关键词： 枸橼酸钠抗凝   连续性肾脏替代治疗   炎症状态   安全性  

摘要： 目的:通过分析枸酸钠在重症AKI患者中行CRRT治疗前后相关临床指标的变化,探讨枸橼酸钠抗凝对体内炎症状态影响,使用安全性及抗凝效果。方法:本文随机抽取新疆医科大学第一附属医院重症监护病房(ICU)2018年1月-2019年12月行CRRT治疗的急性肾损伤患者枸橼酸钠组(有出血倾向或外科围手术期)和低分子肝素钠组(无出血倾向)各50例。比较两组治疗前后降钙原(PCT)、白细胞介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP);白细胞计数(WBC)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR);凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT);血清总钙、血镁、血磷;临床疗效。结果:共100例/207台次纳入本研究,枸橼酸钠组50例/103台次,低分子肝素钠组50例/104台次。治疗后,枸橼酸钠组患者IL-6、PCT下降幅度显著高于低分子肝素钠组,差异具有统计学意义(P<0.05),透析治疗24h时枸橼酸钠组患者NLR下降幅度明显高于低分子肝素钠组,差异具有统计学意义(P<0.05)。针对明确合并重症感染AKI患者进行亚组分析,与低分子肝素钠组相比,枸橼酸钠组在透析治疗6h、12h、24h时,IL-6、PCT明显下降,且治疗时长越长,下降幅度越大,差异具有统计学意义(P<0.05)。透析治疗24h WBC下降幅度和透析治疗12h、24h时NLR下降幅度,两组差异均有统计学意义(P<0.05),且枸橼酸钠组下降幅度比低分子肝素钠组大;透析治疗24h时血磷、血镁、血清总钙下降幅度两组之间差异具有统计学意义(P<0.05),血磷与血镁在枸橼酸钠组下降幅度较大,而血清总钙在低分子肝素钠组下降幅度较大。透析治疗6h时,枸橼酸钠组患者APTT、TT延长幅度比低分子肝素钠组小,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。在出院期间,两组之间的肾功能恢复比例,肾功能未恢复比例,连续透析患者比例和死亡患者比例没有显着差异。(P1=1.00;P2=0.832;P3=0.534;P4=0.826)。结论枸橼酸钠抗凝可减轻AKI患者体内炎症状态,降低IL-6、PCT、NLR水平。同时枸橼酸钠抗凝效果理想,并具有较高的安全性。

关键词： 白介素18   白介素18结合蛋白   脂多糖   血小板减少   脓毒症   小鼠  

摘要： 目的:1.分析血小板在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、白介素18(Interleukin-18,IL-18)干预下合成剪辑的白介素18前体信使RNA(Spliced IL-18 m RNA)及Spliced IL-18 RNA的表达量以及给予白介素18抑制剂白介素18结合蛋白(Interleukin-18-binding protein,IL-18BP)抑制IL-18后相应表达量的变化,探究LPS刺激下血小板合成释放IL-18的分子机制。2.分析血小板数量改变、血小板活化量、炎症因子含量及肺组织改变,探索LPS/IL-18刺激下血小板减少症(thrombocytopenia,TCP)小鼠的炎症反应。 方法:1.募集15名健康志愿者,采集静脉全血5ml,并使用枸橼酸钠作为抗凝剂,根据不同的孵育试剂划分实验组为:空白对照组(Sham组)、LPS干预组(LPS组)、IL-18干预组(IL-18组),流式细胞术检测Sham组和LPS组IL-18Rα和IL-I8Rβ表达量;孵育3h后通过q RT-PCR分析血小板中Spliced IL-18 m RNA和Spliced IL-18 RNA的含量,并添加IL-18Bp后,相应的LPS加IL-18抑制剂干预组(LPS/IL-18Bp组)、IL-18抑制剂干预组(IL-18Bp组)、IL-18加IL-18抑制剂干预组(IL-18/IL-18Bp组)和IL-18加TRAF6抑制剂C25-140干预组(IL-18/C25-140组),探索Spliced IL-18 m RNA和Spliced IL-18RNA表达量的变化趋势; 2.根据采血时间点将24只C57BL/6雄性小鼠,8周龄,体重18～21g,按照随机数字表法分为:第1、2、3、4天组4组,小鼠给予单次腹腔注射30 mg/kg LPS制备脓毒症伴血小板减少模型,腹主动脉采取0.5ml血液,检测各组小鼠体重、生存率、血小板数量,采用酶联免疫法检测四天TCP小鼠血浆中IL-18的表达水平;依据干预试剂的不同将36只C57BL/6雄性小鼠,8周龄,体重18～21g,按照随机数字表法分为6组:空白对照组(Sham组)、LPS干预组(LPS组)、IL-18干预组(IL-18组)、LPS加IL-18抑制剂干预组(LPS/IL-18Bp组)、IL-18抑制剂干预组(IL-18Bp组)和IL-18加IL-18抑制剂干预组(IL-18/IL-18Bp组)。IL-18Bp组、IL-18+IL-18Bp组、LPS+IL-18Bp组给予50μg/kg IL-18Bp干预,LPS和LPS+IL-18Bp给予单次腹腔注射30 mg/kg LPS,IL-18和IL-18+IL-18Bp组给予腹腔注射100ng/ml IL-18,空白对照组注射等体积生理盐水。观察各组小鼠72h内生存与死亡情况;造模3天后处死小鼠,取30μl血液检测血小板计数;酶联免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)观察各组小鼠(platelet-rich plasma,PRP)中IL-6、IL-10、IL-18、TNF-α和TGF-β的表达情况;苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察并分析各组小鼠肺部的病理变化;免疫组织化学法观察肺组织中血小板的扣押情况。 结果:1、流式检测结果显示人外周血血小板表面有IL-18受体即IL-18Rα和IL-I8Rβ并且在LPS刺激下IL-18Rα和IL-I8Rβ表达量增加;2、q RT-PCR检测结果显示体外IL-18孵育血小板能够显著增加血小板中Spliced IL-18 m RNA的含量,而添加IL-18天然抑制剂IL-18Bp的孵育能够显著减少血小板中Spliced IL-18m RNA的含量。IL-18刺激人血小板,IL-18 RNA的转录增加。IL-18Bp抑制IL-18后,人血小板对IL-18 RNA的转录减少。添加TRAF6抑制剂C25-140后,q RT-PCR检测结果显示体外C25-140孵育血小板能够减弱IL-18对IL-18 RNA的转录作用,两两组间P<0.05,具有统计学差异。3、与Sham组对比,LPS组小鼠死亡率高,P<0.05,有统计学意义。4、小鼠注射LPS或IL-18后与Sham组相比血小板计数降低,P<0.05。给予IL-18Bp干预,血小板计数升高。与LPS和IL-18组对比,P<0.05,有统计学意义。5、LPS刺激后,TCP小鼠血液中IL-18随着时间逐渐升高,第3天达最大值而后出现下降。6、和sham对比,LPS组、LPS+IL-18Bp组、IL-18组、IL-18+IL-18Bp组在IL-6、I

关键词： 2型糖尿病   肠道屏障   菊粉   枸杞多糖   γδ T细胞  

摘要： 目的研究菊粉（Inulin,INU）和枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides,LBP）通过调节肠道菌群及激活肠上皮内TLR2+γδT细胞对2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）大鼠的作用及机制。方法 1.6周龄,SD雄性大鼠,高脂饲料喂养4周,禁食过夜,链脲佐菌素（STZ）溶液35mg/kg腹腔注射诱导T2DM模型。造模成功后,随机分四组（10只/组）:糖尿病组（T2DM）、糖尿病+菊粉干预组（T2DM+INU）、糖尿病+枸杞多糖干预组（T2DM+LBP）和糖尿病+菊粉+枸杞多糖干预组（T2DM+INU+LBP）。所有大鼠均给予每日灌胃,连续干预8周。2.干预期间,定期测体重（1周/次）和空腹血糖（2周/次）;干预结束后,通过刺激大鼠肛门法收集粪便,用16S r RNA高通量测序分析大鼠肠道微生物群的组成及多样性;气质联用（GS-MS）分析大鼠粪便中短链脂肪酸（SCFAs）的含量。3.干预8周后麻醉处死大鼠,收集血浆（清）和组织样本检测相应指标,包括:（1）大鼠糖化血红蛋白（GHb）用酶联免疫吸附法（ELISA）检测;各组大鼠血清甘油三酯（TG）与总胆固醇（TC）水平用AU400全自动生化分析仪检测。（2）大鼠血浆脂多糖（LPS）水平用鲎试剂法检测;（3）采用大鼠炎症因子试剂盒检测大鼠血浆炎症因子白介素（IL）-1β、IL-6、IL-17A、IL-10及肿瘤坏死因子（TNF）-α的浓度变化。（4）流式细胞仪检测肠上皮内淋巴γδ细胞（γδIELs）、Toll样受体（TLR）2+γδIELs、外周血和脾脏中髓源抑制细胞（MDSCs）;（5）组织免疫荧光原位检测肠道内ZO-1、occludin及TLR2+γδIELs在不同组之间的差异;（6）Western blot法检测肠道内ZO-1、occludin及TLR2的蛋白表达量;（7）相关性分析检测肠道菌群与SCFAs、TLR2+γδIELs、ZO-1和炎症因子的相关性。结果 1.T2DM大鼠的体重、血糖、GHb、血脂、血浆LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-17A的水平在INU和LBP干预8周后有显著的下降,同时血浆抗炎细胞因子IL-10的浓度也呈显著升高。流式细胞术结果表明各干预组γδIELs、TLR2+γδIELs、外周血和脾脏中的MDSCs比例较未干预组均显著升高。2.肠道菌群的测序分析结果显示:在门水平上,与T2DM组相比,各干预组肠道Bacteroidetes（拟杆菌门）和Cyanobacteria（蓝藻菌门）的相对丰度增加,而Deferribacteres（脱铁杆菌门）和Tenericutes（软壁菌门）相对丰度减少。在属水平上,与T2DM组相比,各治疗组肠道Bifidobacterium（双歧杆菌属）、Lactobacillus（乳酸杆菌属）及Alistipes（另枝菌属）相对丰度增加,而Desulfovibrio（脱硫弧菌属）和Blautia（布劳特氏菌属）相对丰度减少。此外,GS-MS结果显示:与T2DM组相比,各治疗组粪便中SCFAs（乙酸、丙酸、丁酸及戊酸）含量均显著增加。3.免疫荧光组化结果:与T2DM组相比,各治疗组肠道内ZO-1、occludin及TLR2+γδIELs在组织中的原位表达均增加。Western blot结果提示:与T2DM组相比,各干预组大鼠肠道内ZO-1及TLR2的蛋白表达量均增加。4.相关性分析结果:肠道Bacteroidetes（拟杆菌门）、Bifidobacterium（双歧杆菌属）及Lactobacillus（乳酸杆菌属）的相对丰度与SCFAs、TLR2+γδIELs、ZO-1的表达量呈正相关,而与促炎细胞因子呈负相关。结论 膳食INU和LBP可以通过调节肠道菌群、SCFAs以及激活肠道粘膜TLR2+γδIELs,增强肠道屏障功能,抑制T2DM全身炎症状态,改善疾病,为其开展临床防治提供了实验数据。

关键词： 高通量血液透析   低通量血液透析   炎症介质   血管钙化  

摘要： 目的:分析高通量血液透析对维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者微炎症状态及血管钙化的影响。方法:选取2020年1月—12月我院60例MHD患者,将其分为高通量血液透析组(high-flux hemodialysis,HFHD)和低通量血液透析组(low-flux hemodialysis,LFHD)。治疗6个月后,对比两组治疗前后超敏C反应蛋白(hsCRP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6)的水平变化,以及对腹主动脉血管钙化的影响。结果:治疗6个月后,HFHD组对超敏C反应蛋白、白介素-6、肿瘤坏死因子-α水平显著下降,且HFHD组显著低于LFHD组(P<0.05);HFHD组腹主动脉血管钙化透析前后变化不明显,LFHD组血管钙化较透析前加重,且LFHD组钙化积分显著高于HFHD组(P<0.05)。结论:高通量血液透析能够有效改善MHD患者的微炎症状态,并延缓血管钙化。

关键词： 血液灌流   尿毒症   白介素-37   白介素-6   FGF-23   微炎症状态  

摘要： 目的 慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）已成为全球主要的公共卫生问题之一。CKD发展到终末期,尿毒症患者的肾脏功能显著下降,血液透析是尿毒症患者治疗最常用的手段。但研究发现常规血液透析的作用局限性明显,尿毒症患者常常出现心血管不良事件、骨质疏松、血管钙化等并发症。微炎症状态、钙磷代谢紊乱被认为是尿毒症发生发展的重要因素。血液灌流联合血液透析是目前应用较为广泛的血液净化方式。本研究旨在探究血液灌流联合血液透析对尿毒症患者微炎症状态及钙磷代谢的影响,为改善尿毒症患者微炎症状态及钙磷代谢选择合适的血液净化方式提供参考依据。方法 本研究筛选2018年5月～2018年12月在青岛市中心医院行维持性血液透析（Maintenance hemodialysis,MHD）的尿毒症患者,按照不同治疗方法将研究对象分为血液透析组（Hemodialysis,HD）、血液透析滤过组（Hemodiafiltration,HDF）、血液灌流联合血液透析组（Hemoperfusion combined with hemodialysis group,HP+HD）。最终纳入HD组50例,HDF组26例,HP+HD组25例,其中HD组包括低通量血液透析组（Low flux hemodialysis,LFHD）20例,高通量血液透析组（High flux hemodialysis,HFHD）30例,选取同期在青岛市中心医院进行健康体检的20名健康成人作为对照组。所有尿毒症患者分别在治疗前和治疗后抽取血标本5ml,采用酶联免疫吸附法（ELISA）分别测定血清白细胞介素-37（Interleukin-37,IL-37）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、成纤维细胞生长因子23（Fibroblast growth factor23,FGF-23）水平,采用免疫比浊法检测血清中超敏C-反应蛋白（High-sensitivity c-reactive protein,hs-CRP）含量表达,全自动生化分析仪测定血清中肌酐、尿素、钙、磷的水平,全自动化学发光分析仪测定β2微球蛋白（β2-microglobulin,β2-MG）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone,i PTH）的水平。同时,测定健康对照组血液样本上述指标的水平。结果 各组性别、年龄差异无统计学意义（P>0.05）,各MHD组患者性别、年龄、透析龄差异无统计学意义（P>0.05）。治疗前各组IL-37、IL-6、FGF-23水平高于对照组（P<0.05）。治疗前HD组、HDF组、HP+HD组之间IL-37、IL-6、FGF-23水平两两比较差异无统计学意义（P>0.05）。HD组治疗后尿素、肌酐水平较治疗前降低（P<0.05）;HDF组治疗后尿素、肌酐水平较治疗前降低（P<0.05）;HP+HD组尿素、肌酐、hs-CRP水平较治疗前降低（P<0.05）。HD组治疗后IL-37、IL-6水平较治疗前差异无统计学意义（P>0.05）;HDF组治疗后IL-37水平较治疗前降低（P<0.05）,IL-6水平较治疗前降低（P<0.05）;HP+HD组治疗后IL-37水平较治疗前降低（P<0.05）,IL-6水平较治疗前水平明显降低（P<0.01）。HD组治疗后i PTH水平较治疗前降低（P<0.05）;HDF组治疗后磷、β2微球蛋白、i PTH水平较治疗前降低（P<0.05）,钙水平较治疗前轻度升高（P<0.05）;HP+HD组磷、β2微球蛋白、i PTH较治疗前降低（P<0.05）,钙水平较治疗前轻度升高（P<0.05）。HFHD组治疗后FGF-23水平较治疗前差异无统计学意义（P>0.05）;HDF组治疗后FGF-23水平较治疗前降低（P<0.05）;HP+HD组治疗后FGF-23水平较治疗前明显降低（P<0.01）。两两比较结果显示HDF组、HP+HD组治疗后IL-37水平低于HD组（P<0.05）。HDF组治疗后IL-6水平低于HD组（P<0.05）,HP+HD组治疗后IL-6水平明显低于HD组（P<0.01）,HP+HD组治疗后IL-6水平低于HDF组（P<0.05）。HDF组治疗后FGF-23水平明显低于HD组（P<0.05）,HP+HD组治疗后FGF-23水平明显低于HD组（P<0.01）,HP+HD组治疗后FGF-23水平低于HDF组（P<0.05）。结论 尿毒症患者血清中IL-37、IL-6、FGF-23明显高于健康人群,提示尿毒症患者普遍存微炎症状态和钙磷调节异常。血液灌流联合血液透析可清除IL-37、IL-6因子,提示血液灌流联合血液透析可明显改善患者的微炎症状态,同时降低磷、β2微球蛋白、i PTH、FGF-23水平,调节患者的

关键词： 虫草素   帕金森病   线粒体动力学   NLRP3炎症小体   Drp1  

摘要： 目的:本课题通过单侧脑立体定位注射鱼藤酮(Rotenone,Rot)构建帕金森病(Parkinson's disease,PD)大鼠体内模型,并建立鱼藤酮诱导的PD细胞模型,探讨虫草素(Cordycepin,Cor)对PD模型多巴胺(Dopamine,DA)能神经元损伤的保护作用,及其调控线粒体动力学和NLRP3炎症小体的作用机制。并深入探索Cor调控线粒体分裂对NLRP3炎症小体激活的作用,为Cor的神经保护作用提供新颖的机制,从而支持PD治疗的潜在临床应用。方法:1.体内实验:SD大鼠随机分为假手术组、模型组(30 μg/kg Rot)、虫草素组(2.5、5.0、10.0 mg/kg Cor)和阳性药物组(1 mg/kg司来吉兰)。通过旷场实验、转棒实验和转圈实验评价PD大鼠运动功能。免疫组织化学染色法检测PD大鼠损毁侧及对侧黑质纹状体酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫阳性细胞数。透射电镜观察DA能神经元线粒体结构及形态。Western blotting法检测黑质及纹状体TH表达水平,黑质区线粒体分裂蛋白(Drp1(细胞质及线粒体)和Fis1)和融合蛋白(Mfn1,Mfn2和OPA1)的变化及NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。使用Mito-SOX荧光探针检测线粒体ROS含量;同时使用JC-1染料及ATP检测试剂盒分别检测黑质线粒体膜电位(MMP)及ATP水平的变化。2.体外实验:PC12细胞分为对照组、模型组(1μMRot)和虫草素组(0.5×10-6、2.0×10-6、8.0×10-6 μM Cor)。采用MTT法评价鱼藤酮对PC12细胞的毒性作用及Cor对PC12细胞存活率的影响。应用线粒体红色荧光探针(Mitotracker-Red)标记细胞线粒体,在激光共聚焦下观察线粒体片段化程度并分析线粒体质量。透射电镜观察细胞线粒体超微结构及形态。Western blotting 法测定细胞内 Drp1(细胞质及线粒体)、Fis 1、Mfn1,Mfn2、OPA1、NLRP3、ASC、caspase-1(P20)、caspase-1、IL-1β 及 IL-18 蛋白的表达。免疫荧光实验检测Drp1蛋白线粒体转移情况。Mito-SOX荧光探针检测细胞内mtROS。使用JC-1染料及ATP检测试剂盒分别检测细胞线粒体MMP及ATP水平的变化。此外,采用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1进一步研究虫草素是否通过抑制线粒体异常分裂诱导的NLRP3炎症小体激活而发挥保护作用。结果:***维持Rot-PD大鼠黑质神经元线粒体动力学稳态,减轻DA能神经元损伤。(1)Cor改善PD大鼠运动功能:Cor能显著提高大鼠运动能力,主要表现在自主活动能力,肌张力及运动平衡能力的提高。(2)Cor抑制PD大鼠黑质-纹状体DA能神经元损伤:Cor给药减少大鼠黑质损毁侧TH免疫阳性神经元丢失,并且能维持其在纹状体的正常投射,显著上调黑质及纹状体区TH蛋白表达。(3)Cor调控PD大鼠黑质神经元线粒体动力学平衡并维持线粒体正常功能:Cor能够维持大鼠黑质神经元线粒体正常超微结构,下调线粒体分裂蛋白Drpl及Fis1的表达,并显著提高多种融合相关蛋白(Mfn1,Mfn2,OPA1)水平。同时上调线粒体ATP及MMP水平,并减少mtROS含量。(4)Cor抑制黑质NLRP3炎症小体激活:Cor能够显著下调黑质区NLRP3,ASC蛋白表达,并抑制caspase-1活性,同时减少细胞内促炎因子IL-18及IL-1β产生及分泌,减轻炎症反应。***抑制Rot诱导的PC12细胞线粒体异常分裂,减轻细胞炎症损伤。(1)Cor提高PC12细胞存活率并维持线粒体正常功能:Cor能显著抑制鱼藤酮对PC12细胞的毒性损伤作用,提高PC12细胞存活率,增加线粒体MMP和ATP水平,减少ROS的产生。(2)Cor抑制PC12细胞线粒体异常分裂:Cor能减少PC 12细胞线粒体空泡及肿胀化,减少鱼藤酮诱导的线粒体碎片化,维持线粒体正常形态和网络结构。Cor能抑制Drp1向线粒体募集及共定位,同时提高融合蛋白Mfn1,Mfn2和OPA1表达水平,以保持线粒体动力学稳态,抑制其异常分裂。(3)Cor抑制PC12细胞NLRP3炎症小体激活:Cor能够显著下调NLRP3,ASC,caspase-1(P20),IL-18及IL-1β蛋白表达,提示Cor能够抑制鱼藤酮诱导的NLRP3炎症小体激活,减轻细胞炎症反应。(4)Cor抑制NLRP3炎症小体激活依赖于抑制线粒体异常分裂:加入线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)后,线粒体片段化程度显著降低,并且Mdivi-1可显著抑制NLRP3炎症小体激活,且IL-18及IL-1β蛋白表达显著降低。虫草素表现出与Mdivi-1

关键词： 猫疱疹病毒1型   炎症   炎症小体   IFI16   IL-1β   立即早期蛋白  

摘要： 猫传染性鼻气管炎（Feline viral rhinotracheitis,FVR）是由猫疱疹病毒1型（Feline herpesvirus-1,FHV-1）引起的一种常见的猫科动物上呼吸道传染病,也是宠物临床中重点关注的猫病毒性传染病之一。目前,FHV-1已在全球范围内流行,对宠物猫以及老虎、猎豹、狮子等圈养或野生猫科动物的健康造成了严重的威胁。FHV-1急性感染期主要引起上呼吸道与眼部炎症,表现为鼻眼有浆液性或脓性分泌物、间质性肺炎、结膜炎、角膜炎、眼周及鼻周皮肤溃疡等临床症状,提示机体的炎症应答与FHV-1致病过程密切相关。炎症小体是近年来新发现的一种胞浆内多聚蛋白复合物,被激活后活化Caspase-1,诱导IL-1β、IL-18的成熟与分泌,进而诱导炎症反应发生。大量研究表明,炎症小体参与了多种病毒调控机体炎症应答的过程,并在机体抵抗病毒入侵的过程中发挥着重要作用。那么,FHV-1感染是否可以通过活化炎症小体调控机体的炎症反应?具体调控机制如何?目前尚无详尽报道。本研究以“FHV-1—炎症小体—炎症反应”为主线,通过在感染动物与体外巨噬细胞模型上明确FHV-1激活的炎症小体种类,深入探讨FHV-1调控炎症小体的分子机制,明确炎症小体激活在FHV-1感染中的作用,为FHV-1致病机制及宿主免疫应答机制的研究提供新思路,也可为FHV-1的防治与新型药物的研发提供理论指导。首先,从疑似FVR患病猫眼分泌物中成功分离到1株FHV-1,命名为CH-B株。通过人工感染与同居感染实验证明FHV-1 CH-B株感染猫引起以眼鼻出现粘液性或脓性分泌物、咳嗽、眼周皮肤溃疡、扁桃体与肺脏炎性细胞浸润为主要特征的上呼吸道与眼部疾病,病程约10 d。病毒组织嗜性以及炎症指标检测结果显示,急性感染期,FHV-1对鼻甲骨、气管、结膜、角膜以及神经节具有偏嗜性,可以诱导组织及外周血IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的表达与分泌,上调急性反应蛋白A。上述结果表明,FHV-1急性感染期可以诱导机体强烈的炎症反应。其次,为明确FHV-1感染激活的炎症小体种类,在猫外周血单核巨噬细胞上成功建立了FHV-1感染细胞模型。通过检测FHV-1感染动物不同组织以及FHV-1感染猫外周血单核巨噬细胞模型中不同种类炎症小体相关蛋白mRNA表达情况,发现FHV-1感染可以诱导IFI16、NLRP3、ASC与Caspase-1基因表达显著上调,其中IFI16基因变化最为显著。此外,通过原核表达成功获得了猫源IFI16、ASC与Caspase-1蛋白,制备了多克隆抗体,建立了可用于鉴定猫源IFI16炎症小体的研究体系。研究结果为进一步探索FHV-1调控IFI16炎症小体分子机制奠定了基础。再次,利用FHV-1感染猫外周血单核巨噬细胞模型,通过检测FHV-1感染或炎症小体抑制剂处理后细胞IL-1β、Caspase-1、IFI16蛋白的表达,探讨了FHV-1感染与IFI16炎症小体的关联及调控机制。FHV-1感染猫外周血单核巨噬细胞后,可以诱导IL-1β分泌与Caspase-1活化,分泌量及酶活性呈现先升高后下降的趋势;通过Caspase-1、Caspase-3以及泛Caspase酶抑制试验发现,FHV-1诱导IL-1β成熟与分泌依赖Caspase-1酶活性。然后,我们分析了FHV-1感染对IFI16炎症小体的影响。FHV-1感染早期（hpi<8h）可以诱导细胞内IFI16蛋白的表达,并诱导IFI16蛋白由胞核转运到胞浆内,但感染后期（hpi>12 h）抑制了细胞内IFI16蛋白表达。免疫共沉淀试验表明FHV-1感染诱导了“IFI16-ASC-prop-Caspase-1”炎症小体的组装。通过IFI16抑制剂试验,进一步证明FHV-1诱导Caspase-1活化与IL-1β分泌依赖IFI16蛋白的表达及IFI16炎症小体的组装。接下来,进一步分析了FHV-1活化IFI16炎症小体的机制。通过KCl、ROS抑制剂、溶酶体酸化抑制剂试验发现,FHV-1活化IFI16炎症小体诱导IL-1β分泌依赖细胞K+外流及ROS产生,与溶酶体酸化无关。此外,我们还探讨了炎症小体活化与IL-1β分泌在FHV-1感染过程中的作用。通过炎症小体抑制剂或IL-1β抗体处理细胞后感染FHV-1,检测病毒基因组拷贝数与IL-6、TNF-α分泌量。结果发现,抑制炎症小体活化或中和IL-1β对不同感染时间FHV-1的病毒拷贝数无显著影响,但显著降低了上清中IL-6与TNF-α分泌量,提示炎症小体活化与IL-1β分泌参与了机体的炎症应答。最后,通过在293T与F81细胞上重建IFI16炎症小体,探讨了FHV-1立即早期蛋白对炎症小体活化的影响。将表达FHV-1立即早期蛋白的质粒转染到重建IFI16炎症小体

关键词： 消瘿导痰汤   桥本甲状腺炎   Notch蛋白通路   Treg/Th17细胞因子   免疫炎症反应  

摘要： 目的:桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis,HT)是自身免疫性甲状腺炎的经典代表,发病率逐年上升,研究证实Notch信号通路可通过调控Treg/Th17细胞因子水平参与到多种自身免疫性疾病发生发展过程中,Notch蛋白同样可能通过影响Treg/Th17细胞因子水平促进桥本甲状腺炎的发生发展。因此,笔者开展临床试验观察消瘿导痰汤的临床疗效,制造桥本甲状腺炎小鼠模型、诱导甲状腺炎性细胞株,通过对Notch蛋白表达、Treg/Th17细胞因子的检测,探索中药消瘿导痰汤对本病的作用机制,为其临床运用提供科学依据。方法:收集符合纳入条件的桥本甲状腺炎气滞痰凝证患者共66例,观察中药消瘿导痰汤的临床疗效,分别于治疗前、中、后对患者进行中医症状评分,于治疗前后用ELISA法检测各组患者血清甲状腺功能、Notch蛋白表达情况、Treg/Th17细胞因子水平,于治疗前后分别行一次甲状腺超声检查。制造桥本甲状腺炎小鼠模型,于治疗结束后用ELISA法检测小鼠血清甲状腺功能、Notch蛋白表达及Treg/Th17细胞因子水平。诱导甲状腺炎性细胞株,采用中药消瘿导痰汤含药血清作用于细胞,培养结束后用Real-time qPCR以及Western blot法检测各组细胞基因中Notch蛋白表达情况,用ELISA法检测各组Treg/Th17细胞因子及炎症因子水平。结果:1、临床试验结果:从中医证候疗效及疾病疗效来看,治疗组优于对照组,统计学差异显著(P<0.001);HT患者血清Notch蛋白表达水平较健康人群明显升高,差异具有显著统计学意义(P<0.001);治疗组患者治疗后血清Notch蛋白表达水平较对照组明显下降,差异具有显著统计学意义(P<0.001);治疗组患者治疗后血清Treg细胞关键活化蛋白水平均较治疗前上调,差异具有统计学意义(P<0.05),组间比较,治疗组治疗后血清FOX-P3水平较对照组明显上升(P<0.05),但两组TGF-β、IL-10水平无统计学差异(P＞0.05);治疗组患者治疗后血清Th17细胞关键活化蛋白STAT3、IL-17、IL-22水平均较治疗前下调,差异具有统计学意义(P<0.05),组间比较,治疗组STAT3、IL-17水平较对照组明显下调(P<0.05),但两组RORγt、IL-22水平无统计学差异(P>0.05);在治疗中期,治疗组较对照组TSH下降幅度更显著,具有统计学差异(P<0.05),但治疗后两组TSH水平无统计学差异(P＞0.05);治疗组患者治疗后血清TPOAb水平下降幅度较对照组明显(P<0.05),但是两组患者FT3、FT4、TGAb水平比较,无统计学差异(P＞0.05)。2、动物实验结果:与模型组比较,西药对照组、中药低剂量组、中药高剂量组及Notch蛋白抑制剂组小鼠血清TSH均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);其余各组小鼠与模型组比较,血清FT3、FT4无明显变化,TGAb、TPOAb无明显下降,差异无统计学意义(P>0.05);模型组小鼠血清Notch蛋白表达情况较其余各组均明显升高,差异具有显著统计学意义(P<0.001);中药高剂量组与西药对照组、中药低剂量组、模型组比较,小鼠血清Treg细胞关键活化蛋白FOX-P3水平明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05);中药3组与Notch蛋白抑制组较模型组及西药组小鼠血清TGF-β水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);各组小鼠血清IL-10水平比较,无统计学差异(P>0.05);各组小鼠血清Th17细胞关键活化蛋白水平与模型组比较,其余各组小鼠血清STAT3、RORyt、IL-22 水平均明显下降,具有统计学差异(P<0.05);小鼠血清IL-17水平组间比较,无统计学差异(p>0.05)。3、细胞实验结果:5组甲状腺炎性细胞基因中Notch蛋白表达水平比较,iNotch+DS组、DS组与其余三组比较,甲状腺炎性细胞基因中Notch蛋白的β-actin值均明显下调,具有统计学差异(P<0.05);细胞上清液中Treg细胞关键活化蛋白FOX-P3、TGF-β、IL-10水平两两比较,iNotch+DS组、DS组与其余三组比较,Treg细胞关键活化蛋白明显上调,具有显著统计学差异(P<0.001);细胞上清液中Th17细胞关键活化蛋白STAT3、IL-17、IL-22水平两两比较,iNotch组、iNotch+DS组、DS组较Blank组、NC组明显下调,统计学差异显著(P<0.001),但RORyt水平组间比较,无统计学差异(P>0.05);细胞上清液中炎症因子水平两两比较,iNotch组、iNotch+DS组、DS组细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6较Blank组、NC组

关键词： 壳寡糖   糖尿病   免疫功能   炎症因子   糖代谢   脂代谢  

摘要： 目的分析壳寡糖(COS)抗2型糖尿病的作用机制及其对小鼠免疫功能和炎症因子释放产生的调节作用,以期为2型糖尿病的临床治疗提供参考。方法1、选取64只SPF级昆明小鼠,随机取12只作为对照组,剩余小鼠用高脂饮食结合小剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病小鼠模型,48只小鼠造模成功,随机分为模型组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组,每组12只。对照组、模型组、低、中、高剂量COS组分别用0.9%生理盐水、100mg·kg、200 mg·kg、400 mg·kgCOS灌胃给药,连续30d,最后一次给药2h后处死小鼠。2、通过尾静脉采血的方式检测小鼠的空腹血糖水平,并进行OGTT试验,采用全自动化学免疫发光分析仪检测小鼠的FINS,并计算HOMA-IR。3、使用全自动生化分析仪检测小鼠血清中的TC和TG,采用选择性沉淀法检测HDL-C和LDL-C。4、采用流式细胞仪检测小鼠的CD4、CD8表达水平,并计算CD4/CD8比值。5、采用酶联免疫吸附法检测小鼠的TNF-α、CRP、IL-6、IL-1β、MCP-1表达水平。结果1、糖代谢指标:模型组和低、中、高剂量COS组小鼠的FBG水平相较于对照组显著上升(P<0.05);且随着治疗剂量的升高FBG水平越低(P<0.05);模型组和低、中、高剂量组不同观察时间的OGTT结果均明显高于对照组(P<0.05),且随着治疗剂量的升高OGTT水平越低(P<0.05);模型组和低、中、高剂量组的Hb A1c、FINS及HOMA-IR指标均相较于对照组均明显升高(P<0.05),低、中、高剂量组小鼠低于模型组(P<0.05),随着治疗剂量的升高Hb A1c、FINS及HOMA-IR表达逐渐降低(P<0.05)。2、脂代谢指标:模型组和低、中、高剂量COS组脂代谢指标均与对照组有显著差异(P<0.05);低、中、高剂量组小鼠TC、TG和LDL-C指标均明显低于模型组(P<0.05),HDL-C高于模型组(P<0.05)。3、免疫功能指标:模型组和低、中剂量COS组的胸腺和脾脏指数、CD4均明显低于对照组(P<0.05),低、中、高剂量组高于模型组(P<0.05),五组小鼠CD8组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。4、炎症因子指标:模型组TNF-α、CRP、IL-6、IL-1β以及MCP-1均高于对照组(P<0.05);不同剂量组小鼠炎症因子较模型组明显降低(P<0.05)。结论COS对2型糖尿病小鼠的糖脂代谢发挥出较好的调控作用,改善胰岛素抵抗,且有利于改善小鼠的免疫功能,抑制炎症因子的释放,有较好的应用价值。

关键词： β-淀粉样蛋白   炎症因子   有氧糖酵解   小胶质细胞   己糖激酶Ⅱ  

摘要： 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种进展缓慢的神经退行性疾病,以轻度记忆丧失开始,以认知功能和执行功能的严重受损告终。AD的主要病理表现是β-淀粉样蛋白斑块、神经原纤维缠结、血管淀粉样变和神经元及突触的丢失。在近些年的研究中发现,神经炎症在AD的发生发展中起到了重要的作用。其中小胶质细胞的激活及其炎症的产生是AD神经炎症的主要表现。小胶质细胞是大脑中的免疫细胞,在受到外界刺激时产生炎症并进一步激活。当小胶质细胞进入过度激活期则产生神经毒性物质,加剧中枢神经系统疾病的进程。本研究将以小鼠小胶质细胞系BV2细胞及C57BL/6N小鼠作为研究对象,研究AD疾病发展过程中Aβ对小胶质细胞炎症因子的影响。观察有氧糖酵解在β-淀粉样蛋白诱导的免疫炎症中的作用,阐明有氧糖酵解在Aβ诱导神经炎症中的调控作用。目的:以小鼠小胶质细胞系BV2细胞及C57BL/6N小鼠作为研究对象,研究AD疾病发展过程中Aβ对小胶质细胞激活状态的影响,观察小胶质细胞中有氧糖酵解在Aβ刺激的细胞免疫炎症反应过程中的时间相关性调控,并在急性AD模型小鼠中验证有氧糖酵解对海马内炎症因子表达的影响,阐明有氧糖酵解在Aβ诱导的神经炎症中的调控作用。方法:1.通过MTS检测不同时间和剂量Aβ1-42刺激BV2细胞增殖的变化。2.通过RT-qPCR实验检测不同时间和剂量Aβ1-42刺激后,BV2细胞炎症因子IL-1βmRNA表达的变化。3.使用2DG抑制BV2细胞有氧糖酵解,RT-qPCR实验检测Aβ1-42刺激BV2细胞后,炎症因子IL-1βmRNA及i NOS mRNA表达的变化。Western blot实验检测BV2细胞炎症因子pro-IL-1β蛋白表达的变化。Griess实验检测炎症因子NO分泌的变化。4.通过sh RNA敲低BV2细胞中HK2基因抑制有氧糖酵解。RT-qPCR实验检测Aβ1-42刺激BV2细胞后,炎症因子IL-1βmRNA及i NOS mRNA表达的变化。Western blot方法来检测BV2细胞中炎症因子pro-IL-1β蛋白的变化。Griess实验检测炎症因子NO分泌的变化。5.7.5月龄野生型C57BL/6N小鼠腹腔注射2DG 3天后,进行双侧海马脑立体定位注射Aβ1-42构建AD急性模型小鼠。RT-qPCR实验检测给予2DG后,AD急性模型小鼠海马内炎症因子IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达的影响。结果:***结果显示2.5μM和5μM的Aβ1-42处理BV2细胞6 h开始有增殖效果,12 h时细胞增殖效果最明显。24 h时Aβ1-42对BV2细胞的增殖作用消失。***-qPCR结果显示,各浓度剂量Aβ1-42刺激BV2细胞,炎症因子IL-1βmRNA表达明显上升,同时表现出随时间上升而下降的趋势。其中5μM的致炎效果最明显,后续实验选用5μM的Aβ1-42浓度。***-qPCR结果显示,2DG在3 h对Aβ1-42诱导的BV2细胞炎症因子IL-1βmRNA表达无影响;6 h、12 h和24 h时2DG可抑制Aβ1-42诱导的BV2细胞炎症因子IL-1βmRNA的表达且抑制作用随时间发展而加强。Western blot实验结果与上述结果一致。Griess实验结果显示,Aβ1-42刺激BV2细胞24 h时炎症因子NO分泌增高,2DG可抑制Aβ1-42诱导的BV2细胞NO的分泌。***-qPCR结果显示,敲低HK2在12 h和24 h有效抑制Aβ1-42诱导的BV2细胞炎症因子IL-1βmRNA的表达。Western blot实验结果与上述结果一致。Griess实验结果显示,Aβ1-42刺激细胞12 h和24 h炎症因子NO分泌增高,敲低HK2在12 h和24 h时可抑制Aβ1-42诱导的细胞炎症因子NO的分泌。***-qPCR结果显示,7.5月AD急性模型小鼠造模后1 d,炎症因子IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达明显上升。腹腔注射2DG预处理后,Aβ1-42刺激的海马内炎症因子mRNA表达下降。结论:1.Aβ1-42诱导BV2细胞引起细胞增殖和炎症因子表达的动态变化。2.有氧糖酵解可调控由Aβ1-42诱导的BV2细胞炎症因子的表达,且抑制效果在过度激活期更明显。3.有氧糖酵解可调控急性AD模型小鼠海马内炎症因子mRNA的表达。