关键词：
锌指蛋白A20
人牙髓干细胞
脂多糖
增殖
分化
摘要：
常见牙病(牙髓炎、根尖周炎)的实质是炎症,牙髓炎主要继发于龋病,致龋微生物及其产物可以通过暴露的髓腔或者牙本质小管间接感染牙髓。由于缺乏自愈能力,感染后的牙髓组织会引发炎症反应,继而变性或坏死,导致根尖周炎、牙齿缺失、牙槽骨缺损等继发性疾病[1]。因此,设法增强牙齿及其周围组织对炎症的抵抗力,以及在炎症状态下的修复能力,对于牙齿的保存治疗具有重要意义。锌指蛋白A20是一种具有高度生物学活性的蛋白。作为NF-κB通路中的一个重要的负反馈调节因子,A20不仅能够抑制NF-κB的活性,还能阻断多种炎症介质的释放,因此在控制炎症方面有很大的应用前景,但其在炎症性牙病发生、发展、转归中的作用却鲜见报道。人牙髓干细胞(hDPSCs)被认为是来源于牙髓组织的未分化间充质细胞,具备高度增殖能力、形成细胞克隆能力及多向分化潜能。DPSCs的发现让我们对牙齿的发育、再生及其修复机制有了进一步认识,为开发新的牙病治疗方法提供了新的思路。本研究拟通过RNA干扰技术,建立炎症状态下牙髓干细胞A20基因沉默的细胞模型,探讨a20基因沉默对hdpscs增殖及分化能力的影响,为探索牙髓炎、根尖周炎的新疗法打下理论基础。实验方法及结果如下:1、hdpscs的分离、培养及鉴定临床上收集15-28岁成人健康完整第三磨牙,用组织块酶消化法原代培养hdpscs,有限稀释法挑取单细胞克隆并进行扩大培养,通过流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测和鉴定,体外矿化诱导两周后进行茜素红染色以检测细胞的分化潜能。实验结果表明,成功分离培养出了具有良好的增殖能力及分化潜能的hdpscs。2、炎症状态下hdpscs中a20表达量的变化通过脂多糖lps刺激细胞,模拟体外的炎性环境,观察lps刺激下牙髓干细胞中a20表达量的变化。用浓度为1ug/ml的lps刺激液培养细胞,分别在刺激2h、6h、12h、24h、48h、72h后收集细胞,通过westernblot技术检测hdpscs中a20的表达情况。结果显示:在lps刺激2h时,a20的表达量即迅速增加并一直持续到48h,在72h时,a20的表达量已回到基础水平。由此我们可以得出结论:在炎症状态下,a20的表达具有时效性,即在早期呈现一过性的高表达。3、a20基因沉默的hdpscs细胞模型的建立为了研究lps刺激下,a20基因沉默对hdpsc增殖及分化的影响,我们采用rna干涉技术构建a20基因沉默的细胞模型。参考相关文献设计sirna的序列,并委托上海吉玛制药技术有限公司合成。在预实验中,我们对sirna的转染条件进行了优化,确保能够实现最高的转染效率。用对任何片段都不具有干涉作用的nc-sirna设为对照组,采用westernblot技术验证a20-sirna的干涉效果,结果显示a20的表达水平明显下降,表明hdpscs中a20基因抑制的细胞模型的构建是成功的。4、炎症状态下a20基因沉默对hdpscs增殖能力的影响利用lps模拟体外的炎症环境,用cck-8试剂盒研究在炎症状态下a20基因沉默对hdpsc增殖能力的影响。在sirna成功转染hdpscs后,将细胞种于96孔板中,并加入lps刺激,分别于1、3、5、7天用酶标仪测定在450nm处的吸光度值,判定细胞的生长状况。结果显示,实验组中hdpsc的生长状况受到明显抑制,与对照组相比有显著性差异,表明A20基因沉默能够显著降低hDPSCs的增殖能力。5、炎症状态下A20基因沉默对hDPSCs分化能力的影响将转染过siRNA的hDPSCs矿化诱导14天后进行茜素红染色,发现实验组矿化结节的数量明显低于对照组,对以上染色结果进行定量分析后的数据显示,该差异具有统计学意义(P<0.05)。对牙髓干细胞分化相关标志物碱性磷酸酶(ALP)的活性检测显示,与对照组相比,实验组hDPSCs的ALP活性受到了明显抑制。接着对牙髓干细胞的部分成骨/成牙相关基因ALP、DSPP、OCN、RUNX2的表达情况进行检测,RT-PCR结果显示,实验组中这些基因的表达水平明显低于对照组。以上结果提示:在炎症状态下,A20基因沉默能够抑制hDPSC的分化能力。本研究通过体外实验证明,锌指蛋白A20在人牙髓干细胞具有一定的基础表达水平,炎症状态下,A20的表达具有时效性,即在早期呈现一过性的高表达,而后维持基础表达量,以维系hDPSCs的增殖和分化能力。通过RNA干涉技术对hDPSC中A20的表达进行了阻断,导致其表达量低于基础表达量后,发现A20基因沉默是hDPSCs对抗炎症能力下降的重要原因,具体表现为其增殖能力及分化能力的下降。
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