关键词： 血管生成素样蛋白-8   寡聚化   核因子-?B重要调节因子   截短突变  

摘要： 炎症反应作为身体免疫反应的重要组成部分,与炎症性疾病、代谢疾病及癌症等多种类型疾病密切相关。而在炎症反应的信号通路中,核因子-kB(nuclear factor-kB,NF-kB)是一个核心转录因子。NF-kB在体内分布广泛,NF-kB功能的异常与多种疾病相关,如骨骼和关节缺陷、血红蛋白免疫缺陷症等。在NF-kB信号通路中,抑制性蛋白激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)复合物起着重要的调节作用。IKK复合物是由IKKa、IKKb和IKKγ组成的多聚复合物,而IKKγ在IKK复合物乃至NF-kB信号通路中都占有重要的地位,其功能异常与色素失禁症、无汗性外胚层发育不良等多种疾病紧密相关。本课题组前期研究发现,血管生成素样蛋白-8(angiopoietin like-8,ANGPTL8)可以通过自噬受体p62介导的选择性自噬途径降解IKKγ从而负调控(45)F-k(33)炎症信号通路。而自噬途径中,常伴有蛋白质的寡聚化或者大分子的蛋白复合物形成。为了探索ANGPTL8是否也会通过形成寡聚物从而降解IKKγ,我们对ANGPTL8和自身、IKKγ以及自噬受体p62相互作用的结构域进行了探究。首先,荧光共定位实验结果显示(32)(45)GPTL8、IKKγ、p(21)(17)三者在胞内存在部分共定位,且共定位的形式为大的斑点,提示三者以聚集体的形式共同存在。其次,我们利用多种实验方法对重组蛋白ANGPTL8的聚集性进行体外探究,发现ANGPTL8在体外孵育后可以形成高分子寡聚物以及不溶性纤维结构。根据文献中对ANGPTL8结构域的划分,我们构建了六个包含不同结构域的ANGPTL8截短突变,并以其为材料,使用免疫共沉淀实验、分子筛层析等实验方法证实ANGPTL8可以通过26-70 aa这一片段自身寡聚化并降解IKKγ,此外,还可以通过(22)(16)-(16)(19)(15)aa这一片段和p62结合。这一研究成果为ANGPTL8后续的功能探究提供了基础。ANGPTL8的寡聚化是其负调控炎症通路的重要条件,这一机制的阐明提示了炎症反应和代谢性疾病的内在联系,为代谢性疾病的治疗提供了新的思路。

关键词： BAFF和BAFFR   颞叶癫痫   免疫炎症反应  

摘要： 目的:BAFF主要通过调控BAFFR受体参与中枢神经系统免疫炎症反应的病理生理过程。目前尚不清楚BAFF和BAFFR是否也参与了癫痫的病理过程中。本研究主要通过对难治性癫痫患者以及癫痫大鼠模型脑组织中BAFF和BAFFR的表达变化,探讨BAFF和BAFFR在癫痫发病机制的作用。方法:1.本实验以24例难治性癫痫患者手术切除的颞叶病灶标本为实验组,以8例脑外伤患者手术切除的颞叶皮质作为对照组。2.将30只SD雄性大鼠随机均分为实验组和对照组,实验组SD大鼠给予匹鲁卡品腹腔注射,对照组给予生理盐水腹腔注射,观察癫痫动物模型的急性发作情况及2个月后的慢性发作情况。3.采用免疫荧光和免疫组化对BAFF和BAFFR进行蛋白表达定位,Western-blot和RT-qPCR技术对BAFF和BAFFR进行到蛋白表达定量。结果:免疫荧光结果显示BAFF和BAFFR在癫痫患者和大鼠模型神经元的细胞质和细胞膜中表达,在神经胶质细胞中不表达;免疫组化结果显示BAFF和BAFFR蛋白在癫痫患者及动物模型神经元的细胞质和细胞膜中都有表达,并且表达强度明显高于对照组(P<0.05);Western-blot和RT-PCR结果显示BAFF和BAFFR在癫痫患者及动物模型中表达量皆较对照组明显升高(P<0.05)。结论:BAFF和BAFFR在癫痫患者及癫痫大鼠模型中表达量明显升高。目前研究表明BAFF和BAFFR参与中枢神经系统的免疫及炎症反应,故我们推测升高的BAFF和BAFFR是通过免疫炎症反应来调节癫痫的发病过程并具有一定的作用。

关键词： 帕金森病   脑内炎症   小胶质细胞   单核细胞   免疫耐受  

摘要： 目的:脑内的炎症反应是许多神经系统变性病共同存在的发病机制，而帕金森病(PD)作为发病率第二的严重危害中老年人健康的神经系统变性病，包括脑内小胶质细胞的激活、前炎性因子的过度释放及细胞内活性氧(ROS)系统过度激活的脑内炎症是PD的重要病因。其中小胶质细胞是中枢神经系统免疫活动的核心，其活化后具备抗原提呈、吞噬、释放超氧离子及前炎性因子等能力，能对周围的神经元造成损伤，因而对小胶质细胞激活及脑内炎症的有效调控成为影响PD的关键。　　尽管受到血脑屏障的保护，中枢神经系统一直受到外周免疫的深刻影响。一次大剂量LPS腹腔注射诱发的外周炎症足以引起健康中枢神经系统的免疫激活和多巴胺神经元的变性死亡。外周血单核细胞(PBM)是外周免疫的启动者，处于启动调控外周免疫的核心地位，同时外周血单核细胞与小胶质细胞同属单核巨噬细胞系统，具有相似的起源、功能及受体表达，且PBM具有变形穿越能力，它能穿越血脑屏障入脑演变成小胶质细胞或血管周巨噬细胞等脑内特殊巨噬细胞群直接或间接参与中枢炎症反应，因此不难推测PBM在外周与中枢的联系中扮演了重要角色，是外周影响中枢免疫活动的重要通路。　　免疫耐受是机体面对持续抗原威胁或连续打击的一种保护机制，它避免了不必要损伤的发生，是机体防御机制的重要组成部分，而单核巨噬细胞系统在免疫耐受的整个过程中发挥了主要的作用。PD患者外周血中持续存在能够诱导PBM发生免疫耐受低剂量的LPS，而实际上PD患者外周血免疫细胞处于激活状态，提示PD患者可能存在PBM免疫耐受的障碍，而PBM的免疫耐受障碍的存在可能是PD患者脑内炎症失控的一个重要发病机制。CD200R是PBM表面常规表达的受体，积极参与了巨噬细胞的免疫下调，同时CD200/CD200R通路与免疫耐受密切相关。我们既往的研究结果显示PD患者外周血单核细胞衍生的巨噬细胞在应激环境中CD200/CD200R通路难以有效发挥作用。因此我们推测CD200/CD200R通路积极参与了PBM的免疫下调，CD200/CD200R通路异常可能是PD患者外周PBM免疫耐受失败的重要机制。　　考虑到低剂量LPS能够诱导PBM发生免疫耐受，而PBM是外周免疫与中枢连接的重要中介，我们推测低剂量LPS诱导了PBM的免疫耐受，使其免疫活动下调，后者影响并限制了脑内炎症的发展，使更多神经元免于无辜的炎症损伤，从而对损伤神经元起到保护作用。而该过程中PBM免疫耐受的形成是抑制小胶质细胞活化、下调脑内炎症、保护神经元存活的关键。因此PBM的免疫耐受有可能是中枢神经系统自身保护、避免过度炎症损伤的重要外周机制。　　方法:1、为了获得能够诱导大鼠PBM免疫耐受的合适的LPS剂量，我们采用NS、LPS0.1mg/kg、LPS0.3mg/kg、LPS0.9mg/kg剂量梯度连续4天间隔24小时腹腔注射，于第5天我们采用贴壁法得到大鼠外周血PBM并再次给予LPS100ng/ml刺激，通过刺激后细胞上清前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及PBM表面抗原TLR4的变化情况来确定大鼠免疫状态以得到能够诱导PBM免疫耐受的合适的LPS剂量。2、我们采用大剂量LPS（5mg/kg）腹腔注射来诱导大鼠脑内炎症模型。同时为了验证PBM在外周LPS诱导脑内炎症的作用，我们采用氯膦酸二钠脂质体鼠尾静脉注射来耗竭大鼠的PBM，即PBM耗竭组。实验分为4组:正常对照组(n=15)、LPS组(n=15)、PBM免疫耐受+LPS组(n=15)、PBM耗竭+LPS组(n=15);分别对各组大鼠大剂量LPS腹腔注射后48h内的生存率进行鉴定。3、为了对PBM及PBM的免疫状态对脑内炎症的影响进行研究，分别对LPS组(n=6)、PBM免疫耐受+LPS组(n=6)、PBM耗竭+LPS组（n=6）各组予大剂量LPS注射后的2h、1d、7d对外周及中枢的免疫状态进行鉴定，包括外周血上清前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及PBM表面抗原TLR4、CD200R的变化，脑内黑质前炎性因子TNF-α、IL-1β的含量及小胶质细胞的激活标记物CD68、MHCⅡ的表达情况及各组黑质多巴胺能神经元的存活情况。4、为了对CD200/CD200R通路在PBM免疫耐受形成中的作用进行研究，我们在体外采用以终浓度为10ng/ml的LPS的10％培养基孵育24h诱导PBM的免疫耐受并采用终浓度为5ug/ml的抗CD200R1抗体阻断CD200/CD200R通路。我们将贴壁法提取的正常大鼠的PBM分为对照组、PBM免疫耐受组(10ng/ml LPS)及PBM免疫耐受+anti-CD200R1组（10ng/ml LPS+5ug/ml anti-CD200R1抗体），分别孵育24小时后给予LPS100ng/ml再刺激4h后检测各组细胞培养上清中TNF-α及IL-1β含量，

关键词： 蛛网膜下腔出血   芬戈莫德   免疫炎症反应   调节性T细胞   自然杀伤细胞   炎症因子   早期脑损伤   脑血管痉挛  

摘要： 目的自发性蛛网膜下腔出血（SAH）具有高致残率和高死亡率的临床特点。目前,SAH的神经功能障碍尚缺乏行之有效的治疗方法。观察SAH早期免疫炎症反应的变化,并应用新型免疫抑制剂芬戈莫德（Fingolimod）干预,探索SAH治疗的新途径。方法第一部分:于基因表达数据库（GEO）下载小鼠脑基底动脉基因芯片（GSE46696）,使用微阵列分析假手术组（Sham组）和模型组（SAH组）样本各3份的基因变化,应用Cytoscape软件对差异表达基因进行功能分析、通路富集分析以及基因-基因互相作用分析。第二部分:假手术组（Sham组）和造模组（SAH组）小鼠各12只,分别于造模后1d、3d各选取6只小鼠应用流式细胞仪检测脑组织自然杀伤细胞（NK）、CD4+和CD25+内源性调节性T细胞（Treg）,分别于造模后1d、3d各选取6只小鼠应用Western Blot检测脑组织免疫炎性因子,根据本论文第一部分分析结果,对相对显著的免疫炎性因子或炎症通路IL-1β、TNF-α、NF-κB和TLR4进行检测。第三部分:本部分实验分为假手术组（Sham组）、造模+生理盐水安慰剂组（SAH+Saline组）、造模+芬戈莫德治疗组（SAH+Fingolimod组）,SAH+Fingolimod组于造模后2h、48h、72h分别给予Fingolimod（FTY720）腹腔注射,给药浓度为0.1mg/m L（按体重计算每只小鼠给药约200-230μg）。分别于3组中造模给药后第1d、3d抽取小鼠6只,应用流式细胞仪检测模型脑组织自然杀伤细胞（NK）、CD4+和CD25+内源性调节性T细胞;分别于3组中造模给药后第3d抽取小鼠6只,应用Western Blot检测模型脑组织炎症细胞因子或炎症通路IL-1β、TNF-α、NK-κB、TLR4;分别于3组中造模给药后第1d、3d、7d、14d抽取小鼠6只,检测脑组织水含量;分别于3组中造模给药后第1d、3d、7d、14d抽取小鼠6只,自鼠尾静脉注入2%伊文蓝（EB）溶液,检测脑组织EB含量;分别于3组中造模给药后第1d、3d、7d、10d、14d抽取小鼠6只,应用mNNS评分和Morris水迷宫实验,进行小鼠神经功能评估。结果第一部分:小鼠SAH模型脑基底动脉的基因芯片及免疫炎症因子的功能分析,可以发现在SAH早期免疫炎症反应有可能是导致预后不良的重要原因,其中IL-1β、TNF-α等炎症因子和NF-κB、TLR4等炎症通路的显著变化有可能是SAH早期脑损伤（EBI）严重程度的敏感标志之一。第二部分:SAH造模后早期NK细胞/CD3+T细胞的百分比明显增高,与Sham组比较,差异具有统计学意义（均P<0.05）;SAH组CD4+和Foxp3+T细胞与CD4+T细胞计数的比例,与Sham组比较,略有升高,差异无统计学意义（均P>0.05）;Western Blot检测脑组织免疫炎性因子或通路IL-1β、TNF-α、NF-κB和TLR4与β-action蛋白的比例明显升高,与Sham组比较,差异具有统计学意义（均P<0.05）。第三部分:SAH早期,SAH+Saline组和SAH+Fingolimod组NK细胞、CD3+T细胞计数高于Sham组,SAH+Fingolimod组低于SAH+Saline组,差异具有统计学意义（均P<0.05）;SAH+Fingolimod组CD4+和Foxp3+T细胞计数高于SAH+Saline组,差异具有统计学意义（均P<0.05）;SAH+Fingolimod组IL-1β、TNF-α、NF-κB和TLR4表达均低于同时间点SAH组,SAH+Fingolimod组炎性因子或通路的蛋白表达与β-action蛋白的比例均低于同时间点SAH组比较,差异具有统计学意义（均P<0.05）;第3d、7d检测SAH+Fingolimod组脑组织水含量明显低于SAH+Saline组,差异有统计学意义（均P<0.05）;第3d、7d检测SAH+Fingolimod组脑组织EB含量明显低于SAH+Saline组,差异有统计学意义（均P<0.05）;自第3d起SAH+Fingolimod组mNSS评分明显低于SAH+Saline组,差异有统计学意义（P<0.05）;应用Morris水迷宫评价,SAH+Fingolimod组认知功能改善情况明显好于SAH+Saline组,获得性训练和对位性训练指标比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论SAH后发生的EBI是多种途径的病理生理变化,对脑组织的损伤非常严重,继而出现的CVS更是加重了脑损伤的程度。免疫炎症反应越来越得到关注与重视,直接影响预后,通过本实验可以初步判定免疫炎症变化是SAH早期脑损伤的重要因素,免疫细胞和炎症因子在脑损伤及修复过程中发挥了重要的作用。

关键词： 乙肝   基因型   免疫   细胞因子  

摘要： 目的:通过观察比较B、C基因型乙肝病毒感染HEK-293T细胞后分泌细胞因子产生的免疫炎症反应差异,作为B和C基因型乙肝病毒和临床病情是否相关的参考,从而对乙肝基因型与临床相关性的发生机制作补充,为临床治疗提供方向。方法:随机选取2015年1月至2015年9月至南昌市第九医院门诊和住院就诊的慢性乙型肝炎患者(HBV-DNA均为阳性)的血清标本254例。性别、年龄不限。并排除其他合并的疾病,且未进行性抗病毒治疗。诊断符合2015年中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会联合制订的慢性乙型肝炎防治指南。采用多对型特异性引物巢式PCR法鉴定并筛选出血清标本中的B、C两种基因型,随机选取B、C基因型15例。分别扩增B、C基因型血清标本中HBV病毒的s和c基因片段。采用克隆技术构建含有s和c基因片段表达绿色荧光蛋白的重组真核表达质粒,转染至HEK-293T细胞中,检测该细胞中IL-1β、TNF-α等的细胞因子分泌的水平。分析各组间的临床特征、IL-1β、TNF-α水平的差异。采用SPSS20.0软件进行统计学分析。P<0.05具有统计学意义。结果:转染B基因型的s片段细胞中IL-1β水平为(143.89±46.48)pg/ml、TNF-α水平为(7.97±1.03)pg/ml,c片段细胞中IL-1β水平为(253.62±65.12)pg/ml、TFN-α水平为(8.65±1.07)pg/ml;C基因型的s片段中IL-1β水平为(40.96±29.29)pg/ml,TNF-α水平为(4.22±0.56)pg/ml,c片段中IL-1β水平为(35.78±19.31)pg/ml,TNF-α水平为(3.39±0.33)pg/ml。结论:乙肝病毒B基因型中基因片段在体外HEK-293T中的免疫炎症介质表达量明显高于C基因型。这或许是一个与临床致病性不同有关的因素。能从某种程度上证实两种基因型在体外细胞免疫反应过程中的不同。这为我们提供了另一个慢性乙型肝炎的研究角度。

关键词： 精神分裂症   免疫及炎症反应   NLR   IL-6   CRP   HCY  

摘要： 目的:探讨免疫及炎症反应与精神分裂症的关系。方法:①根据国际疾病和相关健康问题统计分类第十版(ICD-10)选取从2016年3月至2016年12月在延边脑科医院住院的诊断为精神分裂症的患者,共收集84例,其中男性43例、女性41例。另选52例年龄相当的体检健康者为健康对照组,其中男性24例、女性28例。②用阳性与阴性症状量表(PANSS)评定精神分裂症患者精神症状。③搜集患者年龄、性别、婚姻状况、身高及体重等一般资料,计算BMI值。④取清晨空腹血(禁食12小时),采用全自动生化分析仪检测同型半胱氨酸(HCY)、C反应蛋白(CRP);用全自动血细胞分析仪及配套试剂盒质控品分类检验白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、血小板(PLT)、中性粒细胞百分比(NEU%)、淋巴细胞百分比(LYM%)、中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)等,并计算中性粒细胞-淋巴细胞比率(NLR);用酶联免疫吸附法(ELISA)测定白细胞介素-6(IL-6)浓度。⑤采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(x±SD)表示,进行独立样本的t检验,非正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)[M(P25,P75)]表示,进行Mann-WhitneyU检验;计数数据以百分率表示,进行χ2检验;IL-6与其相关因素的相关性采用Spearman相关分析,免疫和炎症因子对精神分裂症的影响采用多因素logistic回归分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:①精神分裂症组 NLR、HCY、IL-6 和 LYMPH%分别为 2.06±0.80、17.1(8.65,28.53)、61.42(21.42,111.96)、和 31.22±6.88,健康对照组分别为 1.71±0.57、11.20(8.03,15.98)、25.61(14.34,66.12)和 35.58±7.83,其差异有统计学意义(P值均<0.05);精神分裂症男性组NLR、IL-6和LYMPH%分别为2.01±0.83、61.96(19.35,128.01)和 31.56±7.42,健康对照男性组分别为 1.59±0.54、31.10(17.67,66.12)和37.13±8.04,其差异有统计学意义(P值均<0.05);精神分裂症女性组 NLR、IL-6 和 LYMPH%分别为 2.11±0.77、62.22(21.95,107.19)和30.86±6.34,健康对照女性组分别为 1.82±0.55、25.49(14.34,50.66)和 34.26±7.52,其差异有统计学意义(P值均<0.05)。②精神分裂症患者HCY与IL-6呈正相关关系,r值为0.423,其相关性有统计学意义(P<0.001)。③精神分裂症患者IL-6与PANSS总分和阴性症状均呈正相关关系,r值分别为0.777和0.861,其相关性均有统计学意义(P值均<0.001)。④多因素logistic回归分析结果显示,精神分裂症与IL-6和NLR均密切相关,其 OR 值分别为 1.039(95%CI:1.000～1.014,P<0.05)和 1.706(95%CI:1.146～3.869,P<0.05)。结论:精神分裂症患者的NLR、IL-6、HCY高于健康者,其中HCY与IL-6呈正相关,其可作为炎症因子在实验室检查或者化验结果支持临床进行诊断,作为诊断依据。IL-6浓度与与精神分裂症PANSS总分及阴性症状分呈正相关,说明其可作为辅助评价精神分裂症病情严重程度及阴性症状的一个生物标记物。NLR、IL-6为精神分裂症患病的影响因素。可以作为精神分裂症患病的预测因子,提高精神分裂症诊断的准确性。

关键词： 激动剂   紧密连接   肠上皮   二甲双胍   DSS   炎症状态   重激活  

摘要： 炎性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBD)主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。临床主要表现为体重减少,血便及腹部疼痛。炎性肠病不仅会严重影响病人的生活质量,而且久治不愈会大大增加患结肠癌的风险。因此,阐明肠炎发生发展过程中的分子靶标,寻找安全高效的治疗药物,对炎性肠病的治疗具有重要意义。本研究发现小鼠在溃疡性结肠炎发生后,肠组织中腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的磷酸化水平逐渐降低,与肠组织的损伤程度呈正相关。给予AMPK激动剂二甲双胍后,组织中的p-AMPK水平显著升高。我们进一步发现,二甲双胍能改善小鼠的溃疡性结肠炎,表现为明显逆转小鼠体重下降、腹泻、血便以及结肠病理评分和显著抑制结肠组织中炎性因子IL-18,IL-1β,COX-2,iNOS和IL-6的mRNA水平。不仅如此,我们发现AMPK激动剂二甲双胍对结肠炎的这一治疗功效与其对小鼠肠上皮紧密连接的维持作用是密不可分的。肠组织发生炎性损伤后,肠上皮紧密连接蛋白Claudin-1,Occludin和Zonula Occludens-1(ZO-1)的表达水平下降,肠上皮通透性增加;而二甲双胍能显著逆转这一病理变化。我们利用体外肠上皮Caco-2细胞模型对二甲双胍促进紧密连接功能的机制进行了进一步研究。我们还发现二甲双胍可能促进AMPK磷酸化水平升高,进而导致Connexin43(Cx43)蛋白在丝氨酸368位发生磷酸化;因而Cx43与膜蛋白ZO-1结合降低并进入胞浆,使细胞膜上的ZO-1形成更为稳定的紧密连接。综上,本论文实验结果证明二甲双胍对硫酸葡聚糖钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠急性肠炎有较好的治疗效果,其机制可能是通过促进AMPK磷酸化,从而升高p-Cx43(Ser368)水平,促进ZO-1形成紧密连接。这些发现揭示了在肠上皮的结构维持和功能中,能量平衡调控分子AMPK可能发挥了重要的作用。本研究为炎性肠病的治疗提供了新的药物靶标和候选药物。

关键词： miR-22   MAVS   poly(I:C)   I型干扰素   细胞因子  

摘要： miRN A通过碱基序列互补结合靶基因来降解靶基因mRNA或抑制其转录后翻译,是调节基因表达的关键分子。近年来研究表明miRNA不仅广泛参与细胞增殖分化、细胞凋亡、器官形成等生理进程,还在天然免疫及病毒感染过程中发挥重要的调控作用。病毒感染及天然免疫通路的激活会引起miRNA的表达发生变化,差异表达的miRNA进而又能调控天然免疫反应和病毒的感染。Poly(I:C)是双链RNA免疫刺激物,poly(I:C)刺激细胞能够被细胞的天然免疫受体识别,诱导产生I型干扰素和炎症细胞因子。本研究旨在以miR-22为研究对象,探索poly(I:C)和乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)刺激神经胶质细胞过程中miR-22的表达情况,以及在此过程中miR-22调控I型干扰素和炎症因子表达的分子机制。主要研究内容如下:***(I:C)诱导细胞内源性miR-22的上调表达Poly(I:C)处理的人神经胶质瘤细胞(U251)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),用荧光定量PCR检测细胞中miR-22的表达水平,发现miR-22的表达显著上调,且呈时间和剂量的依赖性。***-22负调控poly(I:C)诱导的I型干扰素和炎症因子的表达U251细胞过表达miR-22能够显著的抑制poly(I:C)诱导的I型干扰素和炎症因子的表达。相反,抑制内源性的miR-22后,能够显著的促进poly(I:C)在U251细胞上诱导的I型干扰素和炎症因子的表达。***-22靶向MAVS通过软件预测分析以及荧光素酶、荧光定量PCR、Western Blot等方法验证,证实了MAVS(Mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)是miR-22的一个直接靶标。miR-22通过与MAVS基因的3’UTR结合,抑制细胞内源性MAVS的表达。***-22通过靶向MAVS负调控poly(I:C)诱导的I型干扰素和炎症因子的表达过表达MAVS质粒可以恢复miR-22对poly(I:C)诱导的I型干扰素和炎性因子的抑制作用。沉默MAVS后显著的抑制poly(I:C)诱导到的I型干扰素和炎症因子的表达,与过表达miR-22是一致的效果。此外,miR-22通过靶向MAVS抑制其下游转录因子IRF3和NF-κB的激活。证明miR-22通过靶向MAVS负调控poly(I:C)诱导的I型干扰素和炎症因子的表达。***-22促进JEV在胶质细胞中的复制JEV感染U251细胞能够诱导miR-22的上调表达,且呈时间和剂量的依赖性。而在U251细胞过表达miR-22则可以促进JEV的增殖。相反,抑制内源性miR-22后,会抑制JEV在U251细胞上的增殖。本研究首次证明了miR-22在poly(I:C)刺激细胞过程中的重要作用,鉴定了miR-22的一个新靶标MAVS,揭示了miR-22调控I型干扰素和炎症因子表达的分子机制,为进一步阐明病毒诱导的神经炎症反应分子机制提供了一种新思路。

关键词： 不明原因复发性流产   母胎免疫耐受   强的松   IL-23/IL-17  

摘要： 研究目的:我们前期研究发现,不明原因复发性流产(Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion,URSA)患者外周血及蜕膜组织中Th17细胞及其相关细胞因子白介素-17(IL-17)、IL-23水平明显高于正常妊娠者。IL-17/IL-23作为经典的炎症轴,已被证实在自身免疫性疾病的病理过程中发挥重要的作用,从而成为相关免疫性疾病治疗的新靶点,而URSA被认为与母胎免疫失衡有关。强的松用于治疗反复胚胎移植失败和复发性流产取得一定疗效,但并未得到广泛认可。本研究以小鼠脾淋巴细胞为实验对象,通过体外细胞培养的方法,利用细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-23刺激淋巴细胞向Th17方向分化,诱导母胎免疫排斥反应的细胞模型,观察强的松对IL-17分泌的影响以及对IL-23/IL-17炎症轴的调节作用,探讨强的松治疗治疗反复胚胎移植失败和复发性流产可能的作用机制,为强的松治疗妊娠失败提供基础理论依据。研究方法:取昆明小鼠,分离脾脏淋巴细胞制成单细胞悬液,并以抗CD3抗体,抗CD28抗体刺激其体外增殖,MTT法检测不同浓度强的松对小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响。另取小鼠脾淋巴细胞分4组,对照组A组用空白培养液、B组用最佳稀释浓度的强的松含药培养液培养,两组细胞培养24h后,换含有TGF-β1、IL-6、IL-23的培养液继续培养48h;C、D组淋巴细胞培养体系中,先用含TGF-β1、IL-6、IL-23培养液培养48h后,C组改用最佳稀释浓度含药培养液,D组改用空白培养液继续培养24h。分别收集不同处理组细胞培养上清液,ELISA检测上清液中IL-17的含量;收集细胞采用Real-Time PCR检测IL-17m RNA、IL-23m RNA的表达水平。研究结果:在0.001μM强的松低浓度下,对小鼠脾淋巴细胞的增殖即出现抑制作用,并与浓度存在一定量效关系。浓度为在0.01-10μM时,对淋巴细胞增殖的抑制作用无差异(P>0.05),当浓度高于100μM时,淋巴细胞增殖受到明显抑制,并且随着浓度增大,抑制作用更加明显。ELISA检测显示,B组IL-17含量低于其他3组(P<0.01),C组IL-17含量低于A组,D组(P<0.01)。B组IL-17m RNA表达量低于A组降低(P<0.05),A、B两组IL-23m RNA表达量比较,差异无统计学差异意义;C组IL-17m RNA、IL-23m RNA表达量低于D组(P<0.05)。研究结论:强的松能够抑制淋巴细胞的增殖,当机体免疫系统失衡促炎因子高表达时,强的松能够抑制IL-17分泌,下调IL-17、IL-23促炎因子基因的表达水平,减弱免疫排斥反应,可能是其治疗相关免疫性疾病的作用机制之一,该结果为强的松治疗由IL-23/IL-17介导的母胎免疫炎症反应提供了一定的理论依据。

关键词： IL-32   TSLP   角膜上皮   caspase-1   NF-κB  

摘要： 目的:探讨白介素-32(Interleukin-32,IL-32)和胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)在人角膜上皮细胞炎症反应中的作用及调控机制。方法:(1)不同浓度(2、10、50ng/ml)的IL-32刺激人角膜上皮细胞,应用荧光定量PCR和ELISA检测HCECs中TSLP、IL-6、TNFαm RNA和蛋白的表达变化,同时用免疫组化技术定位TSLP蛋白在人角膜上皮组织中的表达;(2)应用Western blot检测上述各组角膜上皮细胞中caspase-1的活性,加入caspase-1抑制剂VX-765后分别应用Western blot、荧光定量PCR和ELISA检测caspase-1活性、TSLP m RNA和蛋白水平的表达变化;(3)用同种型Ig G抗体(5μg/m L)、TSLP抗体(5μg/m L)、NF-k B抑制剂喹唑啉(NF-k B-I,10μM)以及caspase-1抑制剂VX-765预处理人角膜上皮细胞1小时,然后用IL-32(10ng/m L)刺激HCECs4小时后应用荧光定量PCR检测IL-6和TNFαm RNA水平的表达,刺激48小时后用ELISA检测IL-6和TNFα蛋白水平的表达。结果:(1)IL-32刺激人角膜上皮细胞后可引起TSLP、IL-6、TNFαm RNA和蛋白水平表达升高,呈一定的时间和浓度依赖性,差异有统计学意义(p<0.05),TSLP蛋白在未经处理的角膜组织细胞质中表达,而在经IL-32(50 ng/ml)处理48小时后的供体角膜上皮组织中,TSLP在角膜各层中的表达均显著增强;(2)IL-32促进caspase-1的活化,并且具有浓度依赖性,加入caspase-1抑制剂后,caspase-1的活性明显受到抑制,TSLP m RNA和蛋白水平的表达也明显减少,差异有统计学意义(p<0.05);(3)TSLP抗体、NF-κB抑制剂喹唑啉和caspase-1抑制剂VX-765能够显著抑制IL-32介导的促炎因子(TNFα和IL-6)m RNA和蛋白的表达,而同种型Ig G抗体对TNFα和IL-6的表达无明显的抑制作用,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:IL-32和TSLP是参与人类角膜上皮炎症反应的重要的细胞因子,IL-32通过caspase-1信号通路上调TSLP的表达;IL-32通过caspase-1/TSLP/NF-κB信号通路介导角膜上皮的炎症反应。