认有无慢性炎症现象。(2)利用前期动物模型,分别取实验小鼠三组[对照组(db/m+NS)、糖尿病组(db/db+NS)、PTN干预组(db/db+PTN)],T0(8周龄)、T4(12周龄)及T8(16周龄)留取肾脏标本。利用T8肾脏组织进行深度测序,查看db/db小鼠microRNA表达谱变化及PTN对其影响,并对于差异表达最大的microRNA146a-5p给与实时定量PCR验证。(3)利用实时定量PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学方法、免疫酶联吸附法验证IRAK1蛋白、TRAF6蛋白、IK B蛋白、NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1的表达情况,初步探讨PTN干预小鼠糖尿病肾病可能的机制。 研究结果：糖尿病肾病早期的患者肾脏局部与对照组相比,可见肥大的肾小球中、肾间质、肾小管局部CD68阳性,OD值为(6.9±6.7)‰,与对照组相比,差异具有统计学意义,P<0.05;而糖尿病中晚期患者肾小球、肾小管、肾间质存在大量片状分布的CD68阳性胞浆,OD值(16.7±7.9)‰,与对照组(CTL1、CTL2)、糖尿病初期组比较,差异具有显著性统计学意义,P<0.01。与CD68结果一致,NLRP3及NF-κB表达也随着糖尿病肾病病情而加重。NF-κB在DKD1期组、DKD2组OD值分别(5.4±1.8)%、(12.7±8.0)%,分别与CTL1或CTL2组比较,差异具有统计学意义,P<0.05。NLRP3在DKD1组、DKD2组OD值分别(15.8±7.7)%、(18.6±7.7)%,DKD2组与对照组(CTL1、CTL2)及DKD1组比较,差异具有统计学意义,P<0.05。 在动物实验中,糖尿病肾病组(db/db+NS)与对照组(db/m+NS)相比,表达上调及下调的microRNA数目分别为206个和91个,糖尿病肾病组(db/db+NS)与干预组(db/db+PTN)相比表达上调及下调的microRNA分别为101个和76个。在一定表达量的前提下,同时满足在糖尿病肾病组(db/db+NS)下调而干预组(db/db+PTN)中上升的microRNA有68个,前5位依次为：microRNA146a-5p、 microRNA223-3p、microRNA16-5p、microRNA126-3p、microRNA195-5p。在一定表达量的前提下,同时满足在糖尿病组上调而干预组中下调的microRNA共72个,其中前5位的依次为：microRNA204-5p、microRNA7d-3p、microRNA2137、 microRNA5115、microRNA193b-3p。它们与炎症、肿瘤、血管生成等密切相关。microRNA146a-5p在db/db模型小鼠中表达量降低最显著,且干预组中能够恢复最明显,对其进行实时定量PCR功能验证。发现糖尿病肾病组(db/db+NS)与同周龄的对照组(db/m+NS)相比,microRNA146a-5p表达量降低,且随周龄增加而表达量减少,糖尿病肾病组(db/db+NS)vs对照组(db/m+NS)△CT值分别为：T0：0.62±0.43vs0.82±0.44;T4：0.42±0.38vs0.92±0.

关键词： 动物模型   变应性鼻炎   最轻持续炎症状态   嗜酸性粒细胞   细胞间黏附分子-l  

摘要： 目的:通过制作稳定的小鼠变应性鼻炎最轻持续炎症状态(MPI)的模型,对变应性鼻炎MPI期有初步的了解,为进一步对MPI期的深入研究提供实验基础。方法:选用BALB/c系小鼠60只,SPF级,雌性,随机分为4组,每组15只。A组为阳性对照组,B组为实验组即MPI组,C组为阴性对照组,D组为空白对照组。A,B,C组小鼠分别于第1天,第8天,第15天腹腔注射以含OVA、Al(OH)3的PBS致敏液进行致敏;第22天起A,B,C组小鼠给予OVA鼻腔激发,连续l周;成功建立AR模型后,从第29天起,对A、B、C组小鼠分别以40mg/ml OVA,4mg/ml OVA及PBS液进行长期滴鼻刺激,持续三周,D组小鼠始终以PBS溶液代替OVA进行致敏及滴鼻。然后对小鼠鼻腔激发后进行症状学评估,检测鼻中隔黏膜嗜酸粒细胞浸润的程度,观察上皮细胞内细胞间黏附分子ICAM-1表达的情况。结果:鼻腔激发后,A、B、C三组小鼠均成功建立AR模型,三组小鼠间症状学评分差异无统计学意义(P>0.05);MPI模型组(B组)小鼠在改为4mg/ml OVA溶液滴鼻后,喷嚏、流涕、抓鼻等症状渐消失,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01),与C、D组比较差异无统计学意义(P>0.05),但MPI模型组鼻中隔黏膜仍有少量嗜酸性粒细胞浸润,上皮细胞轻度表达ICAM-1,与C、D组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:以OVA致敏和激发BALB/c系小鼠,可成功建立小鼠变应性鼻炎模型;在建立稳定的小鼠AR模型基础上,通过给予长期低浓度OVA鼻腔刺激,可以成功制作小鼠变应性鼻炎最轻持续炎症状态模型,此方法具有操作简单、成功率高、重复性好的优点,为进一步对变应性鼻炎MPI期进行深入研究及针对MPI期的治疗提供了良好的实验基础。

关键词： 肺挫伤   缺血再灌注损伤   急性呼吸窘迫综合征   体外膜氧合   免疫炎症反应   急性呼吸窘迫综合征   肠粘膜屏障   一体化连接方式   管路   持续血液滤过   体外膜氧合   肠粘膜屏障   紧密连接蛋白   线粒体功能   线粒体膜电位   线粒体复合物   持续肾替代治疗   体外膜氧合  

摘要： 体外膜氧合技术(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)具有完全肺功能和部分心功能的替代作用,因此被认为是目前急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)最有效的支持性治疗之一。但由于ECMO技术是非生物材料的侵入性支持治疗,诸多的证据表明ECMO可导致诸如全身及局部的免疫炎症反应、氧化应激损伤、溶血、凝血功能障碍、肾功能、肺功能、心功能损伤等一系列的并发症。这使得ECMO治疗受到极大限制,导致其目前仅使用于严重ARDS晚期的治疗。因此如何避免ECMO相关并发症的发生,是提高其疗效和适应范围的关键所在。随着材料技术的进步,ECMO治疗过程中诸如溶血反应、凝血功能障碍等并发症在逐渐减少,但全身免疫炎症反应和导管感染的发生率仍然较高。而在危重病人中,胃肠道是感染和炎症反应发生的主要来源。我们在前期在正常的动物模型研究中已经发现,ECMO治疗可导致肠道氧化应激损伤。我们前期及KurundkarAR等人的研究进一步发现,ECMO治疗能导致正常猪肠粘膜屏障的损伤。这就表明ECMO治疗技术本身可导致机体肠粘膜屏障的发生。但这些研究均只是在正常状态下进行。在严重ARDS状态下,由于机体本身的缺氧和免疫炎症反应等病理生理可导致肠粘膜损伤,理论上ECMO治疗可能通过增加机体氧供保护肠粘膜屏障。因此,ECMO治疗存在两方面矛盾的问题,第一方面:ECMO治疗可通过改善严重ARDS组织低氧从而保护胃肠粘膜屏障;第二方面:ECMO治疗本身又可导致胃肠粘膜屏障的损伤。一旦发生肠粘膜的损伤又如何进行及早的干预目前国内外尚无相关研究。在ECMO治疗过程中,约80%的病人需要进行持续肾替代治疗(Continuous Renal Replacement Therapy CRRT)。近期研究发现,CRRT能改善ECMO所致的全身免疫炎症反应、心功能、肺功能以及肾功能。此外,CRRT治疗能增加肠道紧密连接蛋白的表达,保持肠粘膜紧密连接的完整性,降低细菌易位的发生。同样,我们前期在正常动物模型实验中证实,CRRT能缓解ECMO治疗所致的肠粘膜损伤。因此,我们推测CRRT治疗可能对ECMO治疗所致的ARDS机体肠粘膜屏障产生保护效应。但ECMO和CRRT又通过何种途径影响ARDS机体肠粘膜屏障仍需进一步探讨。线粒体是氧代谢的主要细胞器,它的损伤可导致细胞的坏死和凋亡。我们在前期研究中发现,ECMO治疗能导致心肌线粒体超微结构和功能的损伤。此外,我们还发现,ECMO治疗能导致肠道氧化应激的损伤。这些证据表明ECMO治疗可影响组织线粒体功能。另有研究显示CRRT联合ECMO治疗较单一 ECMO治疗氧利用增加。我们前期研究发现CRRT联合ECMO治疗组,心肌线粒体结构的破坏、线粒体功能及氧化应激损伤较ECMO明显改善。这表明CRRT能改善ECMO导致的线粒体功能损伤,增加其功能,降低氧化应激损伤。因此,我们推测,ECMO可能通过损伤线粒体功能损害肠粘膜屏障,而CRRT治疗能缓解ECMO所致的线粒体损伤从而保护肠粘膜屏障。因此,本研究通过建立一种稳定的并适用于更长时间的体外生命支持系统研究的ARDS动物模型。在此基础上首次探讨ECMO治疗对ARDS猪肠粘膜屏障的影响;同时我们创新建立一种CRRT与ECMO一体化的连接方式,在此基础上进一步探讨ECMO联合CRRT对ARDS猪肠粘膜屏障的影响;最后我们探讨ECMO及ECMO联合CRRT治疗影响肠粘膜屏障的机理,即其对线粒体结构及功能的影响。本研究结果以期为临床提高ECMO的治疗有效性、降低并发症的发生、以及为ECMO联合CRRT的治疗提供理论依据。第一部分:ECMO治疗对创伤性ARDS猪肠粘膜屏障的影响研究一:肺挫伤联合缺血再灌注损伤ARDS动物模型的建立目的:我们前期进行了多种ARDS动物模型制作方式的探索包括肺灌洗(生理盐水或胃液)、静脉注射油酸、枪击伤、缺血再灌注联合注射内毒素。但这些模型均不适用于长时间的体外生命支持系统的研究。本研究的目的为建立一种适用于体外生命支持系统研究的ARDS动物模型模型,从而进一步研究ECMO以及ECMO联合CRRT提供基础。方法:12只健康猪随机分为三个组:Group A-予0.2kg/kg体重的重物由1米高度落下;Group B——予0.4kg/kg体重的重物高处落下;GroupC——予0.6kg/kg体重的重物高处落下。随后三组动物均进行缺血再灌注。复苏完成后并观察24小时。记录血流动力学及呼吸参数,评价肺CT结果、组织病理学改变以及微观结构的改变。结果:三组动物间生存时间无显著差异。Group C动物死亡率高(75%),不适合后续研究使用。Group A动物均存活,氧合指数、CT评分以及病

关键词： 亚砷酸钠   细胞恶性转化   炎症反应   上皮-间质转化   肿瘤干细胞特性   缺氧诱导因子  

摘要： 砷化物是人类确定致癌物,亚砷酸钠(NaAsO2)是砷元素在环境中存在的主要形式。长期摄入砷化物可引起多种癌症,其中主要是皮肤癌、肺癌和膀胱癌等,砷化物已被国际癌症研究机构(IARC)确认为人类确定(I类)致癌物。但由于砷化物致癌实验动物模型一直未能成功建立,导致其致癌机制研究长期滞后。近年来砷化物所致细胞恶性转化和DNA损伤及细胞凋亡的体外模型已被应用于其致癌机制研究。炎症微环境是肿瘤的一个重要形成要素,炎症微环境中的细胞因子能够诱导抑癌基因突变和表观遗传学改变从而引起细胞内环境紊乱最终导致肿瘤的发生和演进。肿瘤是在各种致瘤因素作用下,细胞本身遗传学或表观遗传学的内在改变和炎症微环境中的细胞因子的外在作用共同诱发和促进的。因此,研究砷对于炎症微环境调控的分子机制对于阐明其致癌机制具有重要意义。上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)样特性获得参与了多种疾病,特别与恶性肿瘤的发生和发展有关。近年,虽然EMT和CSCs特性获得与肿瘤细胞恶性程度和转移关系及其分子机制的研究已成为热点,但对于EMT和CSCs特性获得在环境致癌物所致细胞恶性转化及致癌过程中的作用和分子机制的研究报道甚少。因此深入研究调控砷化物诱导EMT过程中CSCs特性获得在恶性转化过程中的作用及其分子机制对于寻找砷化物致癌的早期生物学标志及发现新的防治措施具有重要理论意义和实用价值。第一部分HIFs在亚砷酸钠所致细胞恶性转化和DNA损伤中的作用及分子机制目的:研究在正常氧浓度下,NaAsO2对缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)的调控机制,探索HIFs在NaAs02所致细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和凋亡中的作用。方法:本研究选取人支气管上皮(HBE)细胞进行研究,建立NaAsO2所致HBE细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和细胞凋亡模型;软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验检测细胞恶性程度,碱性彗星实验和Hochest染色实验检测细胞DNA损伤和凋亡;western blot和RT-PCR技术检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路及 HIFs 的表达情况;应用蛋白酶体抑制剂MG132联合NaAsO2处理,免疫共沉淀实验检测HIFs的蛋白泛素化情况;应用抑制剂,siRNA干涉和质粒转染技术探讨HIFs在NaAsO2所致细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和凋亡中的作用。结果:1.亚砷酸钠对HBE细胞恶性转化和DNA损伤的影响用 0.0、1.0、5.0 和 10.0μM NaAsO2 处理 HBE 细胞 24 h,结果显示 1.0μM NaAsO2引起HBE细胞增殖明显升高,而10.0 μM NaAsO2引起HBE细胞增殖降低,且表现出明显DNA拖尾和细胞凋亡现象;选取0.0和1.0 NaAsO2慢性处理HBE细胞30代(约15周)。结果发现1.0μM NaAsO2慢性处理的HBE细胞能在软琼脂上形成集落,裸鼠皮下形成肿瘤,肿瘤组织病理学切片显示为低分化上皮样癌细胞。提示NaAsO2在低水平引起HBE细胞增殖和恶性转化;而在高水平则引起HBE细胞DNA损伤和凋亡。2.亚砷酸钠对HBE细胞MAPKs和HIFs的影响用 0.0、1.0、5.0 和 10.0 μM NaAsO2 处理 HBE 细胞 24 h,结果发现 1.0 μM NaAsO2 引起 HBE 细胞胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)和 HIF-2α 水平升高;10.0 NaAsO2 引起 HBE 细胞 c-Jun N-端激酶(c-Jun N-terminal kinases,p-JNK)和HIF-lα水平升高。结果说明低水平NaAsO2主要激活ERK信号通路和诱导HIF-2α水平升高,而高水平NaAsO2主要激活JNK信号通路和诱导HIF-1α水平升高。***调控HIF-2α在低水平亚砷酸钠所致HBE细胞p53功能抑制中的作用分别用0.0和10.0 μM ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125预处理HBE细胞3h后,再分别用0.0和1.0μM NaAsO2处理HBE细胞24 h,结果发现阻滞ERK激活能逆转1.0μM NaAsO2对HBE细胞HIF-2α蛋白的泛素化降解的抑制作用,从而使HIF-2α的水平降低;分别用0.0和1.0 μM NaAsO2慢性处理HBE细胞30代(约15周),结果发现p-p53水平在恶性转化HBE细胞中明显降低;进一步用0.0和1.0 μM NaAsO2处理HBE细胞3、6、12

关键词： 自发性高血压大鼠   养肝益水颗粒   高血压早期肾损害   大鼠尾动脉收缩压   尿mALB   ICAM-1   PPARγ   eNOS  

摘要： 目的：观察养肝益水颗粒对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)早期肾损害炎症的抑制作用。 方法：以12周龄同源同系雄性SHR(n=16)为研究对象，同周龄WKY(Wstar-Kyoto，WKY)大鼠8只做为正常对照。大鼠适应性饲养一周后，将SHR随机分为SHR模型组、养肝益水颗粒大剂量组、养肝益水颗粒中剂量组，西药组四组。所有大鼠给予标准大鼠饲料喂养，每周另喂2次鸡蛋白，1/4个/只/次，实验各组在12周龄开始，分别给予饮用水、养肝益水颗粒大、中剂量、贝那普利干预；于实验前(12周龄)、实验第6周、第12周时(给药第18周，28周龄)分别用尾套法测量SHR大鼠尾动脉收缩压，放射免疫法测定尿微量白蛋白(尿mALB)浓度；RT-PCR检测各组肾组织ICAM-1mRNA、PPARγmRNA表达；western-blot检测肾脏组织ICAM-1、eNOS蛋白表达。 结果：与模型组比较，养肝益水颗粒大、中剂量组、西药组可以明显降低SHR尾动脉血压水平(P<0.05或P<0.01)；而且能明显降低尿中的Malb（P<0.05或P<0.01），养肝益水颗粒大、中剂量组小鼠肾组织中ICAM-1mRNA、PPARγmRNA、ICAM-1、eNOS表达水平下降(P<0.05或P<0.01)。养肝益水颗粒可以进行性降低大鼠血压，并能减少SHR大鼠的尿微量白蛋白、能够降低肾组织ICAM-1mRNA、PPARγmRNA、ICAM-1及eNOS蛋白表达，改善高血压肾损害大鼠病情。 结论：养肝益水颗粒可以抑制SHR炎症因子表达，从而减轻肾脏组织的损害、达到对肾脏的保护作用。

关键词： 非体外循环冠状动脉旁路移植术   磷酸肌酸   心肌损伤认知功能   全身炎症  

摘要： 目的研究磷酸肌酸钠预处理对非体外循环冠状动脉旁路移植术（off-pumpcoronary artery bypass grafting, OPCABG）患者短期认知功能的影响。 方法拟择期行OPCABG术患者40例,按随机数字表法分为2组：磷酸肌酸钠组（L组，n=20）和对照组（C组，n=20）。患者入室前30min肌肉注射吗啡10mg和东莨菪碱0.3mg。开通右上肢外周静脉，在局麻下行左桡动脉穿刺置管测压。连接心电监护（ECG）、脉搏氧饱和度（SPO2）、有创动脉血压（ABP），中心静脉压（CVP）和脑电双频指数（BIS）监测生命体征变化。麻醉诱导采取静脉注射咪达唑仑0.1mg/kg，舒芬太尼0.8μg/kg，依托咪酯0.3mg/kg和罗库溴铵0.8mg/kg。气管插管后行机械通气，使PETCO2维持在正常范围35～45mmHg。麻醉维持采用全凭静脉，异丙酚血浆靶浓度控制在1.0～2.0μg/ml；微量输液泵推注舒芬太尼(1.0μg·kg-1·h-1)，分别于切皮时和劈胸骨时推注舒芬太尼(0.5μg/kg)，维持BIS值在40～60,间断推注哌库溴铵(2mg)维持肌肉松弛。L组麻醉诱导后通过中心静脉输注磷酸肌酸钠15mg/kg（溶于100ml生理盐水）、C组静脉输注等容量生理盐水，均要求在30min内输注完毕。术中经右侧颈内静脉泵入多巴胺（2～5μg·kg-1·min-1）、硝酸甘油（0.1～0.5μg·kg-1·min-1）和去甲肾上腺素（0.01～0.05μg·kg-1·min-1）维持血流动力学指标稳定。术毕带气管导管送回ICU。所有患者均在以下时间点从左侧桡动脉通路采集血样：麻醉诱导前(T0),手术开始时(T1),主动脉侧壁阻断后(T2),主动脉侧壁开放后(T3),术毕即刻(T4)，术后24小时(T5)和术后48小时(T6)。分别于麻醉诱导前(T0),手术开始时(T1),主动脉侧壁阻断后(T2),主动脉侧壁开放后(T3),术毕即刻(T4)五个时间点行动脉血气分析检测，记录血乳酸和血糖浓度。并且于麻醉诱导前（T0）,术毕即刻(T4),术后24小时(T5)和术后48小时(T6)行血C-反应蛋白（CRP）、血清肌钙蛋白T(cTnT)、N‐末端脑钠肽前体(NT-pro BNP)检测。于术前1天、术后7天由同一位经过专业培训的医师进行认知功能测试。 数据统计分析采用SPSS12.0版软件包进行资料分析，P<0.05认为差异有统计学意义。计量资料若符合正态分布数据时，以均数±标准差（x±s）表示，若不符合，以中位数（第25百分位数，第75百分位数）表示。组间比较采用成组t检验，组内比较采取配对t检验；若不符合正态分布，采用非参数检验。计数资料比较采用Fisher确切概率法。 结果 1.两组患者基本资料（年龄，身高，体重，性别，受教育年限），术前左室射血分数（EF值）和心功能分级比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 2.两组患者围术期资料（手术时间，主动脉侧壁阻断时间，搭桥支数，术中输液量，术中输血量，拔管时间，ICU滞留时间和术后48小时视觉模拟评分）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 3.两组患者术中药物使用情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 4.两组患者术中血流动力学变化比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 5.两组患者术中血乳酸浓度的比较：L组血乳酸浓度于T2,T3,T4时间点显著低于C组（0.93±0.02mmol/L vs.1.47±0.03mmol/L,0.98±0.09mmol/L vs.1.48±0.08mmol/L,1.05±0.02mmol/L vs.1.48±0.05mmol/L，P<0.05）。 6.两组患者术中血糖浓度的比较：L组血糖浓度于T2,T3,T4时间点显著低于C组（7.03±1.56mmol/L vs.8.00±1.80mmol/L,7.45±1.32mmol/L vs.8.39±1.77mmol/L,8.05±2.54mmol/L vs.9.17±2.30mmol/L，P<0.05）。 7.两组患者CRP浓度于T4时开始上升。L组CRP浓度在T5、T6时间点显著低于同时间点的C组[56.53mg/L（50.24-112.32）vs.90.52mg/L（49.51-152.20）,125.30mg/L（90.25-155.20）vs.161.00mg/L（105.6-256.60），P<0.05]。 8.两组患者cTnT浓度于T4时开始上升。L组cTnT浓度在T5、T6时间点显著低于同时间点的C组[0.12ng/ml（0.10-0.52）vs.0.32ng/ml（0.11-0.85）,0.11ng/ml（

关键词： 慢性缺氧   15-脂氧合酶   NF-κB   锌脂蛋白A20   肺动脉高压   血管新生  

摘要： 第一部分:锌脂蛋白A20在缺氧肺血管新生中的作用及机制　　目的:肺动脉高压是我国临床常见的恶性疾病。慢性缺氧是肺动脉高压的重要诱导因素之一。慢性缺氧诱导的内皮功能障碍和血管新生紊乱失调被视为肺动脉高压发病的重要组成部分。新近研究显示NF-κB调控的锌指蛋白A20可能与缺氧相关。然而，在不同细胞类型中呈现一定的差异。据我们所知，目前A20在缺氧肺动脉血管新生中所发挥的重要作用目前尚不清楚。　　方法:本课题通过western blot、免疫组化、免疫荧光和RT-PCR方法检测缺氧大鼠的肺组织及体外培养的肺动脉内皮细胞中A20的表达情况。继而利用小干扰RNA转染方法特异性干扰A20表达后，进行MTT实验、BrdU实验、流式细胞仪和western blot检测细胞增殖情况。应用Boyden小室迁移实验、小管形成实验和western blot分析内皮细胞的迁移、官腔形成和粘附能力。最后，采用NF-κB抑制剂BAY11-7082以及A20小干扰RNA，验证A20与NF-κB之间的相互作用关系。　　结果:在缺氧动物模型的肺组织中A20分布在血管内皮中并且呈短暂性增加。与对照组细胞相比，A20沉默后的肺动脉内皮细胞在早期缺氧条件下增殖能力加强。同时，细胞迁移、管腔形成和粘附分子表达情况在A20表达干扰后也明显增加。此外，孵育BAY11-7082后抑制了内皮细胞中缺氧诱导的A20表达，而A20缺乏后导致NF-κB活力进一步提高。　　结论:综上，本研究证实了缺氧肺动脉内皮细胞中A20短暂增加。并且抑制A20可导致缺氧早期血管新生作用加强。其作用机制与NF-κB和A20之间的密切的相互调控作用相关。暗示持续缺氧条件下肺动脉内皮细胞中A20增加可能有助于抵制血管新生。这些新的证据为揭示缺氧性肺动脉高压的病理机制提供了重要的理论基础，有利于提出新的治疗方案。　　第二部分:15-HETE通过与NF-κB相互作用促进肺动脉炎症反应　　目的:本实验室前期研究成果证明15-脂氧合酶(15-LO)/15-羟化二十碳四烯酸(15-hydroxyeicosatetraenoic acid,15-HETE)是肺动脉高压疾病发生发展过程中缺氧性肺动脉血管收缩和重构的中心介导因子。慢性缺氧诱导的血管周炎症细胞浸润与促炎症因子增加，在肺动脉高压的临床病例中已有报道，被视为肺动脉高压疾病的重要病理阶段。然而其病理机制十分复杂，目前尚未明确。本研究的目的在于探索15-HETE在缺氧性肺动脉血管炎症反应中的作用及机制。　　方法:首先，15-LO抑制剂，NDGA和CDC，以及15-LO1/2小干扰RNA用于抑制内源性15-HETE。我们采用免疫组化实验，对单核巨噬细胞的浸润情况进行分析。通过免疫组化实验，western blot分析和RT-PCR检测缺氧大鼠模型以及培养的肺动脉内皮细胞中，细胞间粘附分子和血管细胞粘附分子的表达水平。应用western blot，免疫荧光化学和荧光素酶报告基因测定NF-κB的活性。最后，不同浓度梯度的BAY11-7082和PDTC，NF-κB阻断剂，用于明确细胞NF-κB的活性对15-LO蛋白表达的影响。　　结果:我们发现缺氧条件下肺动脉血管周单核巨噬细胞的浸润，以及细胞黏附分子的表达，被15-HETE阻断剂或者15-LO1/2小干扰RNA显著抑制。并且，外源性15-HETE可以时间依赖性方式促进两种细胞粘附分子在肺动脉内皮细胞中的表达水平。15-LO1/2代谢产物，15-HETE可促进NF-κB的活性。同时，NF-κB的阻断剂可明显抑制缺氧肺动脉内皮细胞中15-LO1/2的表达。　　结论:我们的实验结果表明慢性缺氧促进单核巨噬细胞向血管系统浸润，以及肺动脉内皮细胞中细胞粘附分子表达增加，其作用机制是通过15-LO/15-HETE与NF-κB之间的正性相互作用。　　本研究揭示了缺氧诱导的肺动脉炎症反应的新机制，为治疗肺动脉高压这一高危性疾病提供了以15-LO/15-HETE与NF-κB为靶点的新的治疗策略。