关键词： 活性改变   炎症状态   混合功能氧化酶   CYP450   CYP1A2   基因家族   环境致癌物   亚铁血红素  

摘要： 肝脏细胞色素P450（cytochromeP450，CYP450）氧化酶又称混合功能氧化酶和单加氧酶，广泛存在于动物、植物、微生物的各种组织中，是负责大多数临床药物、环境致癌物、外源毒物及内源活性物质生物转化的主要酶系统，具有重要的药理、生理及病理学意义。CYP450是一类亚铁血红素一硫醇盐蛋白的基因超家族，由不同的基因家族和亚家族组成，其中与药物代谢关系最为密切的主要有CYP1A2、

关键词： 慢性心力衰竭   炎症状态   毛冬青  

摘要： 目的观察毛冬青对SD大鼠慢性心力衰竭(CHF)炎症相关因子及心功能的影响。方法将60只雄性SD大鼠随机分为模型组和假手术组,模型组50只,假手术组10只。结扎腹主动脉建立CHF模型,将模型复制成功的大鼠随机分为4组:毛冬青低剂量组,毛冬青高剂量组,卡托普利组和模型组。分别给予毛冬青、卡托普利或生理盐水灌胃,2周后行经胸超声心动图检测,测定血清白介素-1β(IL-1β)和核因子κB(NF-κB)。结果毛冬青高、低剂量组CHF大鼠血清IL-1β、NF-κB水平明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。心脏彩超显示:毛冬青高、低剂量组大鼠提高射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论毛冬青可以改善慢性心力衰竭的炎症状态和心功能。

关键词： 免疫细胞   运动行为特征   炎症反应   光学成像技术  

摘要： 物理创伤、化学损伤和病原物侵袭均能够引发机体的炎症反应。光学成像技术已逐渐用于炎症反应的活体研究。光学成像技术具有高时空分辨率的特点，可以直观可视化地研究炎症微环境中免疫细胞的聚集、吞噬、凋亡及细胞接触等过程。中性粒细胞、单核巨噬细胞（MMs）和树突细胞（DC）等免疫细胞在炎症反应中发挥重要的抗原吞噬和抗原提呈作用，但是，这些免疫细胞在炎症反应中的运动行为特征仍不完全清楚，尤其缺乏同时对多种免疫细胞进行长时程活体非侵入式监测所获得的时空动态信息。因此，本研究利用足垫和淋巴结外植体成像模型，对中性粒细胞、MMs细胞和DC细胞在卵清蛋白（OVA）诱导的迟发型超敏反应（DTH）和细菌炎症反应中的时空动态运动行为特征进行了阐释。本研究一方面从运动学角度深入了解了免疫细胞在炎症反应中的功能，另一方面从免疫细胞运动的角度展示了雷帕霉素（Rapamycin/RAPA）在抗炎作用中的免疫抑制效应。\n 主要结果如下：\n 1）建立了用于研究炎症反应中免疫细胞运动行为特征的活体多层次光学成像方法。运用整体荧光成像技术动态监测免疫细胞的聚集，采用大视野扫描显微成像技术研究免疫细胞的动态分布，同时通过共聚焦时实扫描成像来获得免疫细胞的动态信息。\n 2）运用活体光学成像技术研究了雷帕霉素对DTH的免疫抑制效果。结果显示，在炎症反应的触发阶段，中性粒细胞和MMs细胞在抗原刺激后的24 h明显聚集。雷帕霉素给药处理的炎症反应中，抗原刺激后4h雷帕霉素促进了中性粒细胞的聚集并增加了血管的通透性；抗原刺激后48 h中性粒细胞在炎症部位的聚集明显受到抑制（抑制率>50％），同时推迟了MMs细胞在炎症部位的募集。雷帕霉素处理的炎症反应中，抗原刺激后4 h免疫细胞的运动特征同其在DTH反应抗原刺激后24 h的运动特征类似，这些运动参数包括免疫细胞的平均运动速度、滞留时间、平均位移和限制性系数等。结合对细胞因子的检测结果，可以推测雷帕霉素缩短了DTH反应的准备阶段，同时减弱了反应期的反应强度，这一过程可能涉及T辅助2型细胞（Th2）或调节性T细胞（Treg）。\n 3）研究了雷帕霉素对DC表型和功能的调节作用。研究结果表明，雷帕霉素减小了DC细胞的体积，显著降低了共刺激分子CD80的表达；抑制了DC细胞的抗原吞噬能力和DC细胞刺激作用下抗原特异性或非特异性淋巴细胞的增殖能力，停止雷帕霉素药物处理一段时间后这种抑制效果可以被逆转。此外，雷帕霉素明显缩短了DC与T细胞长时间接触（>15分钟）的比率，该比率的降低在雷帕霉素抑制DTH反应中发挥着重要作用。\n 4）建立了研究足垫细菌炎症反应的非侵入性三色成像模型，可对细菌、中性粒细胞和 MMs细胞进行同步成像。研究发现，诱发炎症反应的大肠杆菌（***）三天内大大减少；中性粒细胞在细菌刺激后4 h迅速聚集，4-24 h运动活跃，48-72 h运动能力减弱，并出现大量的细胞碎片。同时，MMs细胞在炎症反应后24 h到72h大量聚集，但此时其运动速度减慢、滞留时间增加、运动范围缩小。此外，吞噬了细菌的MMs细胞，在快速运动时发生了细胞结构的解体。这些结果进一步揭示了机体免疫系统抵抗病原物的动态行为变化。\n 综上所述，本研究建立了用于免疫细胞动态特征研究的多层次光学成像方法，并成功获取炎症反应过程免疫细胞的聚集、分布、迁移和接触等动态信息。雷帕霉素对免疫细胞运动特征的影响，揭示了其可能的抗炎机制。此外，本研究还建立了用于细菌炎症反应研究的非侵入式三色成像模型。本研究所建立的活体免疫光学成像技术可以从组织水平到细胞水平对多种免疫细胞在免疫反应中的动态变化进行观测。利用免疫光学成像技术对雷帕霉素抗炎作用的深入探讨说明这些技术可以应用于更多的免疫反应研究和免疫治疗效应评价。

关键词： 冠心病   经皮冠状动脉介入术   氧化脂蛋白(a)   β2糖蛋白Ⅰ   复合物   氧化应激   炎症状态  

摘要： 背景及目的:冠心病(coronary heart disease，CHD)在欧美以及许多发达国家人群死亡的原因中排名第一位。在国内，城市人群冠心病发病率较农村要高，而且近年来呈不断上升趋势。氧化脂蛋白(a)[Oxidized lipoprotein(a)，ox-Lp(a)]以及β2糖蛋白Ⅰ（β2-glycoproteinⅠ，β2-GPⅠ）氧化脂蛋白复合物和低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)一样，被认为是冠心病形成的主要原因。经皮冠状动脉介入治疗术（percutaneous coronary intervention，PCI）是急性心肌梗死和急性冠脉综合症的首选治疗手段，但是治疗过程中不可避免的对机体有所损伤。本文研究目的是通过检测比较CHD患者PCI前、后血清ox-Lp(a)和β2-GPI-ox-Lp(a)复合物水平，探讨这两种指标能否反映PCI术后的炎症和氧化应激状态。　　方法:分别于PCI术前及术后3天收集60例CHD患者血清标本，同时收集35例非CHD者冠状动脉造影前及造影后3天左右的血样。血清ox-Lp(a)和β2-GPI-ox-Lp(a)水平测定均采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA方法)。同时测定血清样本的总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）与脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]等常规血脂指标以及炎症指标超敏C-反应蛋白（high-sensitivity c-reactiveprotein，hs-CRP)水平，分析患者冠状动脉造影(coronary arteriography，CAG)及PCI前后的变化以及与血管狭窄比例及病变支数的相关性，评估其临床应用价值。　　结果:CHD患者PCI术后hs-CRP水平显著高于PCI术前（9.31±8.22 mg/L vs4.96±5.57mg/L，P＜0.05）;血清ox-Lp(a)(10.51±9.39 mg/L vs7.38±6.65 mg/L，P＜0.05)和β2-GPI-ox-Lp(a)(1.70±2.37 U/mL vs0.91±1.07 U/mL，P＜0.05)水平在PCI术后也显著升高;而其他常规血脂水平PCI术后无明显变化。相关性分析显示，CHD患者PCI术前血清ox-Lp(a)含量与冠状动脉狭窄比例和病变支数呈显著正相关关系（分别为r=0.413，P=0.006和r=0.309，P=0.027）。同样，β2-GPI-ox-Lp(a)也与上述两指标显著正相关(分别为r=0.421，P=0.005和r=0.344，P=0.015)。无论PCI前还是后，β2-GPI-ox-Lp(a)和ox-Lp(a)之间均显呈著正相关关系（分别为r=0.498，P＜0.0001和r=0.514，P＜0.0001）。此外，冠状动脉造影也导致β2-GPI-ox-Lp(a)水平升高。　　结论:PCI可引起机体一定的氧化应激和炎症状态，导致炎症因子hs-CRP水平升高，同时导致血清ox-Lp(a)和β2-GPI-ox-Lp(a)水平增加。因此，ox-Lp(a)和β2-GPI-ox-Lp(a)两种指标与hs-CRP联合检测将可能更有助于监控PCI术所引起的机体氧化应激和炎症状态。

关键词： 大动脉粥样硬化性脑梗死   调节T细胞   预后评估   发病机制   免疫炎症反应   调节机制  

摘要： 脑卒中已经成为当今世界第二大致死及成人致残的主要原因，在脑卒中患者中，脑梗死患者占所有患者的80％。尽管目前有许多研究表明Treg细胞在脑梗死发生后有调节免疫炎症反应、抑制病灶的发展、促进组织的修复等作用，但是有关Treg细胞在脑梗死后的时间及空间动力学变化及在脑梗死后的作用及相关机制仍存在着争议，因此我们的研究目的为:1.检测大动脉粥样硬化性脑梗死患者、动脉粥样硬化患者、正常对照者外周血中Treg细胞的水平，比较三者是否不一样;2.分析Treg细胞水平是否受卒中严重程度（NISS评估）、梗死部位、年龄、性别等方面的影响;3.分析Treg细胞水平是否受炎症指标、血脂、尿酸等的影响。　　研究方法:筛选45例症状发生后3天内的大动脉粥样硬化性脑梗死患者、25例动脉粥样硬化的头晕患者及20例正常对照者，用流式细胞仪检测Treg细胞在外周血CD4+T细胞中的频率，定量PCR检测转录因子FOXP3的mRNA水平， ELISA检测其相关细胞因子IL-10的表达;并分别对脑梗死患者进行卒中严重程度(NISS评估)、卒中结局（mRS、BI指数）、汉密尔顿焦虑、抑郁量表等量表的评估，并收集各组的一般临床资料。　　结果:1..动脉粥样硬化组外周血CD4+T细胞中Treg细胞水平较对照组低。2.急性大动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血CD4+T细胞中Treg细胞水平在发病第3天较对照组低;3.急性脑梗死患者Treg细胞水平受疾病严重程度的影响;4.急性脑梗死患者Treg细胞水平不受患者性别、梗死部位、高血压病、糖尿病等的影响;5.急性脑梗死患者Treg水平不受血脂、尿酸、同型半胱氨酸、超敏CRP等的影响。　　结论:Treg细胞参与了大动脉粥样硬化性脑梗死的发生、发展过程，其水平可作为评估脑梗死预后的一个指标，改变Treg细胞水平可能可以成为一种新的治疗脑梗死的方案。

关键词： Forsythin   JAK-STAT   p38   MAPK   ROS   RAW264.7   cells  

摘要： 连翘是一种落叶灌木,广泛分布在中国、韩国、日本,在许多欧洲国家也有分布。它的果实是我国的传统中药,可以治疗发热、疼痛、急性炎症等。已有研究表明,连翘果实提取物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、止吐、抗炎的功效,本实验所用连翘苷(Forsythin)是一种连翘果实提取物,已有报道表明连翘苷具有抗氧化和抗菌的作用。到目前为止,连翘苷的抗炎作用研究较少,其抗炎相关的机制研究尚未有人报道。 LPS为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,是引发脓毒症的主要元凶。本实验以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究模型,探索FOR对LPS引起的炎症反应的影响及其可能存在的机制。LPS侵入机体后可以激活单核巨噬细胞,诱导其释放大量的促炎因子和介质,如IL-1、IL-6、TNF-α、NO、PGE2等。因而,调节这些炎症分子的生成是治疗各种炎症相关疾病的重要靶点。 本实验证明了FOR可以剂量依赖性的抑制LPS引起的RAW264.7细胞IL-1、IL-6、TNF-α、NO、PGE2的释放,同时,LPS在转录水平上抑制了iNOS和COX-2的表达。在机制层面上我们发现FOR显著的抑制了LPS激活的JAK-STATs和p38MAPKs信号通路,但是对NF-κB没有影响。抑制剂的处理实验更加证明了FOR是通过抑制JAK-STATs和p38MAPKs信号通路来减少上述促炎因子和介质的释放。此外,FOR可以通过减少LPS刺激引起的RAW264.7细胞ROS的积累来抑制JAK-STATs和p38MAPKs信号通路,通过其抗氧化的作用发挥抑炎效果。

关键词： 高脂血症   黄连解毒汤   炎症因子   肠道菌群   PCR-DGGE   荧光定量PCR  

摘要： 研究目的 本论文采用高脂饮食建立实验性高脂血症动物模型,通过检测小鼠外周血内毒素、肿瘤坏死因子(TNF-α)以及白介素-6(IL-6)水平,研究中医经典方剂黄连解毒汤抗高脂血症状态下炎症的机制,并利用PCR-DGEE指纹图谱和实时荧光定量PCR技术研究黄连解毒汤对高脂血症小鼠肠道菌群变化的影响。 研究方法 将48只C57BL/6雄性小鼠随机分为6组：常规饮食组；常规饮食加抗生素组；高脂饮食组；高脂饮食加抗生素组；高脂饮食加黄连解毒汤高剂量组；高脂饮食加黄连解毒汤低剂量组。常规饮食组和高脂饮食组分别进食普通饲料和高脂饲料8周；黄连解毒汤组进食高脂饲料6周后分别给予高、低浓度黄连解毒汤,每只动物每天灌胃0.4mL,连续灌胃2周；抗生素组分别进食普通饲料和高脂饲料6周后用抗生素,自由饮用2周。8周后,进行血清TNF-α、IL-6和内毒素含量的检测,利用PCR-DGEE指纹图谱和实时荧光定量PCR技术进行肠道内菌群结构和种类的分析。 研究结果 1.高脂饮食组小鼠血液中总胆固醇(TC)水平显著升高,黄连解毒汤组小鼠总胆固醇水平在黄连解毒汤干预2周后无显著改变； 2.高脂血症小鼠血清中肿瘤坏死因子、白介素-6和内毒素含量明显升高,黄连解毒汤低剂量组小鼠在黄连解毒汤干预2周后,血清中的肿瘤坏死因子、白介素-6和内毒素含量均有明显下调,黄连解毒汤高剂量组各指标没有出现明显变化； 3.高脂饮食组肠道内细菌种类较多,多样性程度也比较高,正常饮食组及黄连解毒汤高、低剂量组次之,两个抗生素组小鼠肠道内细菌种类和多样性程度最低。黄连解毒汤高、低剂量组肠道的细菌种类和多样性比较相近,形成了相对稳定的细菌群落结构； 4.两抗生素组小鼠肠道内的三种益生菌几乎没有表达,与高脂饮食组相比,常规饮食组和黄连解毒汤高剂量组拟杆菌表达量显著升高,常规饮食组和黄连解毒汤低剂量组双歧杆菌表达量显著升高,黄连解毒汤高剂量组和黄连解毒汤低剂量组乳酸杆菌表达量明显增加。与常规饮食组相比,黄连解毒汤高剂量组和黄连解毒汤低剂量组乳酸杆菌表达量显著升高。 研究结论 黄连解毒汤低剂量具有改善高脂血症状态下的代谢性炎症的作用,并且对高脂血症状态下的内毒素水平具有明显下调的作用。高胆固醇饮食可以改变肠道菌落结构,变化的细菌可能与脂质代谢密切相关,从而影响高脂血症的发生发展。黄连解毒汤可以抑制影响脂质代谢的细菌的生长,调节肠道形成新的、更有益于脂质代谢的、稳定的菌落结构。高脂血症小鼠肠道中的益生菌受到了抑制,而黄连解毒汤低剂量对肠道益生菌具有良性调节作用。

关键词： 脓毒症   发病机理   炎症反应   大肠埃希菌   动物模型  

摘要： 脓毒症是指由严重感染、创伤、烧伤和急危重病等引起的全身性炎症反应综合征（SIRS），进一步可发展成为严重脓毒症、脓毒性休克及多器官功能障碍综合征(MODS)，甚至死亡。而临床上约有95％脓毒症病人与细菌感染有关，其中约有60％以上的脓毒症病人因G-细菌感染所致。目前，由脓毒症引起的脓毒症休克和多器官功能障碍已成为重症监护病房(ICU)的最常见死因。由于脓毒症的发病机制相当繁杂，即即使在转化医学高度发展的今天，临床治疗依然收效甚微，死亡率高居不下。因此，进一步探讨脓毒症的发生机制、寻找到新的预防、治疗手段已成为亟需解决的重要科学问题。　　一氧化碳(carbon oxide，CO)曾被认为是破坏细胞呼吸作用的有害气体。最新研究发现CO是一种气体信号分子的，在损伤诱导的各种机体应激中具有保护组织、细胞，抗炎、抗凋亡、抑制排斥反应等作用。由于CO气体不易控制性，近来新合成一种新型的羰基化合物——外源性一氧化碳(tricarbonyldichlororuthenium(Ⅱ) dimer, CORM-2)被二甲基亚砜(DMSO)溶解后可以体内生理溶解缓慢释放出CO，具有潜在的药用价值。　　当前，因革兰氏阴性细菌感染导致脓毒症的具体机制研究成果并不多，影响临床治疗效果。本研究系统阐述了脓毒症时各重要脏器的炎症发应及一氧化碳的干预机制并以大肠埃希菌(Escherichia coli，***)为研究对象，通过CORM-2干预后，深入地研究了CORM-2对大肠埃希菌活力和毒力（致病性）的抑制作用，探讨了该对炎症反应抑制作用的分子机制，为临床脓毒症的救治提供了新的思路。　　第一部分外源性一氧化碳（CO releasing molecules-2）对脓毒症小鼠重要脏器炎症反应的抑制作用及分子机制的研究　　目的:为了研究脓毒症时机体的炎症反应，通过经典的盲肠结扎穿刺法(cecal ligation and puncture，CLP)小鼠的脓毒症模型，探讨外源性一氧化碳（CORM-2）对脓毒症时机体炎症反应的抑制作用及其分子机制。　　方法:6-8w大小的C57BL/6小鼠，雄性。常规饲养1 w后实验。28只随机数字表法分为四组，分别为对照组(n=7)，CLP组(n=7)，CLP+CORM-2组(n=7)和CLP+iCORM-2组(n=7)。CLP组常规行盲肠结扎与穿孔，建立脓毒症小鼠模型，CLP+CORM-2组在CLP后立即静脉注射CORM-2(8.0mg/kg)，对照组为假手术组。测定CLP24 h后肝、肺、凝血系统等重要器官的炎症反应指标，如:组织病理切片、肺泡灌洗液、器官功能和ICAM-1表达等，以及NF-κB和JAK/STAT等重要信号通路的动态变化。　　结果:CLP术后24h小鼠重要脏器（肝、肺、凝血系统）功能明显受损，细胞因子TNF-α、IL-1β表达明显增加，髓过氧化物酶(MPO)活性增高，ICAM-1等粘附分子的表达明显上调。重要的信号分子NF-KB活性明显提高、核转移增加;信号通路JAK/STAT中重要的信号分子磷酸化水平明显提高，外源性一氧化碳(CORM-2)干预后上述相应的指标显著降低，小鼠脏器炎症反应得到明显抑制，重要信号分子磷酸化水平明显下降。　　结论:CLP脓毒症小鼠个脏器炎症较重，器官和功能明显受损。CORM-2可以有效的抑制炎症反应，其机制可能是通过调控重要的信号通路NF-κB和JAK/STAT实现。　　第二部分外源性一氧化碳(CO releasing molecules-2)对大肠埃希菌活力抑制作用的实验研究　　目的:既往研究证实，临床脓毒症病人95％与细菌感染有关，其中约有60％以上的脓毒症病人因G-细菌感染所致。而革兰氏阴性细菌感染导致脓毒症的具体机制研究甚少，采取相应的临床治疗对策与手段相当缺乏。本研究以大肠埃希菌(Escherichia coli，***)为研究对象，通过CORM-2干预后，系统的研究了CORM-2对大肠埃希菌活力的抑制作用，深入探讨了该抑制作用的分子机制。　　方法:采用大肠埃希菌的标准菌株(ATCC25922)，应用CORM-2进行干预。按随机数字表法分为五组:***组(n=6)，***+1.2mM CORM-2组(n=6)，***+1.2mM iCORM-2组(n=6),***+1.6mM CORM-2组(n=6)和***+1.6mM iCORM-2组(n=6)。检测大肠埃希菌的生长曲线、菌落计数、细菌负染及扫描电镜(SEM)超微结构，同时应用细菌基因芯片技术筛选了三个有明显差异的目的基因，进一步施行PCR验证。　　结果:研究证实:大肠埃希菌在CORM-2干预下，生长明显受到抑制，菌落计数显著降低;细菌负染及扫描电镜结果显示:经过CORM-2干预后的细

关键词： 气道上皮细胞   LPS   p120   NF-κB   炎症反应   p120   炎症反应   RhoA   NF-κB  

摘要： 一、目的 本实验采用脂多糖(LPS)刺激体外培养的人气道上皮细胞建立气道上皮炎症反应模型,检测连环素p120(简称p120)蛋白的表达变化、NF-kB信号通路的活化及其下游靶基因IL-8的表达变化,初步探讨人体气道炎症发生的分子机制。 二、方法 根据MTT结果及本实验室前期研究,选取20μg/ml LPS作为致炎因子处理培养的人气道上皮细胞；运用免疫荧光、细胞核浆分离提取蛋白及Western blot技术检测刺激前后p120、抑制蛋白IkBa及NF-kB亚基p65蛋白表达的改变及p65是否发生核内转位；运用ELISA和荧光实时定量PCR技术分别检测IL-8表达量的改变；运用瞬时转染及特异性siRNA技术以增强或敲低细胞中p120的表达,进一步验证p120与NF-kB信号通路之间的关系。 三、结果 Ⅰ.Western blot、荧光实时定量PCR及免疫荧光染色证实p120存在于人气道上皮细胞中,而且,与对照组比较,LPS刺激后p120蛋白表达下调。 Ⅱ.细胞核浆分离提蛋白及Western blot技术检测发现LPS刺激人气道上皮细胞后,NF-κB信号通路活化——NF-κB p65总蛋白表达增多,而且转位入核,其抑制蛋白IκBα表达逐渐减少。同时,荧光实时定量PCR和ELISA显示NF-κB下游的靶基因IL-8的表达量较未给予LPS刺激的对照组明显增多,差异具有显著性。 Ⅲ.外源性高表达p120及siRNA技术使细胞中p120低表达后,进一步验证p120与NF-kB信号通路之间的关系。实验结果表明,外源性p120过表达后,NF-kB p65总蛋白量几乎无改变,p65未发生核转位,IL-8的表达水平变化不大。然而,LPS刺激后,过表达组IL-8表达较对照组明显降低(P<0.001)。p120敲低后NF-kB信号通路显著活化——NF-kB p65总蛋白表达增多,p65转位入核,IL-8表达水平增加(P<0.001)。进一步证明LPS诱导的气道炎症反应中,p120可能通过负性调控NF-kB信号通路抑制炎症反应。四、结论 LPS诱导的气道炎症反应中,p120蛋白表达下调,NF-kB信号通路活化；过表达p120可抑制NF-kB信号通路,敲低p120后NF-kB信号通路显著活化。我们推测,LPS刺激可能通过下调p120进而活化NF-kB信号通路引起气道上皮的炎症反应。 一、目的 本实验通过LPS刺激及机械划伤建立体外培养的人气道上皮细胞炎症反应模型,检测RhoGTP酶家族蛋白RhoA活性变化及其与p120、NF-kB之间的关系,探讨气道炎症中p120调控NF-kB信号通路活化的可能分子机制。 二、方法 运用免疫共沉淀及Western blot方法检测刺激前后RhoA总蛋白表达改变及其与p120的结合情况：运用G-LISA方法检测RhoA活性变化；采用RhoA下游ROCK抑制剂Y26732抑制RhoA活性后,通过细胞核浆分离提取蛋白及Western blot检测NF-kB的活性变化；使用瞬时转染外源性p120质粒及特异性siRNA技术干预p120表达,进一步观测气道上皮细胞中RhoA活性变化及其与p120、NF-κB之间的关系。 三、结果 Ⅰ.免疫共沉淀结果首次显示气道上皮细胞中RhoA与p120相互作用并存在于同一复合物中。 ***刺激和机械划伤方法处理气道上皮细胞后,Western blot及免疫共沉淀结果显示RhoA总蛋白以及与p120结合的RhoA蛋白改变不明显,但G-LISA检测发现RhoA活性显著上升。 Ⅲ.运用抑制剂Y27632抑制RhoA活性后,细胞核浆分离提取蛋白及Western blot结果显示气道炎症反应中NF-kB p65亚基的入核被部分抑制。 Ⅳ.p120过表达后,与对照组相比,尽管RhoA活性无变化,但LPS刺激后,p120过表达组RhoA活性明显下降(P<0.001)；同样,机械划伤刺激后,p120AN过表达组RhoA活性明显下降(P<0.05),同时,IL-8表达下调。 ***敲低p120后,RhoA总蛋白无变化,与p120结合的RhoA随着p120表达缺失而无法检测。G-LISA检测发现RhoA活性显著上升,LPS刺激和机械划伤后,RhoA活性升高更为显著(P<0.001及P<0.05)。同时,机械划伤后IL-8表达增加,差异具有显著性。 四、结论 Ⅰ.气道上皮细胞中,RhoA与p120存在于同一复合物中。气道炎症反应中,虽然RhoA总蛋白以及和p120结合的RhoA蛋白无变化,但RhoA活化。 Ⅱ.抑制剂Y27632抑制RhoA活性后,NF-kB活化被部分抑制。 Ⅲ

关键词： 脑缺血再灌注损伤   高迁移率族蛋白B1   T细胞   炎症   免疫抑制  

摘要： 研究背景：缺血性脑卒中是发病率和致残率最高的疾病之一。缺血区血管可因再通而发生脑缺血再灌注损伤(CIRI)。CIRI诱导脑组织炎症反应和外周免疫系统抑制(SIID,以淋巴细胞数量减少,功能抑制为主要特征,其诱导感染发生率增高)双向效应,目前治疗手段有限。CIRI后,坏死神经元释放高迁移率蛋白B1(HMGB1),其是一种细胞因子样蛋白,在CIRI病理过程中发挥重要作用。前人研究表明CIRI后,小胶质细胞/巨噬细胞、中性粒细胞及T细胞等免疫细胞浸润于缺血区,参与脑组织炎症反应。已经证实,HMGB1的致炎效应,可通过作用于小胶质细胞/巨噬细胞而发挥和传递。HMGB1是否同时作用于浸润的T细胞,甚至因T细胞与巨噬细胞有交互作用而通过T细胞再间接作用于巨噬细胞,目前还不清楚。不仅如此,CIRI后,HMGB1尚可通过破损的血脑屏障进入脑脊液甚至外周血。前人研究报导,大剂量HMGB1可通过作用于树突状细胞(DCs)或者直接作用于T细胞,诱导T细胞免疫功能抑制,而脑卒中后大量入血的HMGB1,是否与外周淋巴细胞数量和功能改变有关,是否介导SIID的发生,目前尚无研究报导。 研究目的：拟采用局灶性脑缺血再灌注损伤模型,应用HMGB1抑制剂Glycyrrhizin(甘草甜素),观察CIRI后,HMGB1在缺血脑组织中的定位和表达情况,脑组织炎症反应情况,以及外周器官中T细胞数量改变,同时采用T细胞缺陷动物,离体和在体观察T细胞缺陷,对HMGB1效应的影响及二者的相关性,旨在探讨HMGB1在CIRI诱导的脑组织炎症反应和外周免疫抑制中的效应及机制,为脑卒中的治疗和预后提供新靶标。 研究方法：本研究首先采用野生型Sprague Dawley (SD)大鼠及CD57BL/6J小鼠,建立大脑中动脉短暂性阻塞的局灶性脑缺血再灌注损伤模型(MCAO),于再灌注后12、48及72小时,免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察HMGB1在缺血脑组织、局部神经元和小胶质细胞/巨噬细胞中的定位、表达情况。而后,于动物腹腔在MCAO再灌注后即刻及3.5小时各注射一次Glycyrrhizin,TTC染色法观察大鼠脑梗塞体积,免疫荧光染色法检测缺血区小胶质细胞/巨噬细胞和中性粒细胞浸润情况,以及流式细胞仪检测缺血大脑半球单核/巨噬细胞、淋巴细胞及其亚型CD4+、CD8+T细胞等免疫细胞的数量,以探讨HMGB1对CIRI脑组织炎症和脑损伤的效应及机制。然后,采用野生型SD大鼠及T细胞缺陷的裸大鼠,在短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO)及永久性电凝大脑中动脉远端的永久性局灶性脑缺血再灌注损伤(dMCAO)两种模型中,以及CD57BL/6J野生型小鼠及T、B联合缺陷的SCID小鼠MCAO模型中,以Glycyrrhizin抑制IMGB1, TTC染色法检测再灌注72小时后,动物脑梗塞体积,探讨T细胞缺陷对HMGB1脑损伤效应的影响;接着,将来源于野生型小鼠的脾细胞,过继回输给SCID小鼠,在有无Glycyrrhizin处理之下,观察脑梗塞体积变化,反向验证上述发现;另外,离体将来源于野生型与SCID小鼠的脾细胞,在刀豆蛋白A (ConA)刺激后,与神经元共培养,CCK-8试剂盒检测HMGB1有无被Glycyrrhizin抑制下,神经元的存活率,观察脾细胞对神经元的杀伤效应,进一步验证和支持T细胞缺陷对HMGB1作用的影响。接下来,采用Western-blot和ELISA分别检测MCAO后24小时脑脊液,以及MCAO后5、24、48小时血清中HMGB1水平以及Glycyrrhizin的效应,同时采用流式细胞仪,检测HMGB1有无被Glycyrrhizin抑制下,外周血和脾脏中单个核细胞总数,以及单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞及其亚型CD4+、CD8+T细胞等免疫细胞的数量,以探讨外周血高水平释放的HMGB1,与外周器官淋巴细胞数量减少的相关性。 实验结果：1、免疫荧光染色显示HMGB1早在小鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)后12小时即从神经元胞核转移到胞浆,48小时释放至胞外同时伴NeuN+神经元数量减少;与此同时,CIRI后24小时WB检测到脑脊液和ELISA检测到血浆HMGB1高水平表达;2、免疫荧光显示CIRI后72小时脑缺血核心区CD68+小胶质细胞/巨噬细胞及MPO+中性粒细胞浸润增多,而且浸润的小胶质细胞/巨噬细胞亦表达HMGB1;3、应用HMGB1抑制剂Glycyrrhizin,TTC染色显示野生型大鼠脑梗塞体积减小,免疫荧光显示脑损伤核心区小胶质细胞/巨噬细胞和中性粒细胞浸润数量减少,NeuN+神经元数量增多,HMGB1转位和胞外释放减轻;4、流式检测显示缺血再灌注后脑损伤侧包括T细胞,CD4+、CD8+T细胞,NK, NKT及B细胞淋巴细胞数量增多,而Glycyrrhi