关键词： 奶牛乳腺炎   lncRNA BMNCR   bta-miR-145   ANO6   炎症应答  

摘要： 奶牛乳腺炎的致病机制和防治技术是畜牧学研究的热点问题之一。多年来,从乳腺炎表型特征出发,探寻合理的管理技术和防治手段,虽取得了一定成效,但仍未能从根本上解决奶牛乳腺炎防治困难等问题。因此,从分子遗传角度,充分阐明奶牛乳腺炎发生、发展过程中关键信号分子的表达调控机制,开展抗性选育、开发靶向药物是当今奶牛遗传改良和乳腺炎防控的重要路径。本课题前期建立了金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺炎模型,并利用高通量测序技术筛选到一关键 lncRNABMNCR(Bovine Mastitis Related lncRNA),其在金葡菌诱导的乳腺炎中显著上调表达,提示BMNCR在奶牛乳腺炎发生发展过程中发挥着重要作用。在此基础上,本课题利用生物信息学预测发现BMNCR序列上存在一个bta-miR-145的结合位点,表明其可能通过竞争性结合bta-miR-145行使功能,同时预测了bta-miR-145与奶牛乳腺炎相关的靶基因,选择ANO6作为本研究的对象。利用双荧光素酶报告、EdU、流式细胞分析、qPCR和Western blot等多种现代分子生物学技术,从基因功能、表达调控、表观遗传等多层次阐明lncRNABMNCR调控bta-miR-145的分子机制,以及bta-miR-145通过靶基因ANO6调控乳腺炎发生发展的作用途径,揭示BMNCR、bta-miR-145和ANO6三者之间的调控关系,共同参与奶牛乳腺炎自体保护的分子机制。本研究的主要结果如下:1、BMNCR在奶牛乳腺炎中显著上调为鉴定到对乳腺炎起调控作用的ceRNAs,利用金黄色葡萄球菌感染奶牛构建乳腺炎模型,对奶牛金黄色葡萄球菌型乳腺炎和正常乳腺组织进行高通量测序,筛选差异表达的lncRNA。在奶牛金葡菌型乳腺炎的乳腺组织中,有283个lncRNAs表达量上调(p<0.05),346 个 lncRNAs 表达量下调(p<0.05)。本试验选取 lncRNABMNCR(Bovine Mastitis Related lncRNA)为研究对象,利用RT-qPCR检测金葡菌感染后乳腺上皮细胞中BMNCR的表达水平,进一步证明BMNCR在奶牛乳腺组织感染金葡菌后上调表达了约10倍。通过RACE技术扩增长链非编码RNABMNCR的5'和3'末端,结果表明BMNCR全长4206bp。生信分析定位BMNCR相关信息,结果显示BMNCR位于牛26号染色体TCF7L2的第三内含子上。在奶牛乳腺上皮细胞中敲低BMNCR,一些白细胞介素家族炎症相关细胞因子被调节,IL-2、IL-8表达极显著升高(p<0.01),IL-12表达显著升高(p<0.05),IL-6的表达显著降低(p<0.05),IL-1α的表达没有显著改变。实验结果说明BMNCR一定程度上能够降低白细胞介素家族炎症相关细胞因子的表达,抑制炎症的发生。通过EDU细胞增殖试验验证敲低BMNCR后会显著降低乳腺上皮细胞的增殖,流式细胞分析结果显示敲低BMNCR后促进牛乳腺上皮细胞凋亡,提示BMNCR在奶牛乳腺炎发生发展过程中发挥着重要作用。2、BMNCR 靶向 bta-miR-145高通量测序筛选出差异表达的miRNA,数据显示bta-miR-145在金葡菌诱导的奶牛乳腺炎中下调程度最大,提示bta-miR-145与乳腺炎的发生密切相关。通过RNAhybrid预测BMNCR和bta-miR-145之间的存在潜在结合位点,并进一步通过双荧光素酶报告验证了两者之间存在靶向关系,敲低BMNCR后bta-miR-145的表达显著增高。为了验证bta-miR-145的功能,在转染bta-miR-145 inhibitor后,牛乳腺上皮细胞中IL-1α、IL-2和IL-12表达水平显著降低(p<0.05),说明敲低bta-miR-145一定程度上抑制炎症的发生,并且敲低bta-miR-145后牛乳腺上皮细胞增殖显著提高,转染bta-miR-145 mimic抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,说明其参与调节一些生物功能,包括细胞增殖和凋亡。3、bta-miR-145 靶向ANO6使用microRNA靶基因预测软件工具预测bta-miR-145的靶基因。由于本研究的重点是免疫功能或炎症,通过GeneCards和NCBI网站重点评估了 64个基因的功能和途径。最终选择了 1个与免疫或炎症相关的基因ANO6进行后续研究。通过双荧光素酶报告验证了 miR-145和ANO6两者存在结合位点,通过qPCR、EdU以及流式细胞分析验证ANO6有一定的抑制炎症作用,促进牛乳腺上皮细胞的增殖,抑制细胞凋亡,提示ANO6和乳腺炎的发生息息相关综上所述,BMNCR可以通过海绵bta-miR-145调节ANO6的表达,并影响牛乳腺上皮细胞的增殖和凋亡。基于ceRNA理论,我们在牛乳腺上皮细胞中构

关键词： 口腔中性粒细胞   外周血中性粒细胞   趋化   吞噬   细胞因子   中性粒细胞胞外诱捕网  

摘要： 牙周炎是一种菌斑生物膜引起的慢性感染性疾病,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,***)是其主要的致病菌之一,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是***重要的毒力因子之一。中性粒细胞是一种骨髓来源,终末分化的先天免疫细胞,在牙周炎的发生发展中发挥重要作用,通过吞噬、生成活性氧(reactive oxygen species,ROS)、分泌细胞因子和形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)等方式参与免疫炎症反应。现有的大部分关于中性粒细胞的研究均以外周血中性粒细胞(circulating polymorphonuclear neutrophil,cPMN)为研究工具。cPMN可通过牙周袋内壁和口腔上皮迁移至口腔内,成为口腔中性粒细胞(oral polymorphonuclear neutrophil,oPMN),它们对于维持牙周组织稳态的作用是否与cPMN相同,尚无明显结论。 目的: 比较oPMN和cPMN趋化、吞噬***、分泌细胞因子、形成NETs等免疫炎症反应的差异,探讨oPMN维持牙周健康的作用。 方法:1.常规密度梯度离心法分离获得健康人外周静脉血来源的cPMN,离心过滤法分离健康人口腔含漱液来源的oPMN。 2.采用1μg/m L *** LPS刺激两种中性粒细胞3 h,并以大肠杆菌(Escherichia coli,***)LPS作为阳性对照,流式细胞技术检测凋亡水平变化。Transwell法检测200 ng/m L白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)刺激1.5 h前后,两种细胞趋化能力的差异。流式细胞技术检测两种PMN在0、30、60 min对***/***的吞噬作用。采用*** LPS/*** LPS刺激两种中性粒细胞3 h,ELISA技术检测IL-1β、IL-8和IL-10表达水平变化,免疫荧光技术观察NETs的形成,Sytox Green法对胞外DNA进行定量。 3.两种中性粒细胞的刺激同凋亡水平检测,采用Western blot技术检测信号分子丝裂原活化蛋白激酶1/2(mitogen-activated protein kinase1/2,MEK1/2),细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)P65磷酸化水平的变化。 结果: *** LPS/*** LPS刺激后,cPMN和oPMN凋亡率均较空白组降低(p<0.05),与cPMN相比,oPMN凋亡率更高(p<0.05),两种LPS间无明显差异(p>0.05)。IL-8刺激后,两种细胞趋化的细胞数均较刺激前增多(p<0.05),两种细胞间未见明显差异(p>0.05)。两种LPS刺激后,oPMN和cPMN分泌的IL-1β、IL-8和IL-10水平均增高(p<0.05),且oPMN表达水平高于cPMN(p<0.05),两种LPS间无明显差异(p>0.05)。***或***刺激30 min后,两种中性粒细胞吞噬细菌的平均荧光强度均升高(p<0.05),60 min时与刺激前无明显差异(p>0.05),各时间点,oPMN吞噬***或***的平均荧光强度均高于cPMN(p<0.05)。两种LPS刺激后,NETs形成细胞百分比明显增高(p<0.05),胞外DNA数量也明显增多(p<0.05),且oPMN高于cPMN(p<0.05),而两种LPS间无明显差异(p>0.05)。 *** LPS或*** LPS刺激后,两种细胞MEK1/2、ERK1/2和NF-κB P65的磷酸化程度均较空白组明显增强(p<0.05),且oPMN磷酸化水平高于cPMN(p<0.05),两种LPS间无明显差异(p>0.05)。 结论: oPMN可能是具有过度活跃表型的中性粒细胞,其吞噬、分泌细胞因子和形成NETs的能力较cPMN增强,可能与MEK1/2-ERK1/2和NF-κB磷酸化水平增高有关。

关键词： 全身炎症反应综合征   儿童   PICU  

摘要： 背景:全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是机体对炎症反应失控所导致的一组临床综合征,是多器官功能障碍的主要发病机制,在儿童重症医学病房中发病率高达60～80%,SIRS可发生在感染性及非感染性疾病中,病因具有多样性。根据目前的研究,肺炎、急性胃肠炎、血流感染等严重感染以及创伤、手术、烧伤等非感染性疾病都是SIRS患儿的易感因素。不同病因所致的SIRS其管理方式和预后结局均存在差异。因此,入院时PICU患者的炎症状态、病因组成和免疫指标都可能是评估病情和预后的有效指标,识别SIRS的病因构成和死亡危险因素有助于指导临床实践。目的:分析儿童重症病房中感染与非感染SIRS患儿的人群特征、病因构成及临床实验室特征,并探讨SIRS患儿的死亡风险因素,为临床管理及高危患儿的早期识别提供参考依据;方法:回顾性收集2018年01月至2021年12月湖南省儿童医院重症监护病房病例,根据入科后48小时内临床指标,纳入满足全身炎症反应综合征的患儿,根据入科后48小时内感染情况分为感染组、非感染组及感染不明组,主要结局为7天死亡,次要结局为28天死亡及住院期间MODS发生率。结果:1.本研究共纳入SIRS患儿3165例,感染组76.8%(2431/3165)、非感染组12.6%(398/3165)、感染不明组10.6%(336/3157);PICU中SIRS患儿7天总死亡率为4.8%(153/3165),其中感染组、非感染组及感染不明组7天死亡率分别为4.5%、6.3%、5.7%;28天总死亡率7.8%,感染组、非感染组及感染不明组28天死亡率分别为7.2%、8.3%、8.9%;住院期间的MODS总发生率为7.3%,感染组、非感染组及感染不明组分别为7.4%、7.0%、6.5%;在住院第8天-28天死亡患儿共84例,感染组、非感染组及感染不明组分别为65例、8例及11例。2.感染组多发年龄段为28天-1岁,占比47.6%,最常见主诊断为肺炎(69.7%),其次为颅内感染(15.2%)和败血症(13.7%);非感染组多发年龄段为1-3岁,占比35.2%,最常见主诊断为创伤/手术(25.6%),其次为肿瘤(17.8%)和溺水/窒息(7.3%);感染不明组多发年龄为28天-1岁,占比32.1%。3.感染组中总T淋巴细胞计数、辅助/诱导性T淋巴细胞计数、抑制T淋巴细胞计数、NK细胞计数均低于存活患儿,差异具有统计学意义(P<0.05),补体C3、C4的下降与在感染及非感染组中均显示与SIRS患儿的死亡风险相关;4.女性及主诊断为腹腔感染的感染性SIRS患儿更易发生MODS,其OR值为1.597(1.177～2.166)、2.209(1.355～3.602);5.感染性SIRS患儿7天死亡预测模型的AUC为0.820(95%CI=0.771～0.868),特异度及灵敏度分别为0.671、0.828,非感染性SIRS患儿7天死亡预测模型的AUC为0.939(95%CI=0.897～0.981),特异度为0.775,灵敏度为0.957。结论:1.非感染性和感染性SIRS的好发年龄分别为1-3岁、1月-1岁,常见病因分别为:外伤、肿瘤、溺水/窒息和肺炎、颅内感染、败血症;***患儿补体、淋巴细胞免疫下降与预后不良预后相关。3.感染性SIRS患儿出现全血CRP、降钙素原、尿素氮、APTT、D二聚体增高及FIB下降提示7天死亡风险增高;非感染性SIRS患儿出现淋巴细胞比值下降、尿酸增高、PT延长、补体C4下降提示7天死亡风险增高。4.基于实验室指标构建的感染性SIRS患儿中预测7天死亡风险的模型包含5个预测指标:全血CRP、降钙素原、尿素氮、APTT、D二聚体及FIB;预测模型AUC为0.833;基于实验室指标构建的非感染性SIRS患儿中预测7天死亡风险的模型包含4个预测指标:淋巴细胞比值、尿酸、PT、补体C4,预测模型AUC为0.939。

关键词： 有氧运动联合抗阻运动   腹膜透析   透析充分性   微炎症状态  

摘要： 【目的】探讨有氧运动联合抗阻运动的运动方式对腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)患者透析充分性、营养及微炎症状态、代谢指标、心功能、运动能力等身体功能的影响。【方法】选取2021年12月-2022年12月在昆明医科大学第二附属医院肾脏内科就诊的诊断为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)行PD的患者58例作为研究对象,采用随机分组方法将患者分为对照组(n=30)和干预组(n=28),对照组接受基础药物治疗,干预组在基础药物治疗的基础上增加有氧运动联合抗组运动的运动训练治疗。比较两组患者干预治疗前及干预治疗6个月后的透析充分性、营养及微炎症状态、代谢指标、心功能、运动能力、心理状态等身体功能的情况。【结果】常规治疗联合运动干预6个月后,与治疗前相比,干预组透析充分性较治疗前升高(P<0.05);甘油三酯(triglycerides,TG)及血清铁(serum iron,SI)水平较治疗前升高(P<0.05);白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及高敏C反应蛋白(highly sensitive c-reactive protein,hs-CRP)较治疗前下降(P<0.05);主观营养量表(patient-generated subjective global assessment,PG-SGA)及抑郁自评量表(self-rating depression scale,SDS)评分较治疗前改善(P<0.05);血清白蛋白(albumin,ALB)及六分钟步行试验(6 minutes walk test,6MWT)有上升趋势,收缩压及舒张压有下降趋势,但差异不具有统计学意义。常规治疗6个月后,与治疗前相比,对照组ALB、血清前白蛋白(prealbumin,PAB)、血红蛋白(hemoglobin,Hb)较治疗前下降(P<0.05);空腹血糖(fasting blood glucose,FPG)较治疗前升高(P<0.05)。【结论】6个月的有氧运动联合抗阻运动的运动训练方式能改善PD患者透析充分性,提高PD患者的KT/V水平;降低PD患者hs-CRP及IL-6水平,改善ALB水平,进一步改善体内微炎症状态及营养不良-炎症综合征(malnutrition-inflammation complex syndrom,MICS);改善PD患者营养及心理状况,减轻PD患者抑郁情绪。

关键词： 急性脑梗死   静脉溶栓治疗   中性粒细胞/淋巴细胞比值   全身免疫炎症指数   预后  

摘要： 目的探讨分析急性脑梗死患者发病6小时内使用尿激酶静脉溶栓前中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、全身免疫炎症指数(SII,血小板计数×中性粒细胞计数/淋巴细胞计数)及红细胞分布宽度(RDW)的水平与急性脑梗死患者静脉溶栓预后的相关性分析。方法1.收集2021年5月至2022年9月建平县中医院发病6小时内应用尿激酶静脉溶栓治疗的急性脑梗死患者100例。2.回顾性研究静脉溶栓前白细胞计数(WBC)、中性粒细胞计数(NEUT)、淋巴细胞计数(LYM)、血小板计数、红细胞分布宽度(RDW),低密度脂蛋白、血糖等实验室检查指标及NIHSS评分与预后的相关性。3.发病3个月后,对患者进行电话随访调研,根据改良Rankin量表将研究对象分为预后良好组及预后不良组。4.应用SPSS 26.0软件进行统计学分析,计量资料若符合正态分布,采用(?)±s表示,两组间比较采用两独立样本t检验。计数资料采用频数(百分比)表示,组间比较采用卡方检验。采用二元逻辑回归分析进行多因素分析。采用Spearman相关分析进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.急性脑梗死静脉溶栓的患者中,发病前有吸烟史的患者更容易发生不良预后,与无吸烟病史者相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.预后不良组发病到静脉溶栓时间“>3h”占比和NIHSS评分均高于预后良好组(P<0.05),而年龄、收缩压、舒张压比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.预后不良组的患者中性粒细胞计数、SII值、NLR值、RDW值均高于预后良好组,差异有统计学意义(P<0.05)。通过二元回归发现以上指标均是预后判断的独立危险因素。4.急性脑梗死发病6小时内患者的SII、NLR、RDW经过风险预测模型的ROC曲线进行预判,发现三个指标的特异度、敏感度均较高,三者联合预测特异度及敏感度更高。结论1、ACI患者静脉溶栓前的NLR、SII,RDW值与静脉溶栓预后结局密切相关。它们分别是ACI静脉溶栓治疗预后结局的独立危险因素,可以作为预后结局的预测指标,通过各风险因子预测的ROC曲线我们还发现,NLR、SII,RDW三者联合预测,效能更好。2、ACI静脉溶栓治疗患者的预后结局与其他指标也有一定关系,如患者吸烟史、发病至静脉溶栓时间,患者静脉溶栓前NIHSS评分等指标,提示我们将NLR、SII,RDW值与这些指标相结合,能更好地预测预后情况。3、对患者TOAST分型,SII、NLR与各分型间关系未发现统计学的相关性,因此不存在病因学差异。

关键词： 生物信息学分析   PCSK9   缺血性脑卒中   免疫炎症反应  

摘要： 目的:创建枯草溶菌素转化酶9(PCSK9)高表达细胞株,筛选差异基因并探讨PCSK9在PC12细胞中潜在的生物学功能。方法:通过质粒转染获得PCSK9高表达的PC12细胞株,利用Western-blot(蛋白免疫印迹实验)及PCR进行验证,将PCSK9高表达细胞株与对照组细胞株制备RNA-seq文库,并进行高通量测序。利用R生物导体包edge R筛选差异表达基因(DEGs)并进行GO和KEEG富集分析其生物学功能。结果:(1)Western blot及PCR结果均显示PCSK9在PC12细胞中显著过表达,从而证实获得了PCSK9高表达的细胞系。(2)将高通量测序结果进行差异基因筛选,共鉴定出330个DEGs,其中209个表达上调,121个表达下调。(3)差异基因的GO功能富集分析结果表明,209个上调的差异基因主要参与免疫反应,细胞迁移,病毒防御反应等生物过程;高度富集于KEGG通路的包括趋化因子信号通路、TNF信号通路、p53信号通路等生物学通路。(4)通过分析筛选出8个显著差异表达的基因(Ccl2、Ccl7、Cxcl1、Il1rl1、Irf9、Irf7、Ccl24、Cxcl11),RT-q PCR的验证结果提示除Ccl24外,余基因均在PCSK9高表达PC12细胞株中高表达。结论:本研究结果提示PCSK9的高表达会激活细胞中的免疫反应,PCSK9可以促进免疫和炎症相关基因的上调表达,且具有非常强的特异性和富集性,包括Ccl2、Ccl7、Cxcl1、Il1rl1、Irf9、Irf7、Cxcl11等。说明PCSK9的高表达可能会引发一系列的免疫炎症响应,从而可能在缺血性脑卒中的发病后脑损伤中发挥重要功能。

关键词： 糖尿病肾病   lncMCS   Hmgb1   NF-κB   单细胞核RNA测序  

摘要： 目的:糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)是终末期肾病(End-stage kidney Disease,ESRD)和慢性肾病的常见原因,严重影响人类健康。肾小球系膜细胞(Mesangial cells,MCs)是一类反应活跃的肾脏固有细胞,占肾小球细胞总数的30～40%,且肾小球系膜异常增生是DKD早期的主要病理特征之一。深入探讨DKD状态下的肾小球系膜细胞的病理机制,寻找新的诊断标志物和治疗靶点将会给临床诊断和防治DKD带来重大意义。因此,我们探索了DKD MCs的特定分子生物学行为,并通过单细胞核RNA测序(Single-nucleus RNA sequencing,sn RNA-seq)解释了DKD状态下MCs异常增殖的新机制。通过sn RNA-seq发现:lnc MCS在MCs中特异性高表达且在DKD中表达上调。本研究的目的是验证lnc MCS在高糖状态下的系膜细胞中特异性高表达以及探索其生物学功能的调控作用,并阐明lnc MCS是通过何种机制参与DKD的发生发展,为DKD的诊断或者治疗靶点提供科学依据。方法:首先通过sn RNA-seq技术分析并筛选出4个候选lnc RNAs,是MCs中特异性lnc RNA且与DKD密切相关。接着通过q RT-PCR在肾脏固有细胞MCs、足细胞和肾小管上皮细胞和高低糖培养的MCs中检测发现E130307A14Rik在MCs中特异表达且在H-MC中表达差异最显著;因此我们将E130307A14Rik命名为lnc MCS(系膜细胞特异性lnc RNA)并选择lnc MCS作为本课题的研究对象。紧接着,通过核质分离q RT-PCR和FISH方法检测lnc MCS在MCs的核质分布。第二,为了探讨lnc MCS在DKD中的临床价值,通过q RT-PCR检测lnc MCS在DKD小鼠肾脏组织中以及lnc MCS的人源类似物在DKD患者血浆中的表达水平,并通过皮尔逊相关系数分析lnc MCS与DKD相关肾功能指标的相关性。第三,为了探索lnc MCS在DKD MCs中的生物学功能,我们构建了pc DNA3.1(+)-lnc MCS过表达质粒和设计合成了lnc MCS的3条si RNAs并通过CCK-8,Ed U,流式细胞周期检测技术以及western blot检测lnc MCS对MCs增殖活性的调控作用;通过q RT-PCR,western blot和IF检测lnc MCS对MCs炎症和纤维化的调控作用。第四,为了探讨lnc MCS的生成机制,通过q RT-PCR,Ch IP和双荧光素酶实验验证转录因子NF-κB p65是否可以和lnc MCS的启动子区域相结合并调控lnc MCS的表达水平。第五,为了探究lnc MCS调控MCs增殖、炎症和纤维化的具体机制,通过RNA-pull down和RIP发现lnc MCS与高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box 1,Hmgb1)相互结合。第六,为了探讨lnc MCS促进Hmgb1核质易位,通过核质分离western blot和FISH-IF来检测Hmgb1在MCs中细胞质和细胞核的表达水平以及分布情况是否由lnc MCS所调控。第七,为了明确lnc MCS如何通过调控Hmgb1而激活NF-κB信号通路,通过Co IP和western blot实验,检测Hmgb1与IκBα相互结合和NF-κB信号通路的关键分子蛋白表达情况。最后,我们构建敲低lnc MCS的慢病毒并通过尾静脉向DKD db/db小鼠注射,并通过小鼠以及脏器活体成像,q RT-PCR和FISH确认敲低lnc MCS的慢病毒成功感染肾脏并敲低体内肾脏组织中lnc MCS的表达水平。然后通过q RT-PCR,western blot和组织免疫荧光等实验探讨lnc MCS/Hmgb1/NF-κB轴在DKD小鼠体内对肾脏组织的增殖、炎症和纤维化。结果:第一,由sn RNA-seq检测发现Lnc MCS是系膜细胞特异性表达分子且在DKD系膜细胞集群中表达上调。随后通过q RT-PCR在肾脏固有细胞系膜细胞、足细胞和肾小管上皮细胞和L-MC或H-MC中检测,发现lnc MCS(E130307A14Rik)在MCs中特异高表达,且在H-MC中表达差异倍数最显著。第二,lnc MCS在MCs的细胞质和细胞核中均有表达但主要分布在细胞质中。第三,lnc MCS在DKD中表达上调,且与DKD相关肾功能指标呈正相关。第四,过表达的lnc MCS促进MCs增殖,炎症和纤维化,反之亦然。第五,Ch IP和双荧光素酶实验结果表明,转录因子NF-κB p65可以和lnc MCS的启动子区域结合;且过表达p65可以上调lnc MCS在MCs的表达,相反敲低p6

关键词： PanMayo评分   溃疡性结肠炎   全身系统免疫炎症指数   内镜评分   严重程度  

摘要： 目的:(1)探讨Pan Mayo评分在评估溃疡性结肠炎(UC)疾病严重程度的临床应用价值。(2)研究全身系统免疫炎症指数(systematic immune-inflammation index,SII)对于评估溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)疾病严重程度的临床价值。方法:选取2019年1月至2022年1月河北大学附属医院收治的128例溃疡性结肠炎(UC)患者作为研究对象。将UC患者分别按照改进的临床评分(Truelove-Witts)和内镜评分(MES、UCEIS、EAI)进行评估,根据评估将患者分为轻度、中度和重度UC,分析患者的Pan Mayo评分与梅奥内窥镜评分(Mayo Endscopic Score,MES)、UC内镜下严重程度评分(Ulcerative colitis endoscopic index of severity,UCEIS)、内镜活动指数(EAI)的相关性,同时用患者的Pan Mayo评分和MES评分做一致性分析。评价Pan Mayo评分对CRP>10mg/L时UC患者及重度UC患者的判断效能,以此来评估Pan Mayo评分对UC患者诊断的有效性。收集UC患者的血小板计数(Platelets,PLT)、中性粒细胞计数(Neutrophil,N)、淋巴细胞计数(Lmphocytes,L)、血沉(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)和C反应蛋白(c-reactive protein,CRP),使用SII的计算公式(血小板计数×中性粒细胞/淋巴细胞的比值)计算出SII数值。分析不同内镜活动程度下的UC病人SII的水平及变化状况。将SII与炎症指标、内镜评分(MES评分)和临床评分(Truelove-Witts评分)进行相关性分析。建立ROC曲线判断SII诊断重度UC患者的最佳阈值,最后通过评价SII、ESR、PLR诊断CRP>10mg/L时UC患者的特异度、灵敏度及最佳阈值,来进一步探讨SII的临床应用价值。结果:***患者的Pan Mayo评分与MES、EAI、UCEIS均呈正相关(r=0.822、0.600、0.713,P<0.001),相关性较好。UC患者Pan Mayo评分与Mayo内镜评分之间的总体一致性中等(κ=0.638,P<0.001),它在评价轻中度患者时与内镜Mayo评分的一致性较好(κ=0.895,P<0.001)。UC患者的Pan Mayo评分与炎症指标PLT、SII、CRP、ESR都呈明显的正相关性,而与L、N的相关性较差(r=0.056,0.079,P>0.05)。作受试者工作特征曲线(ROC曲线)发现Pan Mayo评分在CRP>10mg/L的曲线下面积为0.760(P<0.05),并且与MES、UCEIS及EAI相比,其敏感度最高为66.67%,但其特异度低于MES及EAI。同时发现对于判断重度UC的曲线下面积为0.720(P<0.05),其特异度大于MES、UCEIS及EAI,为87.16%。***患者的SII水平伴随疾病严重程度的增长而提高,而且在轻、中、重度活动组之间也具有显著差异(P<0.05)。SII与ESR和CRP呈正相关(r=0.453、0.585,P<0.05)。SII与内镜及临床评分评估的疾病严重程度成正相关关系(r=0.230,r=0.405,P<0.001)。做ROC曲线分析发现,SII在诊断溃疡性结肠炎患者严重程度方面具有显著的作用,其高水平(≥543.95)可以有效地区分轻中度UC患者与重度UC患者,而且在判断重度UC患者时,SII的灵敏度达到90.9%。SII在判断CRP>10mg/L的患者时与ESR、PLR相比显示出较好的灵敏度及特异度。结论:*** Mayo评分与内镜评分(MES、EAI、UCEIS)之间存在良好的相关性,在评价轻中度患者时与MES评分具有较高的一致性。其次,Pan Mayo评分在评价重度UC患者和CRP>10mg/L的UC患者时曲线下面积最大,且具有良好的特异度。从而,它有希望作为一种新的指标来更准确的判断疾病的严重程度。***水平在重度UC患者中较轻中度UC患者中更高,SII水平越高代表UC患者疾病越严重。SII与CRP、ESR有良好相关性。SII水平在判定重度UC患者时显示出更高的灵敏度。对于判断CRP>10mg/L的患者时,SII与ESR、PLR相比显示出较好的灵敏度及特异度。可见,SII可以作为辅助诊断UC疾病严重程度的较好指标。

关键词： RBM25   可变剪接   糖酵解   RBM22   增强子   组蛋白乙酰化  

摘要： 炎症反应是免疫系统应对应激、损伤和感染所作出的高效快速的生理反应。这个过程涉及到多种天然免疫细胞以及适应性免疫细胞的参与,前者包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、NK细胞、肥大细胞、天然淋巴细胞等,而后者包括T细胞和B细胞等。它们相互协同,以抵御病毒或细菌等的入侵,又彼此制约,以实现机体受损组织的修复。然而,慢性的过度炎症反应是许多疾病,特别是自身免疫病的主要病理机制,例如类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）、多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）、炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）、银屑病、哮喘等。上述疾病的共同特点就是局部或全身持续的炎症反应难以控制和消退,从而引发一系列严重的病理损伤。因此,如何靶向特定的免疫细胞,研究其中炎症活化和消退的分子机制,将为缓解和治疗自身免疫性疾病提供潜在的诊断指标和药物靶点。为了寻找新的致病基因和有关通路,我们分析了RA、MS和IBD这三类疾病中发生异常的生物学过程,其中mRNA加工的调节以及剪接体依赖的mRNA剪接这些通路的改变引起了我们的关注。进一步研究发现剪接体保守蛋白RBM25（RNA-binding motif 25）和RBM22（RNA-binding motif 22）的表达发生显著改变,并且以不同的作用机制导致了免疫细胞的异常活化和相关的自身免疫性疾病发生。因此,本课题就这两个基因的不同功能和调控网络展开深入的表型和机制研究。第一部分 剪接因子RBM25通过可变剪接调控巨噬细胞代谢重塑及其介导的炎症反应和关节炎发生类风湿性关节炎是以滑膜异常增生和关节侵蚀为临床表现的一种自身免疫病,其免疫学病因是由于关节腔内存在大量致病性促炎免疫细胞的浸润,主要包括巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞等等。它们与病灶中的基质细胞相互作用,造成滑膜成纤维细胞的恶性增生以及破坏成骨-破骨细胞平衡,最终导致不可逆的关节畸形和功能丧失。因此,研究关节炎病灶中关键免疫细胞的异常活化的分子机制,并且以此为靶点进行阻断和干预具有重要的临床意义。为此,我们通过分析RA病人与健康人的滑膜组织的基因表达谱,并对差异基因进行功能聚焦,其结果显示mRNA加工和mRNA剪接的通路受到下调。其中,U1剪接体关键组分RBM25的表达被显著抑制,并且与疾病的恶性程度呈负相关。随后利用ChIP-seq、ATAC-seq和GRO-seq发现炎症环境能够诱导巨噬细胞内RBM25基因启动子区多种转录激活的标志下调,表明RBM25发生转录抑制,造成其病理性表达下调。我们构建了RBM25巨噬细胞条件性敲除小鼠(Rbm25fl/flLyz2-cre+,后文称作cKO小鼠)以对其生理病理功能进行深入剖析。组织免疫化学和micro-CT结果显示在实验性关节炎模型中,RBM25 cKO小鼠的关节炎症和骨破坏较野生型对照小鼠（后文称作WT小鼠）明显恶化,伴随多种致病性免疫细胞浸润以及IL-1β在内的多种炎性细胞因子产生增加。为了进一步研究RBM25缺陷促进巨噬细胞介导的关节炎症的分子机制,我们体外分离培养WT和cKO小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）并利用脂多糖（LPS）刺激不同时间后,收取RNA,进行转录组测序,发现天然免疫调控、炎症反应以及细胞因子介导的信号转导这几条关键通路发生改变,其中就包括炎症因子Il1b,Il6以及趋化因子Cxcl10等等。进一步在BMDMs和肺泡巨噬细胞（AMs）中验证了这一结论,而且发现双链RNA poly（I:C）和Pam3CSK4处理的巨噬细胞也具有相似表型。随后在脓毒症和腹膜炎这两种体内急性炎症模型中证明了RBM25缺陷能够促进巨噬细胞中IL-1β和IL-6的产生和免疫细胞浸润,加剧体内炎症反应。在机制研究中,首先我们发现RBM25不直接影响NF-κB和MAPK的信号转导。因此我们猜测RBM25是否有可能作用于巨噬细胞的代谢重编程发挥炎症抑制作用。随后利用靶向代谢组学以及Seahorse细胞能量代谢分析技术,发现RBM25缺陷造成巨噬细胞内代谢重塑和糖酵解增强,而通过透射电镜观察到的线粒体形态也显示线粒体裂解,氧化呼吸受损,细胞以糖酵解供能为主。进一步利用染色质免疫共沉淀和CUT&Tag实验发现上述代谢重塑以及胞内多种关键性代谢产物的丰度改变,直接引起了巨噬细胞组蛋白H3K9ac和H3K27ac修饰在Il1b和Il6等炎性基因启动子区的增强,以及缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor 1-α,HIF-1α）的富集,共同介导了Il1b和Il6基因的转录增强。鉴于RBM25作为U1剪接体的关键元件,参与了多种可变剪接的发生。我们利用全转录组测序和RNA免疫共沉淀结合测序联合分析了RBM25

关键词： 益肾活血汤   慢性肾脏病   微炎症状态  

摘要： 目的:客观评价益肾活血汤治疗慢性肾脏病(CKD)3-4期(脾肾两虚,湿浊瘀阻型)患者的临床疗效及对微炎症状态的影响,从而探讨益肾活血汤对CKD3-4期患者的肾脏保护作用及其可能的作用机制,为临床推广应用提供依据。方法:选取符合纳入标准的门诊及住院患者64例,随机分为对照组32例和治疗组32例。对照组给予常规治疗联合肾衰宁颗粒,治疗组给予常规治疗联合益肾活血汤,连续治疗并观察8周。监测记录干预治疗前后两组患者的肾功能、微炎症指标、中医证候积分及其安全性指标的变化。利用SPSS 27.0软件系统,根据资料类别进行相应的统计学分析,以客观评价其疗效和安全性。结果:1.疾病疗效:对照组显效4例,有效10例,稳定8例,无效8例,总有效率为73.33%;治疗组显效10例,有效11例,稳定6例,无效3例,总有效率为90.00%。治疗组疾病疗效的总有效率高于对照组(P<0.05)。2.实验室指标:经治疗,两组患者的Scr、BUN、Cys-C、GFR、24h U-Pro、MALB水平都得到明显改善(P<0.05),组间对比治疗组治疗后较对照组治疗后,Scr明显下降(P<0.05),GFR显著升高(P<0.05)。3.中医证候疗效:对照组显效5例,有效15例,无效10例,总有效率为66.67%;治疗组显效10例,有效16例,无效4例,总有效率为86.67%。治疗组中医证候疗效总有效率高于对照组(P<0.05)。4.微炎症指标:经治疗,两组患者的CRP、NGAL水平都得到明显改善,且治疗组的改善情况均优于对照组(P<0.05)。5.安全性指标:试验期间两组患者的安全性指标无明显异常,安全有效。结论:益肾活血汤能显著改善CKD3-4期患者中医临床证候,改善肾功能,并降低患者体内炎症因子水平。益肾活血汤延缓CKD3-4期进展的作用机制可能与其降低血清CRP、NGAL水平,改善微炎症状态有关。