关键词：
奶牛瘤胃上皮细胞
胞壁酰二肽
NOD2
炎症反应
摘要：
近年来,在奶牛养殖过程中,为了提高产奶量,绝大多数牧场都会使用以谷物淀粉为主的高精料日粮来喂奶牛,虽然在短期内获得了经济效益,但是大量研究表明,长期饲喂奶牛高精料日粮,会造成瘤胃内大量碳水化合物异常发酵,产生大量挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid,VFA),从而导致瘤胃pH下降损伤瘤胃上皮,甚至引发奶牛产生亚急性瘤胃酸中毒(Subacute ruminal acidosis,SARA)。奶牛在SARA状态下,瘤胃内革兰氏阴性菌大量死亡崩解,释放出有害产物如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、.脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)以及胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide,MDP)等。目前的研究表明,细菌死亡后的产物可以诱导奶牛产生炎症反应,但这些研究多集中于LPS以及LTA的作用,少有关于MDP作用的报道。然而已有报道发现,几乎所有细菌在增殖以及死亡裂解过程中都能产生MDP。我们的前期研究表明,MDP可以诱导奶牛瘤胃上皮细胞(Bovine rumen epithelial-cells,BRECs)产生炎症反应。因此研究MDP如何诱导奶牛瘤胃上皮炎症反应及其调控机制,对我国的养殖业具有重要意义。与此同时,已有研究表明当MDP被吸收进入机体后可以与核苷酸结合寡聚化结构域蛋白 2(Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2,NOD2)相结合,从而引发一系列级联反应,最终诱导炎症产生。综上所述,我们假设,NOD2能够介导MDP调控BRECs的炎症反应。因此,本研究的目的是探究MDP是否能够通过NOD2调控BRECs的炎症反应,为探明奶牛SARA状态下瘤胃上皮炎症的发生机制提供理论依据。试验一高低精料日粮对奶牛瘤胃液中MDP含量的影响本试验旨在通过建立MDP的检测方法,检测奶牛瘤胃液中MDP的含量并且研究高精料日粮对奶牛瘤胃液中MDP含量的影响。试验分两期进行,分别饲喂低精料和高精料日粮,通过瘤胃瘘管采集瘤胃液,测定瘤胃发酵参数。通过薄层层析(TLC)及高效液相色谱串联蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)建立瘤胃液中MDP的检测方法。结果表明,奶牛采食高精料日粮后3h至6h,瘤胃pH均低于5.6,表明奶牛处于SARA状态。并且与低精料组相比,高精料组乙酸、丙酸、丁酸、戊酸以及总挥发性脂肪酸含量显著升高(P<0.05)。通过外标法计算得到MDP含量的线性回归方程:y=1.0711x+3.2201,R2=0.9943,检测浓度在50-1000 μg/mL范围内具有良好的线性关系,且MDP检测限和定量限分别为70 ng和210ng。通过检测发现,高精料日粮能显著提高瘤胃液中MDP的含量(P=0.005)。试验二不同浓度MDP及处理时间对BRECs炎症反应的影响本试验旨在通过添加不同浓度MDP以及不同MDP处理时间培养BRECs,通过qRT-PCR检测细胞中炎症相关基因表达量,来明确BRECs产生炎症反应时与MDP的浓度以及反应时间的关系。时间梯度试验,试验分5组,每组6个重复,同时向各组BRECs中添加10 μg/mL MDP,分别培养1 h、3 h、6 h、12 h和24 h后收集细胞提取总RNA。浓度梯度试验,试验分5组,每组6个重复,向各组BRECs中分别添加0μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 和 15 μg/mL MDP,培养 3 h 后收集细胞提取总RNA。结果表明,与其它时间处理组相比,MDP处理BRECs 3 h,能够显著提高促炎症因子 IL-6、IL-8、TNF-α,趋化因子 CCL2、CXCL2、CXCL3、CXCL5 以及 NOD1、RIPK2、IRAK4 mRNA表达量(P<0.05)。MDP处理6h能显著提高BRECs促炎症因子 IL-1β,趋化因子 CCL5、CCL20、CCL28、CXCL8 以及 NOD1、RIPK2、IRAK4 mRNA表达量(P<0.05)。与其它浓度处理组相比,10 μg/mL MDP能够显著提高BRECs 促炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β,趋化因子 CC L20、CCL28、CXCL2、CXCL3、CXCL8 以及 NOD2、RIPK2、IRAK4 和 IRF1 mRNA 表达量(P<0.05)。综上,MDP浓度为10 μg/mL,处理时间为3 h或6 h时BRECs炎症反应效果最显著。试验三转录组分析MDP诱导BRECs后mRNA差异基因和差异信号通路本试验旨在利用转录组测序技术来研究野生型BRECs与MDP刺激后的BRECs之间存在的mRNA差异基因和差异信号通路。试验分两组,野生型BRECs
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