关键词：
异烟肼
斑马鱼
肝损伤
炎症状态
凋亡
内质网应激
药物转运体
摘要：
目的:1、利用无毒剂量的内毒素(LPS)预处理引起斑马鱼产生炎症反应,建立基于炎症状态斑马鱼的药物肝毒性评价模型。2、确定肝损伤药物异烟肼(INH)对斑马鱼的量-毒关系,比较INH对正常和炎症状态斑马鱼的肝脏毒性作用差异。3、基于炎症状态斑马鱼模型,研究炎症状态下INH的肝毒性作用特点,阐述其肝毒性作用机制。方法:1、斑马鱼内毒素炎症模型的建立:以正常发育3 dpf(day post-fertilization,dpf)的绿色荧光标记肝脏细胞、红色荧光标记中性粒细胞和巨噬细胞Tg系(lfabp:EGFP;lyz:DsRED2)转基因斑马鱼为实验对象,将不同浓度的LPS(0.025、0.05、0.1 mg/mL)以渗透方式连续给药72 h,每24 h换药液,分别于施药24、48、72 hpe(hour post exposure,hpe)时观察并记录死亡率、畸形率和体长,同时在显微镜下观察斑马鱼形态变化;应用Tg系(lfabp:EGFP;lyz:DsRED2)转基因斑马鱼实时观察不同浓度的LPS对斑马鱼红色荧光标记的中性粒和巨噬细胞迁移聚集的变化、绿色荧光标记的肝脏形态及荧光强度的影响。通过以上实验筛选LPS产生炎症且无肝损伤的造模剂量。2、炎症状态下INH的肝脏毒性研究:(1)INH对正常状态斑马鱼的量-毒关系研究。采用健康发育至3 dpf的斑马鱼,将不同浓度的INH(1、2、4、6、8、16 mM)以渗透方式连续给药72 h,每24 h换药液。分别于施药24、48、72 hpe时记录死亡率、畸形率、体长、形态和肝脏面积及荧光强度变化,HE染色观察斑马鱼肝组织病理改变。(2)INH对炎症状态斑马鱼的肝脏毒性研究。采用正常发育3 dpf的斑马鱼,应用实验1确定的LPS染毒剂量造模,实验分为溶剂对照组、LPS组、INH组、LPS+INH组,分别于施药后24、48、72 hpe观察并记录各实验组斑马鱼的死亡率、畸形情况、炎症效应、肝脏形态、肝脏荧光强度和卵黄囊吸收情况,对各组斑马鱼进行药物器官毒性评分,检测各组斑马鱼行为学差异,测定ALT和AST含量,HE染色观察斑马鱼肝组织病理改变。3、炎症状态下INH的肝毒性机制研究。采用电镜观察各组药物作用72 hpe时斑马鱼肝脏细胞内细胞核、线粒体和内质网等细胞器的变化,利用Quantitative Real-time-PCR方法检测与内质网应激、凋亡和药物转运体信号通路相关因子的基因转录水平。结果:1、0.025 mg/mL剂量的LPS可诱发斑马鱼产生炎症反应,该剂量可引起明显的中性粒和巨噬细胞聚集,但对斑马鱼幼鱼的形态发育和肝脏无毒性作用;大于0.05 mg/mL剂量可引起中性粒和巨噬细胞大量聚集,对斑马鱼有致畸作用,主要表现为斑马鱼脊柱弯曲、鱼鳔缺失、生长停滞和死亡等,并且对斑马鱼有明显的肝脏毒性作用。因此选择0.025 mg/mL的LPS预处理幼鱼构建斑马鱼内毒素炎症模型。2、(1)INH对斑马鱼的毒性呈剂量相关性。单用INH组,1mMINH对斑马鱼的形态发育和肝脏均无毒性作用,2 mM INH在72 hpe时可造成斑马鱼肝脏荧光面积轻微减小,4 mM INH可造成斑马鱼轻度畸形(主要表现为鱼鳔减小)和轻微的肝毒性,6 mMINH对斑马鱼具有中度致畸作用,主要表现在腹部水肿、鱼鳔减小/缺失、躯体弯曲和部分死亡等,并且可引起明显的肝脏荧光面积减小、荧光强度减弱、肝细胞之间连接疏松,大于8 mM剂量的INH可引起斑马鱼严重畸形和非常显著的肝毒性,HE染色观察到肝细胞出现明显的肿胀、轮廓不清晰和胞质稀疏等现象。(2)与单用INH组比,炎症状态下,INH的致畸作用更加明显,行动受抑制更加严重,肝脏荧光面积和荧光强度显著性降低,ALT和AST水平显著升高,HE染色结果显示炎症状态下肝细胞受损更加明显,主要表现在胞核萎缩变形、胞质溶解。3、电镜结果显示溶剂对照组和LPS组肝细胞结构正常,4mM INH组显示线粒体结构异常,线粒体嵴可见明显肿胀、嵴断裂或消失现象,LPS(0.025 mg/mL)+INH(4mM)组,细胞核不规则,核仁消失,粗面内质网减少,内质网出现扩张、肿胀、断裂和扭曲等现象,胞质内甚至出现部分空泡结构,线粒体数量减少,且线粒体嵴断裂、溶解现象比INH(4mM)组严重。RT-PCR检测内质网应激相关因子的转录水平,相对于单用INH组,LPS+4mMINH组斑马鱼Bip/GRP78、ATF6、PERK、IRE1、GRP94、CHOP转录水平显著性上调,LPS+2 mM、LPS+4 mM INH组斑马鱼XBP1转录水平显著性上调;RT-PCR检测凋亡相关因子的转录水平,相对于单用INH组,LPS+4 mMINH 组斑马鱼 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、B
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