关键词：
低氧
自噬
NEU1
ATG5
唾液酸化
巨噬细胞
摘要：
研究背景
在动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）疾病进程中,斑块内的氧气供需不匹配会导致局部缺氧,进一步促进脂质的积累和炎症反应的发生。有研究表明,在动脉壁中的低氧区域内富含巨噬细胞与泡沫细胞,并伴随细胞内自噬的过度激活。而自噬是一种细胞的稳态过程,可增加细胞对多种应激源（氧化应激、低氧）的耐受性。自噬相关基因（Autophagy-related genes,ATGs）受到多种翻译后修饰（Post-translational modifications,PTMs）的调节。在动脉粥样硬化中,低氧能诱导细胞炎症的增加,但其是否受到自噬水平的调控尚不清楚,具体机制仍有待探究。因此,本研究将采用体外诱导巨噬细胞低氧模型,研究低氧诱导巨噬细胞炎症的可能机制,为动脉粥样硬化发病机制的研究提供更多的理论支撑。
研究目的
建立体外巨噬细胞低氧模型,探究自噬是否参与低氧诱导的巨噬细胞炎症及其具体机制,为动脉粥样硬化的研究提供更多的方向。
研究方法
1)构建体外RAW264.7巨噬细胞低氧模型
在低氧工作站中对RAW264.7细胞进行低氧（1%O2）处理,采用蛋白印迹（Western blot,WB）、免疫荧光及实时定量PCR（quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,q-PCR）检测RAW264.7细胞的低氧诱导因子（Hypoxia-Inducible Factor 1-Alpha,HIF-1α）水平,验证巨噬细胞低氧模型是否构建成功。在光学显微镜的白光模式下观察细胞形态变化以及CCK-8分析低氧对巨噬细胞活力的影响;采用WB、免疫荧光及q-PCR方法检测低氧条件下炎症因子的变化。
2)探索低氧诱导的RAW264.7细胞炎症与自噬的关系
RAW264.7细胞进行低氧处理后,采用WB方法分析自噬相关蛋白、自噬标记物LC3和自噬关键调节蛋白Beclin1的表达;免疫荧光检测LC3的荧光水平;转染m Cherry-GFP-LC3质粒后分析荧光变化;TEM分析自噬溶酶体的产生。自噬抑制剂Baf A1和3-MA联合低氧处理巨噬细胞后,通过免疫荧光分析LC3的荧光变化,WB分析LC3及炎症因子的表达情况。
3)探究低氧诱导巨噬细胞自噬的分子机制
构建巨噬细胞ATG5敲除模型,通过WB方法验证ATG5在低氧诱导巨噬细胞自噬及炎症中的关键作用。巨噬细胞低氧处理后,通过co-IP实验分析ATG5的唾液酸化水平,并采用q-PCR及WB分析唾液酸酶及唾液酸转移酶的表达。构建ST6GAL过表达质粒,通过WB验证转染效率;co-IP实验检测ATG5唾液酸化变化。通过分子对接软件初步分析NEU1与ATG5相互作用的蛋白构象,并通过co-IP、WB实验进一步验证NEU1与ATG5的结合。为了探究NEU1的作用,建立si RNA瞬时干扰NEU1巨噬细胞模型及添加唾液酸酶抑制剂,通过co-IP、WB、免疫荧光、TEM、等实验检测ATG5的唾液酸化水平、自噬相关蛋白及炎症因子的表达。
研究结果
1)与常氧组相比,低氧显著上调RAW264.7细胞HIF-1α的水平,同时CCK-8实验及光学显微镜结果表明低氧并不影响巨噬细胞的形态及活力,但炎症因子的水平在低氧条件下显著上调。
2)低氧显著上调自噬相关蛋白、自噬标记物LC3、自噬关键调节因子Beclin1的水平,且在自噬晚期抑制剂Baf A1干预后,LC3水平相比于单独加Baf A1组显著上升。与低氧组相比,低氧联合自噬早期抑制剂3-MA干预后,细胞的自噬水平及炎症因子水平显著降低。
3)RAW264.7细胞在低氧条件下转染si ATG5后,自噬及炎症水平显著降低。Co-IP结果显示ATG5在低氧下发生去唾液酸化,促进ATG5-ATG12-ATG16L自噬复合物形成,且q-PCR及WB结果显示低氧下唾液酸酶NEU1显著升高,ST6GAL水平显著降低。低氧条件下转染ST6GAL过表达质粒后,ATG5的唾液酸化水平降低,但自噬水平反而上升。分子对接及co-IP结果表明NEU1与ATG5存在相互作用,低氧联合si NEU1及唾液酸酶抑制剂处理细胞后,自噬及炎症水平显著降低。
研究结论
1)低氧激活RAW264.7细胞自噬,促进细胞炎症反应的发生。
2)低氧诱导唾液酸酶NEU1与ATG5发生相互作用,介导ATG5去唾液酸化,促进自噬复合体ATG12-ATG5-ATG16L的形成,激活细胞自噬及炎症。
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