关键词：
肺腺癌
巨噬细胞
肿瘤细胞
炎症反应
HMGB1
摘要：
目的:肺癌是目前世界上患病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一。近几年,免疫检查点分子程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD-1）及其细胞程序性死亡-配体1（Programmed cell death protein 1,PD-L1）抑制剂在肿瘤治疗中取得重大突破,与化疗相比显著提高非小细胞肺癌患者生存率。但是长期给予anti-PD-1免疫制剂治疗会出现继发耐药,严重影响治疗效果。大量临床和实验研究发现肿瘤患者给予anti-PD-1上调肿瘤患者CD8+T细胞其它免疫检查点分子如T细胞免疫球蛋白-3（T cell immunoglobulin-3,TIM-3）表达,提示anti-PD-1上调TIM-3可能是影响其治疗效果的重要因素。有研究报道肿瘤细胞分泌高迁移率族蛋白1（High-mobility group box1,HMGB1）可以通过TIM-3诱导浸润的树突状细胞发挥免疫抑制功能。HMGB1作为TIM-3的配体,可以与CD8+T细胞表面TIM-3结合,可能抑制T细胞功能。
在吸烟诱导的肺组织炎症反应模型中,外源性分泌型HMGB1利用Toll样受体4（Toll Like Receptor 4,TLR4）激活NF-κB通路来介导肺组织炎症反应。我们团队研究发现,黄曲霉毒素通过诱导肺组织炎症反应促进肺泡上皮细胞损伤,进而参与肺腺癌发生。在此过程中,炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）依赖炎症反应上调HMGB1表达可以保护肺泡上皮细胞免受DNA损伤,提示HMGB1在肺组织中通过细胞内表达和细胞外分泌与炎症反应密切相关。我们前期研究也发现了肺腺癌炎症微环境中TNF-α可以调控HMGB1的表达和分泌。但肺腺癌组织中HMGB1作为分泌型炎症细胞因子是否上调淋巴细胞免疫检查点分子TIM-3,进而影响anti-PD-1免疫治疗效果还不清楚。
本实验采用了乌拉坦诱导小鼠肺腺癌自发肿瘤模型中,探讨TNF-α依赖炎症反应调控HMGB1对anti-PD-1免疫治疗的影响。本研究预提示通过TNF-α依赖炎症反应上调HMGB1诱导T细胞表达TIM-3等免疫检查点分子影响anti-PD-1耐药机制,进而阐明anti-TNF-α/HMGB1联合治疗改善anti-PD-1肺腺癌耐药免疫治疗新策略。
方法:
1.采取乌拉坦诱导肺腺癌自发肿瘤的小鼠模型:实验小鼠按照体重1g/kg的剂量,通过腹腔注射乌拉坦溶液200μl,每周1次连续注射8周,停止注射。小鼠继续饲养5个月后,分3组分别腹腔注射TNF-α受体抗体（益赛普）,anti-mouse PD-1,TNF-α受体抗体（益赛普）+anti-mouse PD-1,每周3次,连续腹腔注射4周后处死动物,通过肿瘤计数,采用反转录聚合酶链反应Real-time PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）,HE染色,免疫组织化学方法探讨在肿瘤治疗中肺肿瘤负荷以及TNF-α炎症通路对HMGB1和TIM-3的影响。
2.采用乌拉坦诱导肺腺癌自发肿瘤小鼠模型:实验小鼠按照体重1g/kg的剂量,通过腹腔注射乌拉坦溶液200μl,每周1次连续腹腔注射8周。两周后,分3组分别腹腔注射HMGB1阻断剂:甘草酸（Glycyrrhizin,Gly）,Box-A,Gly+Box-A,每周3次,连续腹腔注射3周。小鼠继续饲养19周后处死动物,观察肿瘤个数或负荷的改变情况,探讨anti-HMGB1对乌拉坦诱导小鼠肺腺癌肿瘤发生的影响。
3.体外分离培养小鼠脾CD4+T细胞,给予不同细胞因子HMGB1、TNF-α和TGF-β等刺激,采用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）方法检测CD4+T细胞上TIM-3、LAG-3和PD-1等免疫检查点分子表达情况,探讨HMGB1、TNF-α和TGF-β对CD4+T细胞上TIM-3、LAG-3和PD-1等免疫检查点分子表达的影响。
结果:
***-PD-1上调TNF-α和HMGB1影响其对肺腺癌肿瘤发生的抑制作用
乌拉坦诱导小鼠肺腺癌发生中,给予anti-PD-1处理后,部分肿瘤发生继发性耐药,小鼠肺腺癌的肿瘤负荷没有变化,但是其细胞因子TNF-α和HMGB1的表达高于anti-PD-1敏感组,提示:anti-PD-1抑制肺腺癌发生继发性耐药与微环境TNF-α和HMGB1高表达密切相关。
***-α参与小鼠肺腺癌anti-PD-1免疫治疗的继发性耐药
在通过乌拉坦诱导肺腺癌自发肿瘤的模型中,单独给anti-PD-1对肿瘤负荷没有影响,但是给予anti-PD-1和anti-TNF-α联合治疗,明显减少肺组织表面肿瘤
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