关键词： 动脉粥样硬化   辛伐他汀   依折麦布   肝肾功能   免疫炎症反应   IFN-r   IL-4  

摘要： 目的： 本研究旨在探讨分别应用辛伐他汀与联合依折麦布等不同调脂方案在治疗高脂血症致动脉粥样硬化模型大鼠过程中，观察对模型大鼠肝肾功能影响，以及对血清免疫反应相关因子浓度变化的影响。 方法： 选取42只6周龄健康Wistar（210±10g）雄性大鼠，随机分组：正常对照组（N组）、高脂模型组（C组）、低剂量辛伐他汀(10mg/kg·d)组（S组）、较高剂量辛伐他汀(20mg/kg·d)组（SH组）和低剂量辛伐他汀（10mg/kg·d）联合依折麦布（5mg/kg·d）组（SE组），共5组。于实验开始，除正常对照组外，其他各组给予连续腹腔注射3天维生素D3，同时连续8周给予特殊调制高脂饮食，用以建立大鼠动脉粥样硬化模型，模型建立成功后分别给予对应剂量的辛伐他汀及依折麦布灌胃，给药周期为4周。于给药前后分别测定血清TC、LDL-C、HDL-C、TG、ALT、AST、Scr、BUN、UA、CCr、IFN-r、IL-4以及尿U-pro、Ucr水平。实验结束时分离出大鼠主动脉及肾脏组织,行HE染色后光镜下观察大致组织结构变化。 结果： 1、高脂模型组（C组）大鼠较正常对照组（N组）相比血清TG、TC、LDL-C水平明显升高，HDL-C水平减低，具有统计学差异；各药物处理组较C组血清TG、TC、LDL-C水平明显降低，其中以小剂量辛伐他汀联合依折麦布处理组（SE组）减低最为明显。 2、C组大鼠较N组相比血清ALT、AST水平明显升高，具有统计学差异；各药物处理组较C组ALT、AST水平明显降低，其中以SE组最为明显。 3、C组大鼠较N组相比BUN、UA、U-pro水平明显升高，Ccr水平减低，差异具有统计学意义；各药物处理组较C组BUN、UA、U-pro水平明显降低，Ccr水平升高，其中以较高剂量辛伐他汀组（SH组）最显著。且病理切片通过光镜下所见，与N组相比，C组肾小球体积略增大,病变较为显著者可见肾小球系膜细胞有明显增生；S组、SH组及SE组较C组相比较肾小球体积略偏小，系膜细胞增生减轻，其中SH组病变最轻。 4、C组大鼠较N组血清IFN-r水平明显升高，SH组较S组及SE组更有效减低IFN-r水平，且IFN-r水平同血脂水平具有明确相关性，其中随TG、TC、LDL-C水平的升高IFN-r水平呈相应的升高，即与TG、TC、LDL-C呈正相关，而与HDL-C水平呈负相关；C组与N组相比IL-4水平无明显差异，各给药处理组与C组相比IL-4水平亦无统计学差异。 结论： 1、小剂量辛伐他汀联合依折麦布治疗与单用较大剂量辛伐他汀治疗相比，在降低血脂作用方面更加显著，并也因此能有效的改善高脂血症所诱发的肝功能异常。 2、单用较大剂量辛伐他汀治疗过程中显现其肾脏保护作用更显著，并体现在组织形态学上能有效改善肾小球功能结构。 3、免疫反应相关因子IFN-r水平同血脂水平有明确相关性，高剂量辛伐他汀治疗过程中较低剂量辛伐他汀联合依折麦布组大鼠血清IFN-r水平减低明显，并推断通过药物降脂治疗能够减轻或抑制动脉粥样硬化发生发展过程中的免疫炎症反应。动脉粥样硬化发生发展过程中对血清IL-4水平的影响可能不大。

关键词： 血红素加氧酶   肥胖幼鼠   脂肪组织   炎症状态   巨噬细胞浸润   巨噬细胞极化  

摘要： 目的探讨肥胖SD幼鼠内脏脂肪组织中血红素加氧酶-1表达的变化及与脂肪组织巨噬细胞浸润/极化间的关系。并探讨肥胖儿童血清血红素加氧酶-1与体内炎症因子、抗炎症因子的相互联系,及其与体格指标、颈动脉内膜情况、血生化代谢改变的关系。方法在动物实验中,取3周龄雄性SD大鼠24只,采用数字表法随机分为正常组和肥胖组,分别给予标准饮食和高脂饮食,喂养至7w龄,取血检测甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)及胰岛素水平(FINS),定量PCR检测幼鼠肾周脂肪组织中血红素加氧酶-1(HO-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)基因表达变化,F4/80、CD206免疫组化法观察脂肪组织中巨噬细胞浸润和极化情况。在临床研究中,以2014年2月-2015年2月到天津医科大学总医院儿科内分泌门诊就诊的肥胖儿童为研究对象,按照单纯性肥胖及代谢综合征的诊断标准将其分为单纯性肥胖组及代谢综合征组,每组各60例;体质量正常的健康儿童60例为对照组。分别测量三组儿童身高(H)、体重(W)、腰围(WC)、血常规、空腹血糖(FPG)和空腹胰岛素(FINS);单纯性肥胖组及代谢综合征组增加检测血清甘油三酯(TG),胆固醇(TC),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),并进行超声心动检查,测量左右颈动脉内径、颈动脉内膜中层厚度。用ELASA酶联法测定三组儿童血清HO-1、MCP-1、IL-6和IL-10浓度。并对上述结果进行统计学分析。结果动物研究发现,肥胖组幼鼠已经存在空腹血糖和胰岛素升高,胰岛素抵抗情况明显,HO-1表达明显高于正常组,炎症因子IL-6、MCP-1基因表达明显高于正常组,抗炎症因子IL-10低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化以及平均光密度值(MOD)结果显示,肥胖组巨噬细胞浸润明显多于正常组(P<0.05),肥胖组F4/80免疫组化平均光密度值(MOD)值与CD206免疫组化MOD值差异无统计学意义(P>0.05)。临床研究发现,肥胖两组的BMI、血压及腰围明显高于对照组,代谢综合征组的血压明显高于单纯性肥胖组,差别均有统计学意义(均P<0.05)。代谢综合征组的IR、FINS、TG、non HDL-C明显高于单纯性肥胖组,HDL-C明显低于单纯性肥胖组,差别具有统计学意义(P<0.05)。代谢综合征组的左颈动脉内径、左颈动脉内膜中层厚度明显高于对照组(P<0.05)。单纯性肥胖组HO-1水平高于代谢综合征组及对照组,差别具有统计学意义(P<0.05)。肥胖两组的WBC、hs CRP升高,炎症因子MCP-1升高,抗炎症因子IL-10降低的炎症状态。肥胖儿童的HO-1与SBP、DBP、IL-10呈正相关(P<0.05);与MCP、hs CRP呈负相关。多元逐步回归分析显示SBP和TG是影响肥胖儿童HO-1浓度的独立危险因子。颈动脉内膜中层厚度是影响MCP-1的独立危险因子。结论1.肥胖幼年SD大鼠的内脏脂肪组织中巨噬细胞浸润明显增多,炎症因子IL-6、MCP-1升高,说明幼年肥胖个体已经存在低度炎症反应,抗炎症因子IL-10降低,考虑是中和炎症因子的反应性降低。2.幼年SD大鼠的肥胖早期,HO-1的反应性增加,并可能通过促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的极化发挥炎症作用,可能是肥胖早期机体对抗炎症反应的一个保护机制。3.肥胖儿童已出现低度炎症状态,表现为WBC、hs CRP、MCP-1的增加及抗炎因子IL-10的降低。在肥胖早期,HO-1出现反应性的增高,降低促炎症因子水平,升高抗炎症因子水平,改善炎症情况,这可能是HO-1对抗炎症的重要机制之一。随着肥胖所致的代谢紊乱加重,HO-1出现降低,体内炎症进一步加重。4.肥胖儿童的HO-1可能通过降低炎症因子,增加抗炎症因子水平,改善机体的炎症反应,早期合理应用诱导剂增加HO-1的表达,可能对改善肥胖所致的炎症状态及其并发症有重要意义。

关键词： 脓毒症   抑炎因子   促炎因子   炎性反应   免疫功能  

摘要： 目的：通过腹腔注射LPS建立脓毒症大鼠动物模型,分别予四逆汤及其组方中各味药灌胃,观察并比较其对大鼠模型炎性反应和免疫功能的影响,探索四逆汤中起主要作用的药材,以及证实中药配伍后的药效相对于各自单味药药效的提升作用,探讨其可能机制。方法：选36只雄性SD大鼠,按随机数字表法分为正常对照组(n=6)、模型组(n=6)、附子组(n=6)、干姜组(n=6)、炙甘草组(n=6)及四逆汤组(n=6)。腹腔注射LPS (5mg/kg)制备脓毒症大鼠模型。药物按照《伤寒论》中四逆汤原方比例选取中药颗粒剂,即附子、干姜、甘草按照5：3：2比例配置。除正常对照组及模型组外,其余各组均于制模后立刻予药物汤剂灌胃(10ml/kg),每12小时给药一次。模型组给予等量生理盐水。正常对照组不予任何处理。分别于制模后2、24、48小时经眼眶采血,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定脓毒症大鼠血清HLA-DR、白细胞介素(IL-1、IL-10)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的表达水平,并于造模后48小时,处死大鼠取其肺组织标本,染色后观察其病理改变情况。结果：在腹腔注射LPS后,各组大鼠IL-1和TNF-a水平均较正常对照组升高(P<0.01),而各组大鼠IL-10水平较正常组出现明显下降(P<0.01)。造模2h后,各组大鼠IL-1、IL-10和TNF-a水平无明显差异(P>0.05)。在24h和48h两个节点,附子组(FZ组)和四逆汤组(SNT组)IL-1和TNF-a水平均较除正常对照组外的其余组下降,且存在统计学意义(P<0.01),其中SNT组下降幅度明显优于FZ组(P<0.01)。模型组(NS组)、干姜组(GJ组)和甘草组(GC组)IL-1和TNF-a水平在这两个时间节点均无明显差异(P>0.05)。在24h、48h两个节点,GC组和SNT组IL-10水平均较其余造模的大鼠组升高(P<0.01),其中SNT组上升幅度高于GC组(P<0.05),NS组、FZ组和GJ组IL-10水平在24h、48h无明显差异(P>0.05)。在2h和24h,造模后的各组大鼠HLA-DR水平均较正常组升高,且无差异(P>0.05),但到48h,较除正常对照组外的其它组,SNT组HLA-DR水平下降幅度明显较小,存在明显统计学差异(P<0.01),而NS组、FZ组、GJ组、GC组在三个时间节点的HLA-DR水平均无明显差异(P>0.05)。肺组织病理结果示：在造模后48h, SNT组部分肺泡扩张融合,而NS组、FZ组、GJ组和GC组肺泡扩张融合明显,并有肺泡隔的增厚和大量炎症细胞的浸润。结论：口逆汤能够调节机体全身炎症反应的平衡,具有促进血浆中抑炎因子IL-10表达以及抑制促炎因子IL-1、TNF-α表达的双向调节作用,可以延缓HLA-DR的下降趋势,并可以减轻肺组织的炎症细胞浸润,保护肺泡完整性；附子对血浆中促炎因子IL-1、TNF-α表达有一定的抑制作用,但对抑炎因子IL-10表达和肺组织的保护无明显作用；甘草对抑炎因子IL-10表达有一定的上调作用,但对促炎因子IL-1、TNF-α以及HLA-DR表达无明显影响,对肺组织亦无保护作用；干姜无论是对促炎因子IL-1、TNF-α,抑炎因子IL-10及HLA-DR表达均无影响,对肺组织亦无保护作用。但四逆汤中各单味药对机体炎症反应的影响均远不如四逆汤成方的作用,并且均无四逆汤对肺组织结构的保护作用。

关键词： NLRP3炎症小体   芳香烃受体   转录调控   caspase-1   IL-1β  

摘要： 研究目的NLRP3 (nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor prtein3)炎症小体是目前研究最深入的炎症小体,其活化强度被证实与多种疾病的发生发展密切相关,例如痛风、感染性疾病、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、急性移植物抗宿主疾病及癌症等。因此,针对NLRP3炎症小体活化调控及其分子机制的研究对于阐明这类疾病的发生发展的机理,以及寻找免疫调节治疗的新途径具有重要的意义。目前,环境污染越来越受到大家的重视,二恶英类污染物是环境污染中的主要成分,而二恶英类污染物中毒性最强的是2,3,7,8-四氯-二苯并-对-二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD),其主要通过芳香烃受体(Arylhydrocarbon receptor, AhR)对人体产生影响。近年来,AhR在毒理及癌症方面已得到深入研究,但对于AhR对免疫系统的调控效应与分子机制尚未完全明了。本课题深入研究了AhR对NLRP3炎症小体的调控效应和分子机制,旨在通过阐明NLRP3分子在转录水平的分子调控机制,为寻找防治环境污染因素造成的炎症性疾病的免疫调节疗法提供新途径。材料和方法***对NLRP3表达的影响1.1分别用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞40min,再用LPS刺激不同的时间(0,4h,8h), Western blot检测NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1p在蛋白水平的表达变化。1.2分别用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞40min,再用LPS刺激不同的时间(0,2h,4h),RT-PCR检测NLRP3、AS、caspase-1和IL-1β在mRNA水平的表达变化。1.3用不同剂量的AhR活化剂TCDD (2nM,10nM,20nM,50nM)和FICZ(20nM,100nM,200nM,500nM)分别刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞40min,再用LPS刺激8h,Western blot检测NLRP3在蛋白水平的表达变化。1.4设计合成AhR特异性小干扰RNA,用转染试剂将靶向AhR的SiRNA AhR-siRNA以及相应的对照CTRL-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h。收集细胞沉淀,Western blot检测AhR的蛋白表达情况,明确AhR-siRNA的干扰效率,筛选出抑制效率最佳的干扰片段进行后续实验。1.5用转染试剂将筛选出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h,用LPS对转染的细胞进行刺激,并于不同的时间点(0,4h,8h)收集细胞,通过Western blot检测NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在蛋白水平的表达情况。1.6用转染试剂将筛选出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h,用LPS对转染的细胞进行刺激,并于不同的时间点(0,4h,8h)收集细胞,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR检测NLRP3、 AS、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在mRNA水平的表达情况。***对NLRP3启动子区报告基因活性的影响2.1使用脂质体分别将PGL3质粒和NLRP3启动子区报告基因质粒(nt-2032 tont+166)转染入小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,24h后分别用DMSO和TCDD刺激40min,再用LPS刺激6h。应用报告基因系统检测分析NLRP3启动子区报告基因的活性。2.2使用脂质体将NLRP3启动子区报告基因质粒(nt-2032 to nt+166)转染入RAW264.7细胞,24h后分别用DMSO、TCDD、FICZ和L-kynurenine (L-kyn)刺激细胞40min,再用LPS刺激6h。应用报告基因系统检测分析NLRP3启动子区报告基因的活性。2.3分别将AhR的真核表达载体pCMV-Myc-AhR和空载体pCMV-Myc转染入RAW264.7细胞株,并筛选鉴定出稳定高表达AhR的细胞株以及表达相应空载体的细胞株。向两种细胞中分别转染入PGL3质粒和NLRP3启动子区报告基因质粒(nt-2032 to nt+166),24h后用LPS刺激细胞6h。应用报告基因系统检测分析NLRP3启动子区报告基因的活性。***调控NLRP3表达的分子机制3.1测序分析NLRP3启动子区的碱基序列,发现NLRP3启动子区存在3个潜在的AhR结合序列,分别为XRE1 (nt-1512 to-1504)、XRE2(nt-911 to -904)和XRE3(nt+61 to +67)。构建一系列含NLRP3启动子区的

关键词： 牙髓干细胞   侵袭性牙周炎   牙周炎   干细胞治疗   炎性牙髓   组织工程  

摘要： 研究背景牙组织工程,特别是牙髓再生研究是口腔再生医学的重要分支,牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)作为牙组织工程的种子细胞之一,也是迄今为止在牙髓再生研究中得到最多应用的种子细胞。DPSCs存在于乳牙及恒牙牙髓组织中,以往研究表明,DPSCs可以简单高效的由医疗废弃物(如正畸需要拔除的牙齿、阻生智齿等)中获得,具有良好的增殖和多向分化能力,可诱导形成骨、软骨、肌肉、神经以及牙髓/牙本质复合体等多种组织。目前不可逆性牙髓炎的常规治疗方案是去髓术结合根管治疗,以达到消除感染、保留患牙的目的;另一方面,由于牙周疾病引起的逆行性牙髓炎等牙周牙髓联合病变,也需要通过上述治疗手段保留患牙。近来不少研究证实,由炎性牙髓组织中也可分离培养出DPSCs,即炎性DPSCs(inflamed DPSCs,i DPSCs),此类DPSCs保留着与健康组织来源细胞相似的分化特性及组织再生潜能。此后,相继由感染根尖组织、炎性牙周组织中分离出了具有多能性的间充质细胞,上述炎性来源细胞均保留了较为良好的多向分化及组织再生潜能,这提示了分离自炎性牙齿组织的干细胞可能是未来干细胞治疗一个重要的细胞资源。然而,炎性环境对干细胞生物学特性的干预以及间充质干细胞对炎症反应的调节是多分子参与的复杂过程,对其信号通路的阐明则需要进一步深入研究。虽然由炎性牙髓组织中分离所得的牙髓干细胞经证实仍然保留着部分多向分化及组织再生潜能,但是在诸如由牙周炎症引发牙髓炎症的牙周牙髓联合病变患牙牙髓组织中是否仍然存在具有活力的牙髓干细胞,这些细胞的分化、再生潜能与由正常牙髓组织中获得的DPSCs是否存在差异,目前未却见相关研究报道。本课题将就以上问题进行集中深入研究。材料与方法本研究由因侵袭性牙周炎而必须拔除的患牙牙髓组织中分离培养炎性牙髓干细胞i DPSCs,根据患牙牙槽骨吸收程度将所分离的i DPSCs分为3个实验组(A组:牙槽骨吸收接近根尖;B组:牙槽骨吸收到达根尖但未完全波及;C组:牙槽骨吸收波及整个根尖周),以来源于同一患者因阻生或无咀嚼功能拔除的健康智齿的DPSCs作为对照。观察比较上述各组细胞克隆形成能力、增殖活力、细胞周期、细胞表面特异性标记物、细胞多向分化(成骨/成牙、成脂)能力及相关基因表达水平,并结合生物材料及离体牙根管段,异位观察各组细胞体内特征性组织新生能力。通过以上研究,综合评估牙周炎症对牙髓干细胞的影响。结果研究发现,可由前述牙槽骨不同吸收程度的患牙中分离获得阳性表达STRO-1及CD146的i DPSCs;尽管相较对照组DPSCs,各组i DPSCs(A、B及C组)的克隆形成能力及增殖活力都有显著降低,但降低的幅度与牙周炎症严重程度无明显相关性;并非所有组别的i DPSCs体外多向分化的潜能都降低;A组(牙槽骨吸收接近根尖患牙来源)i DPSCs、对照组DPSCs与生物材料复合后,移植于裸鼠皮下12周后生成了牙本质样结构;而将各组细胞/支架复合物充填于离体牙根管片段内移植于裸鼠皮下,均可观察到牙本质/牙髓样复合体样组织的生成,但相较于对照组DPSCs,i DPSCs成牙能力显著受到抑制,不过各组i DPSCs生成牙原性组织的能力与患牙牙周炎症严重程度并无相关性。结论综上所述,牙周炎症累及的患牙只要牙髓组织尚未完全坏死,就可以分离出具有MSCs(间充质干细胞)性质的i DPSCs,此类i DPSCs仍然具有一定的增殖、分化和组织再生潜能,但是这种牙周炎症来源的i DPSCs能否作为自源性干细胞进行临床再生治疗,还需基于大样本及多种类型牙周炎临床病例的研究。

关键词： 人气道上皮细胞   CSE   p120   NF-κB   炎症反应   CSE   p120   RhoA/ROCK   NF-κB   炎症反应  

摘要： 第一部分p120活化NF-κB信号通路在香烟烟雾诱导的气道上皮细胞炎症反应中的作用 一、目的 通过香烟烟雾提取物(CSE)刺激人气道上皮细胞建立气道炎症反应的体外模型,检测连环素p120(p120)表达变化及其对NF-κB信号通路的影响,初步探讨香烟烟雾所致气道炎症的分子机制。 二、方法 根据本实验室经验及相关文献制备100%CSE溶液,采用MTT检测不同浓度CSE(1%,5%,10%,15%,20%,30%,40%,50%)对细胞活力的影响。根据MTT结果,选用15%CSE作用不同时间,采用Western blot检测p120、IκBα及p-IκBa蛋白的表达变化,并采用Real-time PCR检测p120mRNA水平；运用免疫荧光、核浆分离提取蛋白技术检测NF-κB p65蛋白表达及分布的改变；采用ELISA和Real-time PCR检测IL-8蛋白及mRNA表达水平的改变。采用瞬时转染特异性p120siRNA敲低上皮细胞中p120的表达或采用脂质体瞬时转染p1201A和3A质粒,观察CSE刺激下p120表达水平变化对NF-κB信号通路的影响。 三、结果 ***结果显示15%CSE刺激24h后气道上皮细胞仍保持80%的活力,但20%CSE作用后细胞活力降至40%。Western blot检测发现p120主要以亚型3存在于人气道上皮细胞,其表达下调呈浓度和时间依赖性。Real-time PCR结果显示p120mRNA含量也一致性减少。 2.15%CSE刺激人气道上皮细胞后,Western blot检测显示IκBα表达减少而p-IκBα水平增加；细胞核浆分离提蛋白后Western blot检测发现NF-κB p65蛋白胞质表达减少,而核内表达增加；免疫荧光染色也证实NF-κB p65发生核转位。同时,Real-time PCR和ELISA检测发现前炎症因子IL-8(NF-κB信号下游的靶基因)蛋白及mRNA的表达随刺激时间的延长显著增加。 3.采用siRNA沉默p120在气道上皮细胞中的表达后给予15%CSE刺激,虽然NF-κB总蛋白含量没有变化,但其在Ser536位点的磷酸化显著增加,与Scramble组比较,差异具有显著性(P<0.05)。ELISA检测发现IL-8、IL-1β及IL-6的表达水平较Scramble组也显著增加(P<0.001)。 4.转染p1201A和3A质粒入气道上皮细胞后给予15%CSE刺激,虽然NF-κB总蛋白没有改变,但其在Ser536位点的磷酸化相对于MT组显著降低,差异具有显著性(P<0.05)。同时,ELISA检测发现IL-8、IL-1p及IL-6的表达水平较MT组显著减少(P<0.001)。 四、结论 在CSE诱导的气道炎症反应中,p120可能通过NF-κB信号通路发挥调控炎症反应的作用。 第二部分气道炎症反应中p120活化NF-κB信号通路的可能机制 一、目的 通过检测CSE刺激后RhoA/ROCK的活性和蛋白水平变化以及另一种粘附连接蛋白E-cadherin的表达变化,进一步探讨气道炎症反应中p120活化NF-κB信号通路的可能分子机制。 二、方法 首先采用CSE刺激复制气道上皮细胞炎症反应模型,然后加入ROCK抑制剂Y27632抑制RhoA/ROCK信号,瞬时转染特异性p120siRNA沉默p120或p1203A质粒外源性过表达p120,并转染不能结合RhoA的p120突变质粒(p120DRDD-GFP)及不能结合E-cadherin的p120突变质粒(p120DEcad-GFP),采用Western blot检测p120、 E-cadherin、 NF-κB p65、 RhoA及ROCK1的蛋白表达；免疫共沉淀技术检测p120与RhoA结合情况；免疫荧光和ELISA技术检测NF-κB p65的定位和Ser536位点的磷酸化情况；G-LISA技术检测RhoA活性的变化。 三、结果 1.15%CSE刺激后,Western blot结果显示虽然RhoA总蛋白没有变化,但是下游蛋白ROCK1的表达增加：粘附连接蛋白E-cadherin的表达减少。 2.免疫共沉淀结果发现气道上皮细胞中p120与RhoA存在于同一复合物中。15%CSE作用下,虽然与p120结合的RhoA蛋白改变不明显,但G-LISA检测显示RhoA活性显著上升。 3. siRNA沉默p120后,在15%CSE刺激后气道上皮细胞内虽然RhoA,总蛋白无变化,但ROCK1的表达增加。G-LISA检测也显示RhoA的活性显著上升,与Scramble组比较,差异显著(P<0.05)。过表达p1203A后,在

关键词： 普罗布考   C反应蛋白   慢性心衰   血浆脑钠肽   脑利钠肽   心功能   急性心衰   洋地黄制剂   β受体阻滞剂   炎症状态  

摘要： 目的:观察心力衰竭(CHF)患者脑利钠肽(BNP)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)与心功能的关系。方法:56例慢性心衰患者随机分为治疗组和对照组,各28例。治疗组在常规治疗基础上加普罗布考0.5g,bid,连续4周,并于治疗前后进行BNP与hs-CRP测定。结果:普罗布考组BNP、hs-CRP水平明显降低与治疗前及对照组。(P<0.01)。而对照组前后无显著差异。结论:普罗布考通过降低BNP及hs-CRP水平缓解心力衰竭患者的炎症状态。

关键词： 大肠杆菌   脓毒症   外源性一氧化碳   NF-κB  

摘要： 背景与目的脓毒症是由感染、创伤或各种疾病引发的系统性炎性反应,是一种复杂的严重的临床综合征。尽管在危重病的诊断与救治已经高度发展的今天,其发病率及病死率仍旧居高不下。据最新的流行病学调查显示,在美国每年罹患脓毒症的病人数约为其人口总数的3%,并且其中有四分之一的病人死亡。这些脓毒症病例中由细菌感染引起的约占总数的95%,而由革兰氏阴性杆菌感染引起的病例占所有脓毒症患者的62.2%,其中大肠杆菌是重要的感染源(占总数的16%)。在脓毒症后期,患者肠道功能紊乱,肠道屏障功能降低,作为条件致病菌的大肠杆菌能发生菌群移位,从而进一步加重脓毒症患者的感染。本研究旨在探索外源性一氧化碳释放分子Ⅱ(CORM-2)对体外大肠杆菌(ATCC25922)生长的抑制作用以及CORM-2对大肠杆菌诱导的感染小鼠炎症反应的抑制作用,并分析其作用机制。方法本研究分为两部分。第一部分,观察CORM-2对体外大肠杆菌生长的抑制作用。本节研究中,将大肠杆菌在体外与CORM-2或无活性的iCORM2共同孵育培养,通过观察细菌48小时的生长曲线和对应的菌落计数来验证CORM-2对大肠杆菌的抑制作用。第二部分,小鼠腹腔注射大肠杆菌,建立大肠杆菌诱导的小鼠感染模型。再应用CORM2对大肠杆菌诱导的感染小鼠进行干预,验证CORM-2对感染小鼠的炎症反应的抑制作用及其机制。实验分组为对照组、细菌组、细菌+CORM-2组、细菌+iCORM-2组。细菌组小鼠于腹腔注射预先制备的大肠杆菌悬液0.5ml;对照组腹腔注射同等剂量的NaCl溶液;CORM-2和iCORM-2组于腹腔注射大肠杆菌悬液后分别尾静脉注射CORM-2或iCORM-2 (8mg/kg),观察各组小鼠36小时生存率。另取小鼠制作模型,于6小时后分别收集各组小鼠血清和肝肺组织,苏木精一伊红(HE)染色的方法观察肝、肺组织病理学改变;终点显色法检测血清中内毒素LPS的含量;通过测定肺组织湿干重比(W／D)来判断肺部的水肿情况;通过血清转氨酶的测定来判断肝脏功能、肝细胞的损伤情况;使用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清及肝、肺组织匀浆中早期炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1p(IL-Iβ)的表达水平;通过检测肝、肺组织匀浆中髓过氧化物酶(MPO)活性来反应中性粒细胞的浸润、聚集程度;使用实时定量荧光PCR的方法检测一氧化氮合酶(iNOS) mRNA表达;使用菌落计数检测腹腔灌洗液、血、肝肺组织中大肠杆菌的数目;使用Western-blot蛋臼质印迹法检测核因子κB (NF-κB)活性。结果1、CORM-2对体外大肠杆菌的生长有抑制作用。实验结果显示与细菌组和细菌+iCORM2组比较,细菌+CORM-2组细菌的生长明显被抑制,进入增殖活性平台期的时间明显滞后,且同期菌落计数表明,细菌数明显减少。2、CORM-2能够提高大肠杆菌引起的脓毒症小鼠的生存率,对细菌感染引起的小鼠炎症反应有抑制作用。使用CORM-2干预能降低细菌感染小鼠血清中LPS水平,减轻其肺间质水肿程度,保护肝脏的功能,减少血浆及肝肺脏中炎症因子TNF-α、IL-1β的表达水平,减少重要脏器白细胞的浸润和大肠杆菌的数量,降低iNOS mRNA表达,同时亦抑制了重要炎症信号分子NF-KB的活化,提高细菌感染小鼠36h的生存率。结论CORM-2能够直接抑制体外大肠杆菌的生长,抑制大肠杆菌诱导的感染小鼠的炎症反应,保护重要脏器,提高感染小鼠生存率,这可能与CORM-2抑制炎症信号分子NF-KB的活化有关。

关键词： 肺动脉血栓栓塞   静脉血栓形成   炎症   感染   法医病理学   组织因子   核因子-κB   凝血功能  

摘要： 第一部分炎症与肺动脉血栓栓塞临床、病理相关性分析目的：探讨肺动脉血栓栓塞的关键高危因素,为预防该疾病的发生提供参考。方法：对死于肺动脉血栓栓塞患者的病历及尸检资料进行回顾性分析。临床资料包括：年龄、性别、既往病史、治疗情况等。尸检资料包含：案情介绍、尸检大体标本观察、显微镜观察、病理诊断及实验室检查、死因分析等。结果：男性27例,女性24例,年龄最大81岁,最小13岁,平均年龄47.12±15.82岁;起病急,短时间内死亡;血栓多来源于下肢深静脉;49例存在内脏器官感染,其中呼吸系统感染43例,36例合并创伤或手术;2例无明显感染但存在创伤。结论：肺动脉血栓栓塞死亡患者均存在感染、创伤等炎症状态;尤其是呼吸系统感染与肺动脉血栓栓塞有关。第二部分炎症状态下大鼠体内NF-κB介导TF表达及意义目的：探讨不同炎症状态下大鼠体内单核细胞NF-κB及TF表达情况,分析炎症介导凝血功能紊乱的机制。方法：32只SD大鼠分为对照组、酪蛋白组、肺炎链球菌感染组及铜绿假单胞菌感染组,每组8只。酪蛋白注射组大鼠腹腔注射6ml 12%酪蛋白溶液、肺炎链球菌感染组大鼠鼻腔滴入0.12ml (9×108 CFU/ml)肺炎链球菌溶液、铜绿假单胞菌感染组大鼠鼻腔滴入0.12ml(9×108 CFU/ml)铜绿假单胞菌溶液。48小时后取心血行血常规、hs-CRP,D-二聚体检测,肺组织病理学观察。观察心脏与血管内是否有血栓形成,提取血液单核细胞采用Real-Time PCR检测NF-κBp65 mRNA、TF mRNA表达,Western blot检测磷酸化p65、磷酸化IκBa及TF蛋白表达。并对hs-CRP量与磷酸化p65、磷酸化IκBa及TF蛋白表达量进行相关性分析。结果：心脏与血管中未发现血栓形成。对照组及酪蛋白组肺组织结构正常,肺炎链球菌感染组、铜绿假单胞菌感染组肺泡壁炎细胞浸润。实验组与对照组WBC、单核细胞及hs-CRP比较显著增高,有统计学意义(P<0.05)。实验组与对照组D-二聚体比较显著增高,有统计学意义(P<0.05)。实验组与对照组NF-κBp65、TFmRNA表达,磷酸化p65、磷酸化IκBa及TF蛋白表达显著增强,有统计学意义(P<0.05)。hs-CRP水平与磷酸化p65、磷酸化IκBa及TF蛋白表达量均呈正相关。结论：TF是凝血的启动子,炎症状态(炎症因子)可以通过NF-κB途径促进TF表达,启动凝血途径。炎症越强,启动凝血作用越强。尤其是感染激活NF-κB途径致TF表达更显著,相同程度的感染中PA组较SP组介导TF表达更强。

关键词： 重叠综合症   间歇低氧   肺气肿   炎症   凝血因子  

摘要： 背景与目的:慢性阻塞性肺病和阻塞性睡眠呼吸暂停均能增加系统炎症和心血管疾病发生风险。两者同时存在,即重叠综合症,较睡眠呼吸暂停或慢性阻塞性肺病单独存在时低氧血症和高碳酸血症程度更著,且心血管死亡风险更大。因此,我们建立肺气肿合并间歇低氧模型,探索肺气肿合并间歇低氧是否导致严重的肺脏、肝脏、胰腺、颈动脉及外周血炎症状态,探讨炎症是否改变肝脏合成的凝血/抗凝血因子水平,并检测外周血中性粒细胞(PMN)、T淋巴细胞凋亡率及内皮祖细胞(EPC)水平以探索EPC动员情况。实验方法:将60只Wistar大鼠分成4组。对照组:假烟熏暴露和常氧暴露;IH组:假烟熏暴露和IH暴露;IH暴露:将大鼠置于特制IH装置中每天9AM到5PM通入交替氮气30s和空气90s,从13周开始到16周结束持续4周;肺气肿组:烟熏暴露和正常氧暴露,每天早上9AM之前和5PM之后两次将大鼠暴露于15只香烟烟雾持续16周;重叠组:烟熏暴露和IH暴露。每组随机选取5只大鼠进行血气分析预实验。剩下的每组10只大鼠,收集肺泡灌洗液行细胞计数,收集外周血检测T淋巴细胞凋亡率、中性粒细胞(PMN)凋亡率及内皮祖细胞(EPC)相对浓度。同时检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及肝脏凝血/抗凝血因子(抗凝血酶(AT)、纤维蛋白原(FIB)、VIII因子(F VIII)、血管性血友病因子(v WF))。我们提取肺组织块、肝脏、胰腺、右颈动脉进行病理评分病检测肝脏氧化应激指标(肝脏氧化应激酶,超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)浓度)。采用SPSS 11.5软件进行数据分析。结果:(1)各组大鼠肺病理评分、MLI重叠组>肺气肿组>IH组>对照组(均P<0.05),各组大鼠MAN是重叠组<肺气肿组IH组(20.65±1.3066071)>肺气肿组(18.49±1.6736188)>对照组(13.02±1.1820885),CD3+CD8+淋巴细胞凋亡率重叠组(18.42±1.1583513)IH组(19.20±1.1814,13.60±2.951,18.50±4.743,53.9950±1.80079)。(6)各组大鼠BALF中巨噬细胞比例是肺气肿组(75.25±2.530)%和对照组(73.55±9.847)%>IH组(45.45±4.368)%>重叠组(36.75±6.857)%,肺气肿组和对照组无显著差异;淋巴细胞比例为重叠组(60.50±7.944)%和IH组(53.25±5.514)%>对照组(24.85±10.504)%>肺气肿组(9.85±2.358)%,重叠组和IH组无显著差异;中性粒细胞比例肺气肿组(14.90±3.062)%明显高于其他组,对照组(1.60±1.174)、IH组(1.30±1.903)、重叠组(2.75±1.919)间无统计学差异。(7)各组大鼠AT、FIB、v WF、F VIII差异明显(F=71.570,171.073,129.446,289.047,P=0.000),FIB、v WF、F VIII重叠组(201.330±6.6291,72.570±3.8268,315.920±26.1305)最高,对照组最低(134.730±6.4790,48.890±2.4978,116.350±3.8254),IH组(153.120±6.8579,57.520±2.3569,198.680±7.9140)<肺气肿组(175.790±7.8053,65.310±2.3695,231.030±13.5187),AT对照组(123.10±3.281)最高,重叠组(96.12±5.351)最低,IH组(117.10±2.885)高于肺气肿组(105.37±5.779)。(8)各组大鼠SOD、CAT、MDA差异明显(F=90.206,270.257,118.267,P均=0.000),SOD、CAT对照组(88.300±4.5097、113.820±6.30726)最低,重叠组(63.860±3.7283,49.8480±3.62149)最低,肺气肿组(73.970±2.2361,79.0330±5.05598)