关键词： 帕立骨化醇   维持性血液透析   继发性甲状旁腺功能亢进   微炎症   贫血  

摘要： 目的:探讨帕立骨化醇对维持性血液透析(Maintenance hemodialysis,MHD)伴继发性甲状旁腺功能亢进(Secondary hyperparathyroidism,SHPT)患者微炎症状态及肾性贫血的影响。方法:选择2021年12月至2022年6月在新疆医科大学第一附属医院门诊规律长期透析且合并SHPT患者76例,采用单中心、前瞻性队列研究,收集患者使用帕立骨化醇前的一般资料和全段甲状旁腺激素(intact parathyroid hormone,i PTH)、血清校正钙(serum corrected calcium,c Ca)、P、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、ALB、Scr、BUN、血尿酸、血清胱抑素C、CRP、中性粒细胞/淋巴细胞比值(Neutrophil/Lymphocyte ratio,NLR)、淋巴细胞/单核细胞比值(Lymphocyte/Monocyte ratio,LMR)、Hb、Fe、血清铁蛋白(Serum ferritin,SF)、总铁结合力(Total iron binding capacity,TIBC)等指标作为基线资料,给予帕立骨化醇治疗,观察6个月,分别于第3个月、第6个月检测上述指标,同时记录促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)用量,比较用药前后各指标差异,进而调整药物剂量,最终完成随访47例。本研究主要疗效指标为:治疗6个月i PTH水平较治疗前下降幅度超过30%的患者比例。次要疗效指标为:治疗6个月i PTH水平降至130～585pg/ml范围内的患者占比。另收集患者治疗前3月及治疗前6月钙磷、i PTH等指标,求得差值,以及计算治疗后6月内相关指标与基线的差值,比较治疗前后患者钙磷、Hb等指标的动态变化。采用SPSS26.0软件对所得数据进行统计分析。结果:(1)i PTH达标情况:患者治疗后3、6个月的i PTH水平较治疗前显著下降(P<0.05),ALP、ALB的变化无统计学意义(P>0.05),Ca、P、钙磷乘积(Ca×P)水平相对稳定。29例患者的i PTH水平较治疗前下降程度大于30%,比例为61.7%。此外,治疗6月后i PTH水平符合2017年KDIGO指南标准(130～585pg/m1)的患者有41例,比例为87.2%。(2)微炎症状态:同治疗前比较,患者在治疗3、6个月后,CRP较基线均下降(P<0.05)。(3)贫血:同治疗前相比,治疗6月后,Hb呈上升趋势(P<0.05),EPO周使用剂量较治疗前下降,但组间对比无统计学差异(P>0.05)。(4)帕立骨化醇治疗前后钙磷代谢、贫血、炎症等相关指标变化比较:给予帕立骨化醇治疗前6月内i PTH、ALP、CRP在治疗前呈增长趋势,治疗后呈下降趋势,Ca、Fe、SF在用药前呈下降趋势,用药后呈增长趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗前6月内与治疗后6月内Hb、TIBC、P的变化均无统计学意义(P>0.05)。结论:利用帕立骨化醇治疗血液透析患者的SHPT,可以降低i PTH水平,维持体内钙磷代谢平衡,有效改善患者病情。同时,在应用帕立骨化醇过程中,可显著改善患者的微炎症状态及肾性贫血。

关键词： 牙龈卟啉单胞菌   脂多糖   人牙龈成纤维细胞   炎症   成骨分化  

摘要： 目的:探究低浓度牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg LPS)刺激对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)成骨分化能力的影响,为牙周治疗提供新思路。方法:经患者知情同意,收集需要拔除埋伏阻生第三磨牙患者的健康牙龈,采用组织块法体外分离培养HGFs,进行细胞形态学观察,用克隆法、流式细胞术、免疫荧光实验、碱性磷酸酶(alkaline Phosphatase,ALP)染色、茜素红染色(alizarin red staining,ARS)及油红O染色实验鉴定HGFs干细胞特性,采用CCK-8实验检测不同浓度(0、0.1、1、5μg/ml)牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下对HGFs成骨诱导分化后细胞增殖能力的影响,通过实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测不同浓度(0、0.1、1、5μg/ml)Pg LPS干预下成骨诱导培养基培养的HGFs在7、14、21天时的炎症因子白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)、趋化因子配体2(chemokine CC-motif ligand 2,CCL2)和成骨基因ALP、I型胶原蛋白(collagen type I,COL1)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor2,RUNX2)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)m RNA的表达水平,采用ALP及ARS染色实验分别于7、28天进行染色,通过Western Blot实验检测成骨诱导至第21天时RUNX2、OCN的蛋白表达变化。结果:流式细胞术和免疫荧光实验显示HGFs阳性表达干细胞表面标志物CD44、CD105,HGFs体外培养克隆形成率为21.33±1.25%;成骨分化7天ALP染色呈现大量蓝紫色沉淀;成骨分化28天ARS染色显示大量红染钙结节;成脂分化21天油红O染色有大量红色脂滴。成骨诱导0-7天中不同浓度Pg LPS刺激对HGFs的增殖能力无明显影响(P>0.05)。炎症因子IL-8、CCL2 m RNA表达水平出现Pg LPS刺激时间和浓度依赖性。Pg LPS刺激促进成骨诱导7、14、21天时ALP、COL1、RUNX2、OCN m RNA水平升高,其中1μg/ml Pg LPS刺激下成骨基因表达最高,而当Pg LPS浓度升高到5μg/ml时,成骨基因m RNA水平呈现下降趋势;成骨诱导21天时Pg LPS促进RUNX2和OCN的蛋白表达,RUNX2的蛋白表达呈现浓度依赖性,但1μg/ml和5μg/ml Pg LPS组之间OCN蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组(无Pg LPS刺激)相比,成骨诱导7天ALP染色强度在各组间无明显差异,而成骨诱导28天ARS染色强度在低浓度Pg LPS(0.1、1、5μg/ml)刺激后增强,但在5μg/ml Pg LPS刺激后有所下降。结论:HGFs具有干细胞特性和多向分化潜能;低浓度Pg LPS对HGFs的细胞增殖能力无影响;低浓度Pg LPS导致的低度炎症状态促进HGFs的成骨分化。

关键词： 肾结石   经皮肾镜取石术   全身炎症反应综合征   临床特征   危险因素  

摘要： 【研究背景】泌尿系结石是泌尿外科中常见的疾病之一。尽管国内外围绕泌尿系结石预防及治疗,开展了大量的基础及临床研究,但其患病率与复发率仍居高不下。目前,欧美国家泌尿系结石总体患病率为1%～20%,我国泌尿系结石患病率为1.5%～18%。近年来,泌尿系结石发病率逐渐上升,5～10年复发率可高达50%。泌尿系结石可给患者带来疼痛、血尿、发热等不适症状,部分患者因尿路梗阻可出现无功能肾等严重后果。针对不同的结石类型、位置及大小,泌尿系结石有不同的治疗方式。经皮肾镜取石术(PCNL)是大负荷、上尿路结石的首选治疗方式。与传统开放手术、腹腔镜手术等手术方式相比,PCNL具有结石清除率高、创伤小等优点,因此得到了广泛的应用及推广。然而,PCNL也会带来出血、感染、器官损伤及外渗等不可忽视的术后并发症,尤其是术后感染的发生,严重时可危及患者生命。根据病情的严重程度,术后感染分为术后发热、全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休克等。SIRS是PCNL最常见的术后感染并发症之一,如能早期识别并对其进行干预,可有效阻止术后感染的进展,改善患者预后。若未能及时干预,SIRS可进展为尿源性脓毒血症。由于尿源性脓毒血症相对其他来源的脓毒血症(如脑部、皮肤、胆道等)进展快,重症率及致死率高,给患者的生命健康带来巨大威胁,也给手术医生带来心理负担和严峻的挑战。因此,分析PCNL术后发生SIRS的临床特征与危险因素,有利于早期对术后感染进行识别并采取干预措施,对预防PCNL术后SIRS发生,控制病情进展,改善患者预后,具有重要临床意义。【目的】分析经皮肾镜取石术(PCNL)后并发全身炎症反应综合征(SIRS)患者的临床特征与危险因素,建立预测PCNL术后发生SIRS的Logistic回归模型。【方法】回顾性分析了2016年9月至2018年9月在广州医科大学附属第一医院泌尿外科行一期PCNL手术患者的临床资料,根据术后是否出现SIRS,将所有患者分为SIRS组和非SIRS组。首先对两组患者的基线资料、围手术期变量等进行单因素分析,然后将有统计学差异的变量纳入多因素Logistic回归分析,筛选PCNL术后SIRS的独立危险因素,根据结果建立预测PCNL术后发生SIRS的Logistic回归模型,通过AUC面积对模型及单个独立危险因素的预测性能进行检验、比较。【结果】1、共纳入1060例患者,SIRS组患者149例(14.1%),非SIRS组患者911例(85.9%)。其中SIRS组患者中22例(2.1%)进展为尿源性脓毒血症,4例(0.4%)进展为脓毒性休克,无死亡病例。2、单因素分析结果显示,与非SIRS组患者比较,SIRS组患者女性比例更高(55.0%vs 40.0%,P=0.001),术前血白细胞升高患者比例更高(15.4%vs 9.2%,P=0.020),术前血红蛋白更低[128.0(111.5,143.5)g/L vs 137.0(122.0,150.0)g/L,P<0.001],术前尿白细胞计数更多[“-”:34.9%vs 69.2%;“+”:16.1%vs 11.5%;“++”:22.8%vs 10.0%;“+++”:20.1%vs 7.4%;“++++”:6.0%vs 2.0%,p<0.001],术前尿亚硝酸盐阳性率更高(47.7%vs 13.5%,P<0.001),术前尿培养阳性率(55.0%vs 15.3%,P<0.001)更高,穿刺通道数量更多[“1”:82.3%vs 90.8%;“2”:13.4%vs 7.2%;“3”:3.4%vs 1.5%;“4”:0.0%vs 0.3%;“5”:0.7%vs 0.1%,P=0.002],术后输血率更高(4.7%vs 0.7%,P<0.001),术后血红蛋白更低[114.0(97.5,131.5)g/L vs 126.0(111.0,138.0)g/L,P<0.001],结石负荷更大[4.0(3.0,5.5)cm vs 3.8(2.6,5.5)cm,P<0.001],结石培养阳性率更高(71.8%vs 25.5%,P<0.001),感染性结石患者比例更高(38.9%vs 19.5%,P<0.001)。3、多因素Logistic回归分析结果显示,术前血白细胞升高(OR=1.792,95%CI=1.030～3.120,P=0.039)、术前尿培养阳性(OR=3.385,95%CI=2.196～5.216,P<0.001)、术后输血(OR=9.239,95%CI=2.639～32.348,P=0.001)、结石培养阳性(OR=3.907,95%CI=2.501～6.105,P<0.001)、感染性结石(OR=1.570,95%CI=1.036～2.380,P=0.034)是PCNL术后出现SIRS

关键词： 动脉粥样硬化   肝脏   线粒体自噬   炎症   益脉颗粒  

摘要： 目的:采用高脂喂养的方法,使用APOE基因敲除(Apo E-/-)小鼠建立动脉粥样硬化(AS)模型,观察高脂喂养对于Apo E-/-小鼠肝脏的影响,探究高脂喂养影响Apo E-/-小鼠肝脏线粒体自噬与炎症的分子机制;观察益脉颗粒对AS小鼠脂质代谢紊乱的影响;探究益脉颗粒调控AS小鼠肝脏线粒体自噬与炎症的分子机制。材料与方法:选取SPF级C57/BL小鼠32只和Apo E-/-小鼠56只,使用普通饲料适应性喂养一周后,Apo E-/-小鼠改为高脂饲料喂养,自由饮食饮水。分别于4周、8周各取C57/BL小鼠10只作为control组,Apo E-/-小鼠10只作为model组,摘取眼球取血后断脊处死,留取血清及肝脏。8周后采用随机数字表法将剩余Apo E-/-小鼠分为模型组,益脉颗粒组及阿托伐他汀组,C57/BL小鼠作为空白对照组。按照成人推荐给药剂量,根据小鼠与人的等效剂量换算公式,计算出小鼠给药量如下:(1)control组及model组给予等体积0.9%生理盐水(2)YMKL组给予19.474g/kg浓缩药液;(3)Atorvastatin组给予10mg/kg浓缩药液,空白对照组及模型组给予等体积0.9%生理盐水,每日一次,灌胃给药,持续4周。4周后采用摘眼球取血法,取血清后断脊处死,分离小鼠主动脉及肝脏。采用全自动生化分析仪检测高脂喂养条件下,不同时间点各组AS小鼠血脂变化情况;采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测高脂喂养条件下,不同时间点各组AS小鼠血清IL-1β变化情况;采用蛋白免疫印迹法(westernbloting法)检测不同时间点AS小鼠肝脏炎症及线粒体自噬相关蛋白表达情况;采用主动脉HE染色,观测12周各组小鼠主动脉斑块状况;采用肝脏HE染色,观察12周各组小鼠肝脏病理形态;采用油红O染色,观察12周各组小鼠肝脏脂质代谢情况;采用免疫组化法检测12周各组AS小鼠肝脏炎症及线粒体自噬相关蛋白表达情况。结果:1、探究高脂喂养影响Apo E-/-小鼠肝脏线粒体自噬及炎症的分子机制:(1)血脂四项水平结果显示:各时间点model组LDL-C、TG、TC水平均高于control组,HDL-C水平均低于control组(P<0.05);不同时间点model组LDL-C及TG随时间增加呈上升趋势,HDL-C随时间增加呈下降趋势,TG随时间增加,呈先上升再下降趋势;(2)血清炎症因子水平结果显示:各时间点model组IL-1β含量均高于control组(P<0.01),不同时间点model组比较,IL-1β总体呈上升趋势,4周与8周以及4周与12周model组对比均有显著差异(P<0.05);(3)检测炎症相关蛋白结果显示:各时间点model组NLRP3、p NF-κB/NF-κB、caspase-1蛋白表达量均高于control组(P<0.05),不同时间点model组比较,NLRP3、p NF-κB/NF-κB、caspase-1蛋白表达量总体呈上升趋势(P<0.05);(4)检测线粒体自噬相关蛋白结果显示:各时间点model组p62蛋白表达量均高于control组(P<0.05),4周时,PINK1及LC3B蛋白表达量均高于control组(P<0.05),8周及12周时,PINK1及LC3B蛋白表达量均低于control组(P<0.05);不同时间点model组比较,p62蛋白表达量总体呈上升趋势(P<0.05);PINK1蛋白表达量总体呈下降趋势(P<0.05),LC3B蛋白表达量总体呈先上升在下降趋势,组间比较存在统计学差异(P<0.05)。2、益脉颗粒通过NF-κB/p62信号通路调控AS小鼠肝脏线粒体自噬及炎症的分子机制:(1)主动脉形态学检测结果显示:与control组相比,model组主动脉管腔内可见明显粥样斑块,细胞排列紊乱,可见明显平滑肌细胞迁移泡沫细胞及脂质沉积;与model相比较,YMKL组主动脉管腔内可见斑块缩小,细胞排列紊乱,可见明显脂质沉积及泡沫细胞;Atorvastatin组可见斑块显著减小。(2)肝脏形态学检测结果显示:与control组相比model组肝脏细胞有明显肿胀,细胞质内可见明显脂肪空泡;与model组相比,YMKL组小鼠肝脏细胞质内脂肪空泡减少,细胞肿胀程度减轻;Atorvastatin组脂肪变性程度显著减轻,脂肪空泡显著减少,细胞体积基本接近正常。(3)肝脏脂质代谢检测结果显示:与control组比较,model组小鼠肝脏脂质沉积明显,肝细胞排列紊乱,镜下视野内可见弥漫性脂滴分布;YMKL组及Atorvastatin组肝脏脂质沉积减少,细胞肿胀减轻,肝脏细胞内脂滴含量有所减少;(4)肝脏组织线粒体自噬及炎症相关蛋白表达情况检测结果显示:与control组比较,model组N

关键词： 糖尿病肾病   lncMCS   Hmgb1   NF-κB   单细胞核RNA测序  

摘要： 目的:糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)是终末期肾病(End-stage kidney Disease,ESRD)和慢性肾病的常见原因,严重影响人类健康。肾小球系膜细胞(Mesangial cells,MCs)是一类反应活跃的肾脏固有细胞,占肾小球细胞总数的30～40%,且肾小球系膜异常增生是DKD早期的主要病理特征之一。深入探讨DKD状态下的肾小球系膜细胞的病理机制,寻找新的诊断标志物和治疗靶点将会给临床诊断和防治DKD带来重大意义。因此,我们探索了DKD MCs的特定分子生物学行为,并通过单细胞核RNA测序(Single-nucleus RNA sequencing,sn RNA-seq)解释了DKD状态下MCs异常增殖的新机制。通过sn RNA-seq发现:lnc MCS在MCs中特异性高表达且在DKD中表达上调。本研究的目的是验证lnc MCS在高糖状态下的系膜细胞中特异性高表达以及探索其生物学功能的调控作用,并阐明lnc MCS是通过何种机制参与DKD的发生发展,为DKD的诊断或者治疗靶点提供科学依据。方法:首先通过sn RNA-seq技术分析并筛选出4个候选lnc RNAs,是MCs中特异性lnc RNA且与DKD密切相关。接着通过q RT-PCR在肾脏固有细胞MCs、足细胞和肾小管上皮细胞和高低糖培养的MCs中检测发现E130307A14Rik在MCs中特异表达且在H-MC中表达差异最显著;因此我们将E130307A14Rik命名为lnc MCS(系膜细胞特异性lnc RNA)并选择lnc MCS作为本课题的研究对象。紧接着,通过核质分离q RT-PCR和FISH方法检测lnc MCS在MCs的核质分布。第二,为了探讨lnc MCS在DKD中的临床价值,通过q RT-PCR检测lnc MCS在DKD小鼠肾脏组织中以及lnc MCS的人源类似物在DKD患者血浆中的表达水平,并通过皮尔逊相关系数分析lnc MCS与DKD相关肾功能指标的相关性。第三,为了探索lnc MCS在DKD MCs中的生物学功能,我们构建了pc DNA3.1(+)-lnc MCS过表达质粒和设计合成了lnc MCS的3条si RNAs并通过CCK-8,Ed U,流式细胞周期检测技术以及western blot检测lnc MCS对MCs增殖活性的调控作用;通过q RT-PCR,western blot和IF检测lnc MCS对MCs炎症和纤维化的调控作用。第四,为了探讨lnc MCS的生成机制,通过q RT-PCR,Ch IP和双荧光素酶实验验证转录因子NF-κB p65是否可以和lnc MCS的启动子区域相结合并调控lnc MCS的表达水平。第五,为了探究lnc MCS调控MCs增殖、炎症和纤维化的具体机制,通过RNA-pull down和RIP发现lnc MCS与高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box 1,Hmgb1)相互结合。第六,为了探讨lnc MCS促进Hmgb1核质易位,通过核质分离western blot和FISH-IF来检测Hmgb1在MCs中细胞质和细胞核的表达水平以及分布情况是否由lnc MCS所调控。第七,为了明确lnc MCS如何通过调控Hmgb1而激活NF-κB信号通路,通过Co IP和western blot实验,检测Hmgb1与IκBα相互结合和NF-κB信号通路的关键分子蛋白表达情况。最后,我们构建敲低lnc MCS的慢病毒并通过尾静脉向DKD db/db小鼠注射,并通过小鼠以及脏器活体成像,q RT-PCR和FISH确认敲低lnc MCS的慢病毒成功感染肾脏并敲低体内肾脏组织中lnc MCS的表达水平。然后通过q RT-PCR,western blot和组织免疫荧光等实验探讨lnc MCS/Hmgb1/NF-κB轴在DKD小鼠体内对肾脏组织的增殖、炎症和纤维化。结果:第一,由sn RNA-seq检测发现Lnc MCS是系膜细胞特异性表达分子且在DKD系膜细胞集群中表达上调。随后通过q RT-PCR在肾脏固有细胞系膜细胞、足细胞和肾小管上皮细胞和L-MC或H-MC中检测,发现lnc MCS(E130307A14Rik)在MCs中特异高表达,且在H-MC中表达差异倍数最显著。第二,lnc MCS在MCs的细胞质和细胞核中均有表达但主要分布在细胞质中。第三,lnc MCS在DKD中表达上调,且与DKD相关肾功能指标呈正相关。第四,过表达的lnc MCS促进MCs增殖,炎症和纤维化,反之亦然。第五,Ch IP和双荧光素酶实验结果表明,转录因子NF-κB p65可以和lnc MCS的启动子区域结合;且过表达p65可以上调lnc MCS在MCs的表达,相反敲低p6

关键词： 全身炎症反应指数   纤维蛋白原与白蛋白比值   肾癌   预后  

摘要： 目的:研究外周血中全身炎症反应指数(SIRI)及纤维蛋白原与白蛋白比值(FAR)对肾恶性肿瘤患者临床及病理特征的影响,将两者及其联合重新分组,探索与肾癌预后的价值。 方法:选取2013年1月至2018年11月在重庆医科大学附属第一医院泌尿外科进行肾癌手术治疗且病理确诊为肾恶性肿瘤的患者临床资料及随访数据。利用回顾性分析方法分析最终纳入的200例患者的临床数据。利用SPSS26.0统计软件对纳入患者的临床资料进行分析,利用ROC曲线确定术前外周血中SIRI及FAR的最佳截点值,分别为1.30;0.10。T分期,高截点评分、高SIRI、高FAR与预后OS显著相关(p<0.05),是影响肾癌术后患者预后的危险因素;而高血压,糖尿病,性别,体质指数等与OS无关(P>0.05); 结果:肾癌患者是否是肾透明细胞癌,T分期,截点评分、SIRI、FAR与预后OS显著相关(p>0.05),是影响肾癌术后患者预后的危险因素;而高血压,糖尿病,性别,体质指数等与OS无关(P大于0.05),进行Cox回归多因素分析,统计分析结果显示,在FAR,SIRI,截点评分中,只有FAR是肾癌患者OS的独立危险因素(p=0.004,HR-7.94(95CI:0.97-32.05)。结论:高纤维蛋白原与白蛋白比值是肾癌预后不良的危险因素,与全身炎症反应指数相比价值更高。

关键词： 急性胰腺炎   NLR   PLR   MLR   SIRI  

摘要： 目的:回顾性分析急性胰腺炎(Acute Pancreatitis,AP)患者中性粒细胞与淋巴细胞比值(Neutrophil to lymphocyte ratio,NLR)、单核细胞与淋巴细胞比值(Monocyte-lymphocyte ratio,MLR)、血小板计数与淋巴细胞比值(Platelet count/Lymphocytes ratio,PLR)、及全身炎症反应指数SIRI四项指标水平,研究其与AP患者病情严重程度之间的关系,以评估其对于AP分级的早期预测价值,为临床诊疗提供参考。方法:收集2020年1月至2022年9月在大连医科大学附属第二医院确诊为急性胰腺炎的患者资料,选择在发病72 h内入院且满足排除纳入标准的患者共111例,根据《中国急性胰腺炎诊治指南(2021)》中,将患者分为轻症(MAP)组84例,中度重症及重症(MSAP+SAP)组27例。比较两组患者在年龄、性别、住院时间等一般资料的差异,以及入院24 h内血常规、生化等相关指标:脂肪酶(LIP)、淀粉酶(AMY)、单核细胞计数(M)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBil)、血肌酐(Crea)等,比较两组间是否存在差异;使用Spearman相关性分析探讨NLR、MLR、PLR、SIRI与是否需要ICU治疗的相关性;选择两组间具有统计学差异的血清学指标,使用二元Logistic回归分析以上指标是否能够成为AP的独立危险因素;绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC),比较四项指标AP严重程度的早期预测价值。结果:1.根据RAC分级标准将患者分为轻症组(MAP组)84例,中度重症及重症组(MSAP+SAP组)27例,两组的一般资料即性别、年龄方面的差异无统计学意义(P>0.05),而在住院时间方面的差异有统计学意义(P<0.001)。2.对两组患者常用的实验室检测指标进行统计学分析,结果显示,MAP组与MSAP+SAP组在脂肪酶(LIP)、淀粉酶(AMY)、单核细胞计数(M)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBil)、血肌酐(Crea)间的差异无统计学意义(p>0.05)。MSAP+SAP组患者的血小板计数(P)与天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平明显高于MAP组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在白细胞计数(WBC)、中性粒细胞计数(N)、淋巴细胞计数(L)和复合指数NLR、PLR、MLR、SIRI方面,MSAP+SAP组均明显高于MAP组,差异具有统计学意义(P<0.001)。***、PLR、MLR、SIRI及BISAP评分、CTSI评分系统均与是否进入ICU治疗正相关,且结果具有统计学意义(r>0,P<0.005),其中SIRI指数与ICU治疗的正相关性最高(r=0.360,P<0.001)。4.选择WBC、AST、Platelet和SIRI指数进行Logistic回归分析,结果显示除WBC外,AST、Platelet和SIRI指数均为MAP进展为中重症胰腺炎的独立危险因素(P<0.05)。5.绘制ROC曲线结果显示:NLR曲线下面积为0.909,最佳截断值为9.68,敏感度85.2%,特异度83.3%;PLR曲线下面积为0.902,最佳截断值195.07,敏感度85.2%,特异度84.5%;MLR曲线下面积为0.510,最佳截断值0.60,敏感度59.3%,特异度91.7%;SIRI曲线下面积为0.847,最佳截断值3.64,敏感度85.2%,特异度70.2%(P<0.001),说明以上四项指标均具备良好的预测价值。其中NLR和PLR的AUC大于0.9,对MSAP+SAP的预测价值较高,SIRI次之,而MLR的预测价值最低。结论:与MAP组相比,MSAP+SAP组患者NLR、MLR、PLR、SIRI水平均明显升高,说明其与急性胰腺炎的严重程度相关,且与对患者是否需要ICU治疗有一定的参考价值,能够作为急性胰腺炎严重程度的早期预测指标,其中SIRI作为新指标,在急性胰腺早期严重程度评估中表现良好,具有一定的临床参考价值。

关键词： 异牡荆素   抗凋亡   MiR-98-5p   MAPKs/NF-κB  

摘要： 紫外线辐射、烟雾等因素会导致皮肤细胞的氧化损伤和老化,甚至会导致皮肤角质层脱落,即角质细胞凋亡。皮肤发生细胞凋亡的主要部位是皮肤角质细胞层,而肿瘤坏死因子（TNF-α）等炎症因子在此过程中起到重要作用。筛选出抑制角质细胞炎症和凋亡的天然活性成分有望预防皮肤损伤和延缓皮肤老化。异牡荆素是多种食源性植物（如绿豆、酸枣仁等）中含有的黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等功效,但是其保护皮肤角质细胞的作用机制尚不明确。因此,本论文通过构建H2O2损伤的人角质形成细胞（HaCaT）模型,系统分析异牡荆素对皮肤炎症和凋亡的抑制作用,并从microRNA角度阐明异牡荆素潜在保护作用机制。主要结果如下:（1）异牡荆素对HaCaT人角质形成细胞氧化损伤的保护作用。MTT结果表明,HaCaT细胞存活率随着H2O2浓度升高而降低,浓度接近900μM时,达到细胞存活率的IC50值;异牡荆素浓度在40μM以内时与CK组相比无显著性差异,证明40μM以下的异牡荆素对HaCaT细胞没有毒性。因此,使用5、10、20μM的异牡荆素分别处理H2O2损伤的人角质形成细胞,结果表明,在5-20μM浓度范围内,异牡荆素浓度越大,细胞存活率越高;10μM和20μM的异牡荆素可显著降低ROS水平和MDA含量,提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性;不同浓度（5、10、20μM）的异牡荆素能够显著降低H2O2导致的细胞凋亡。（2）异牡荆素通过Bcl-xL/Bcl-2/Caspase-3信号通路缓解H2O2诱导的细胞凋亡。为揭示异牡荆素抗凋亡作用机制,采用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Bcl-xL/Bcl-2/Caspase-3信号通路的m RNA和蛋白表达特性。结果表明,H2O2激活凋亡信号通路,不同浓度的异牡荆素（5、10、20μM）能够降低p53基因和蛋白的表达水平,提高其下游基因Bcl-2和Bcl-xL的表达水平,进而抑制Bax、Caspase-9和Caspase-3的促凋亡作用。（3）MiR-98-5p介导异牡荆素对HaCaT细胞的保护作用。采用ENCORI生物信息学软件和PCR技术筛选miRNA,分别用miR-98-5p mimics和抑制剂预处理HaCaT人角质形成细胞24 h,分析miR-98-5p与Bcl-xL、Bcl-2的靶向关系。结果表明,miR-98-5p mimics降低Bcl-2和Bcl-xL的表达量,miR-98-5p抑制剂提高Bcl-2和Bcl-xL的表达水平。为深入分析miR-98-5p介导异牡荆素保护作用的内在机制,将miR-98-5p mimics进行预转染,结果表明miR-98-5p抑制异牡荆素对Bcl-2、Bcl-xL的促进作用和对Caspase-9、Caspase-3的抑制作用。此外,miR-98-5p mimics逆转异牡荆素导致的细胞存活率、ROS水平和细胞凋亡率的变化趋势。（4）异牡荆素通过MAPKs/NF-κB信号通路缓解H2O2诱导的炎症反应。通过PCR和ELISA法检验细胞炎症因子的表达水平,发现H2O2处理显著增加细胞炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的基因表达水平和蛋白释放量,异牡荆素处理显著恢复三者表达量,且具有剂量依赖性。因此,异牡荆素可能通过抗炎途径发挥保护作用。通过Western Blot实验发现,H2O2处理导致MAPK p38、JNK和NF-κB磷酸化的蛋白表达上调,异牡荆素处理抑制MAPK p38、JNK和NF-κB磷酸化。结果证实,异牡荆素通过抑制MAPKs/NF-κB信号通路的激活进而发挥保护效果。

关键词： 暗纹东方鲀   肠道炎症   内质网应激   铜胁迫  

摘要： 暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)俗称河鲀，其肉质鲜嫩，营养价值丰富，是一种高经济价值鱼类。然而，随着工农业污染物排放到海洋和河口中，加之水产养殖过程中存在含铜药物不规范使用现象，在水环境中，暗纹东方鲀都不可避免地受到水体铜影响。鱼类肠道健康与水环境因子紧密相关，肠道是鱼类响应水环境因子胁迫的重要靶器官。目前，鱼类肝脏作为研究铜胁迫靶器官的研究报道较多，而聚焦肠道的研究较少。　　本研究以暗纹东方鲀为对象，通过体内外实验研究了水体铜暴露诱导暗纹东方鲀肠道炎症反应机制。以内质网应激(Endoplasmic reticulum Stress,ERS)及其介导的信号通路为切入点，研究水体铜暴露对暗纹东方鲀肠道ERS及其介导的信号通路的影响;探讨ERS及其介导的未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)信号通路在水体铜诱导暗纹东方鲀肠细胞炎症反应中的作用。本研究为水体铜诱导鱼体ERS和炎症反应之间的关系提供了新的见解。研究结果有望为暗纹东方鲀养殖业中铜的合理使用提供理论依据，从而促进暗纹东方鲀养殖业绿色健康发展。具体研究结果如下:　　1.水体铜暴露下暗纹东方鲀增重率、肠道铜积累、组织结构变化和转录组学分析　　水体铜暴露下，暗纹东方鲀增重率(WG)显著受到抑制，肠道内铜积累量随水体铜处理浓度的升高而显著增加。通过苏木精/伊红(Hematoxylin-Eosin staining,H&E)染色，结果显示:水体铜暴露处理28天后，该鱼肠道明显发生不同程度的损伤，包括绒毛变短、杯状细胞明显增加、固有层出现空泡、杯状细胞肿胀、绒毛糜烂和炎症，且随着水体铜浓度的增加，其肠道组织损伤加重。采用RNA-Seq技术对暗纹东方鲀在浓度为0 μg/L(对照)、20 μg/L和100μg/L水体铜暴露28天后的肠道转录组进行分析。结果显示:20μg/L处理组共得到317个差异表达基因(DEGs),100μg/L处理组共鉴定出931个DEGs,100μg/L处理组的DEGs数量显著高于20 μg/L处理组。此外，共有118个共表达DEGs在不同浓度水体铜暴露下中表现出显著的差异表达水平，其中包括4个ERS相关基因(GRP78、CRT、IRE-Ⅰα和XBP-1)和4个炎症应答相关基因(NLRC3、NLRC12、HSP70和IL-18)。KEGG分析发现，共表达DEGs显著富集于胰腺分泌(Pancreatic secretion)、蛋白质消化与吸收(Protein digestion and absorption)、胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)、内质网蛋白加工过程(Protein processing in endoplasmic reticulum)和NOD样受体介导的信号转导通路(Nucleotide-binding and oligomerization domain like receptor signaling pathway)。上述结果表明水体铜暴露抑制了暗纹东方鲀生长，导致其肠道受损并引起ERS及炎症应答相关基因上调。　　2.水体铜暴露对暗纹东方鲀肠道ERS及炎症反应的影响　　通过透射电镜(TEM)观察结果显示，暴露于水体铜后，肠道细胞核发生变形，内质网受到损伤，线粒体数量显著增加，细胞发生ERS。此外，与对照组相比，暗纹东方鲀肠道超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量显著上升(P＜0.05)。使用荧光定量 PCR(Quantitative Real time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)技术分析铜暴露下肠道ERS相关基因(GRP78、CRT、PERK、XBP-1、eIF-2α、ATF-6α和IRE-1 α)和炎症应答相关基因(NLRC3、NLRC12、HSP70和IL-18),结果显示铜暴露可诱导暗纹东方鲀肠道ERS和炎症反应，特别是激活了IRE-1α-XBP-1通路。以上结果表明水体铜暴露能够引发暗纹东方鲀肠道氧化应激，诱导暗纹东方鲀肠道产生ERS和炎症反应。　　3.水体铜诱导肠道ERS参与调节暗纹东方鲀肠道炎症反应研究　　为了深入探讨水体铜暴露下暗纹东方鲀肠道ERS调控炎症反应机制，本研究利用分离出的原代肠上皮细胞进行了离体实验。研究发现随着铜处理浓度的增加，肠上皮细胞活力显著下降。铜暴露显著上调了 ERS相关(PERK-eIF2α、IRE1-XBP1和ATF-6α)通路(P＜0.05)。通过添加ERS抑制剂(4-P