关键词： 干眼   干燥综合征   类风湿性关节炎   系统性红斑狼疮   角膜树突状细胞  

摘要： 目的:探讨免疫性干眼的眼表炎症指标与免疫性疾病全身活动度之间的相关性。方法:纳入2020年12月至2023年2月于重庆医科大学附属第一医院眼科就诊的自身免疫性疾病相关性干眼患者共63例,其中干燥综合征(Sj（?）gren’s syndrome,SS)相关性干眼患者30例,类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）相关性干眼患者22例,系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）相关性干眼患者11例。收集所有患者的眼表炎症指标,包括角膜神经纤维密度（Corneal nerve fiber density,CNFD）、角膜神经纤维分支（Corneal nerve branch density,CNBD）、角膜神经纤维长度（Corneal nerve fiber length,CNFL）、角膜神经纤维弯曲度（Corneal nerve tortuosity,CNT）及角膜上皮下树突状细胞（Dendritic cells,DCs）密度及活化百分比。全身疾病活动度指标,包括全身疾病活动度评分、C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、红细胞沉降率（Erythrocyte sedimentation rate,ESR）、类风湿因子（Rheumatoid factor,RF）。汇总分析免疫性干眼的眼局部炎症与全身疾病活动度的相关性。结果:免疫性干眼的DCs密度为178.17（168.38,197.54）个/mm2,活化DCs百分比为88.66（86.03,93.64）%。其中,SS相关性干眼的DCs平均密度为173.87±3.96个/mm2,活化DCs百分比为86.80（83.39,94.29）%;RA相关性干眼的DCs平均密度为187.35±5.30个/mm2,活化DCs百分比为88.42（86.03,92.42）%;SLE相关性干眼的DCs平均密度为180.68±6.31个/mm2,活化DCs平均百分比为88.79±2.79%。SS相关性干眼的角膜DCs密度、活化的DCs百分比与欧洲风湿病联盟干燥综合征疾病活动指数(European League Against Rheumatism Sj（?）gren's Syndrome Disease Activity Index,ESSDAI)具有正相关性（r=0.522,P=0.003,P<0.01;r=0.359,P=0.031,P<0.05）;RA相关性干眼DCs密度、活化DCs百分比与28个关节疾病活动评分（Disease Activity Score 28,DAS-28）呈正相关（r=0.572;P=0.005,P<0.01;r=0.521,P=0.013,P<0.05）;SLE相关性干眼DCs密度与系统性红斑狼疮病情活动指数2000（Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index-2000,SLEDAI-2000）具有显著正相关性（r=0.861;P=0.001,P<0.01）。结论:免疫性干眼的全身疾病活动度与角膜DCs的状态相关,角膜DCs的密度和活化百分比可作为免疫性疾病相关性干眼的敏感指标。

关键词： 全身免疫炎症指数   急性胰腺炎   严重程度  

摘要： 目的:本研究旨在研究全身免疫炎症指数(Systemic Immune-inflammation Index,SII)对急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)患者重症的预测能力与优势。方法:本研究回顾性分析2013年1月1日至2021年1月1日收治我院消化内科住院治疗的AP患者,严格按照纳入及排除标准筛选研究对象,最终纳入406名患者,通过医院信息系统收集患者人口统计学信息,包括年龄、性别、体重指数(BMI)、吸烟、饮酒、AP病因、既往病史、住院时长等一般情况;入院24h内的实验室指标如白细胞计数(WBC)、中性粒细胞比率(NEU%)、淋巴细胞比率(LYM%)、单核细胞计数(MONT)、红细胞压积(HCT)、C反应蛋白(CRP)、白蛋白(ALB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、视黄醇结合蛋白(RBP)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、随机血糖(GLU)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、脂蛋白a(Lp)、APOA1、APOB等指标。临床常用的AP严重程度评分包括Marshall评分、BISAP评分、CTSI评分。根据亚特兰大分类,将患者分为SAP组与非SAP组,或根据病因分为胆源性或脂源性AP组,结合数据特征酌情采用t检验、Kruskal-Wallis检验、卡方检验或Fisher精确检验、多因素二元logistic回归分析等统计学方法分析差异性。绘制ROC曲线,分析SII对AP重症的预测价值。结果:1.研究人群人口统计学及临床特征分析(1)本研究共纳入406名患者,其中非SAP组353例,SAP(重症急性胰腺炎,Severeacutepancreatitis)组53例。与非SAP组患者相比,SAP组患者男性占比、年龄均更高,差异具有统计学差异(P<0.05),此外,通过多因素二元logistic回归分析,提示合并糖尿病是AP患者发展为重症的独立危险因素,OR值是2.935。(2)在病因分析中,结果显示AP患者约54.1%病因考虑脂源性,而胆源性占23.1%。且与胆源性急性胰腺炎(Acute biliary pancreatitis,ABP)患者相比,脂源性急性胰腺炎(Hypertriglyceridemic acute pancreatitis,HTG-AP)患者男性占比、年龄、BMI、吸烟饮酒占比更高,更可能合并糖尿病、高血压病、脂肪肝、高脂血症,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)入院24h内的血液学检查结果提示SAP组患者NEU%、LDH、GLU、WBC、CRP、MONT、AST、ALP、BUN、Cr、HbA1c、Lp 更高,LYM%、RBP、SOD、APOA1较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。***等血液中炎症指标、临床常用评分系统对SAP的预测价值分析。(1)与非 SAP 组患者相比,SAP 组 SII、NLR、PLR、CAR、CTSI 评分、Marshall评分、BISAP评分更高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)SII预测SAP的AUC是0.754(最佳截断值=1705.83,敏感性为75.47%,特异性为69.12%),与CTSI评分、Marshall评分、BISAP评分在预测AP重症方面没有明显差异。(3)SII与NLR在预测AP重症方面没有明显差异,且与PLR、CAR相比,SII和NLR预测AP患者重症的能力更好(P<0.05)。***、NLR、PLR在ABP组及HTG-AP组重症的预测价值分析(1)SII 预测 ABP 重症的 AUC=0.788(敏感性=85.71%,特异性=68.75%)、与 PLR(AUC=0.715,敏感性=78.57%,特异性=63.75%)、NLR(AUC=0.833,敏感性=100%,特异性=63.75%)预测能力没有统计学差异。(2)SII 预测 HTG-AP 重症的 AUC=0.735(敏感性=65.38%,特异性=78.35%),与 PLR(AUC=0.699,敏感性=65.38%,特异性=72.68%)、NLR(AUC=0.712,敏感性=61.54%,特异性=84.02%)预测能力没有统计学差异。结论:AP患者SII值≥1719.093时,更有可能发生SAP(AUC=0.752,敏感性=76.9%,特异性=68.2%),其预测能力与CTSI评分、Marshall评分、BISAP评分、NLR相似,优于PLR和CAR。并且SII、NLR、PLR在预测胆源性胰腺炎重症方面或许更具有优势。

关键词： SEMA7A   NF-kappa-B   整合素β1   炎症   程序性细胞死亡  

摘要： 背景信号素蛋白家族的蛋白成员均在氨基末端包含一个保守的胞外SEMA结构域。其中,SEMA7A（Semaphorin 7A）是信号素家族第七类蛋白,包含了一个糖基化磷脂酰肌醇结构域,有利于其锚定在细胞膜上。SEMA7A主要通过整合素和丛蛋白等相应受体在神经系统和免疫系统中发挥重要生理作用。越来越多的文献表明,SEMA7AR148W(鼠中为Sema7aR145W)是一种功能获得性突变,同时也是进行性家族性肝内胆汁淤积症和代谢相关脂肪性肝病的危险因素之一,具有重要的研究前景。炎症免疫反应是参与胆汁淤积和脂肪性肝病发生、发展的一项重要病理过程,然而,SEMA7AR148W突变在肝脏炎症中的分子机制尚不明确。因此,进一步阐明相关的分子机制有着深远的意义。炎症免疫反应是许多生理病理过程发生与发展的分子基础,并与胆汁淤积性肝病和代谢相关脂肪性肝病密切相关。在肝脏长期慢性的炎症免疫反应条件下,会导致肝实质出现损伤。在存在同等肝脏慢性疾病条件下,甚至可能表现出较高的癌变概率。因此,对慢性炎症免疫反应分子机制的深入研究有利于探索得到新的癌症预防与治疗靶点。核因子kappa-B（Nuclear factor kappa B,NF-κB）是炎症免疫反应中重要的转录因子,在慢性肝脏疾病中发挥重要作用。NF-κB蛋白家族由p50、p52、p65（也称为Rel-A）、C-Rel和Rel-B组成。NF-κB p50主要来源于前体蛋白NF-κB p105,与p65形成异二聚体。在受到病理刺激的细胞中,NF-κB p50/p65异源二聚体从抑制性复合物中释放出来,随后立即发生磷酸化修饰。磷酸化的NF-κB p50/p65进入细胞核后与基因组DNA结合,激活下游的基因转录。其中,促炎因子TNF-α（Tumor necrosis factor-alpha）和IL-1β（Interleukin-1 beta）是NF-κB p50/p65经典通路调控的靶基因,在很大程度上参与炎症免疫反应的调控。长期慢性肝脏炎症反应的存在将影响肝细胞的正常生理活动,激发肝脏进一步发生纤维化与肝硬化,甚至最终发生癌变。程序性细胞死亡（细胞凋亡、细胞焦亡、坏死性凋亡、铁死亡以及自噬）参与多细胞生物组织稳态的正常发育和维持,能够消除受损、感染或衰老的细胞。凋亡激活途径包括内源性的线粒体途径和外源性死亡受体途径,焦亡激活途径则主要依赖于NLRP3炎症小体途径。其中,细胞凋亡外源性死亡受体途径与TNF-α密切相关,而细胞焦亡NLRP3炎症小体途径中,NLRP3的蛋白表达水平与NF-κB p65信号通路密切相关。目的（1）探讨SEMA7AR148W突变和SEMA7AWT高表达这两种情况在肝脏炎症和原发性肝癌中可能存在的分子机制。（2）探讨SEMA7AR148W突变与程序性细胞死亡之间的关联。方法（1）设计并构建Sema7aR145W杂合/纯合突变工具小鼠（基因背景为C57BL/6J）,用来验证该突变在肝脏炎症免疫反应中的具体作用及相应分子机制。（2）构建二乙基亚硝胺（DEN）/四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠原发性肝癌疾病模型,用来探讨SEMA7A蛋白在该模型中可能存在的病理作用。（3）采用苏木精-伊红（H&E）染色实验来评估Sema7aR145W纯合突变小鼠和野生型小鼠肝脏组织中炎症免疫细胞的浸润水平。（4）免疫荧光（IF）实验检测NF-κB p65 Ser529的磷酸化水平及细胞定位。（5）采用实时定量逆转录聚合酶链反应（Real-Time q RT-PCR）实验与Western blotting实验评估经典NF-κB通路相关蛋白和促炎因子的表达水平。（6）构建相应的质粒,采用免疫共沉淀（co-IP）实验检测整合素β1与NF-κB p105的蛋白-蛋白相互作用。（7）使用划痕实验和细胞计数试剂盒（CCK-8）实验分析SEMA7AWT过表达对人肝癌Hep G2细胞迁移率和增殖率的影响。（8）采用TUNEL凋亡染色实验来评估Sema7aR145W杂合与纯合突变小鼠和野生型小鼠肝脏组织中细胞凋亡的水平。（9）采用Western blotting实验和Real-Time q RT-PCR实验来评估Sema7aR145W杂合与纯合突变小鼠和野生型小鼠肝脏组织或原代肝细胞中程序性细胞死亡相关蛋白的表达水平。结果（1）与野生型小鼠组相比,Sema7aR145W纯合突变小鼠肝脏组织的炎症免疫细胞浸润明显增加,TNF-α、IL-1β蛋白的表达均显著升高,NF-κB p50/p65信号通路相关蛋白磷酸化水平上调。上述结果提示,Sema7aR145W/SEMA7AR148W功能获得性突变可能通过NF-κB p50/p65经典信号通路促进肝脏炎症的发生。（2）免疫共沉淀实验以及细胞实验结果显示,整合素β1与NF-κB p

关键词： 高血压脑出血   全身炎症指标   中性粒细胞-淋巴细胞比值   炎症标志物   预后  

摘要： 目的:高血压脑出血(HICH)是神经外科比较常见的急重症,作为发病、致死、致残率较高的疾病,虽然目前在治疗HICH的临床手段上有了很大改善,但仍未能从根本上明显改善HICH患者的预后及其高致死、致残率的结局。因此临床上亟待寻找更多影响HICH患者预后的独立危险因素,建立更加完善、全面的综合治疗模式和预后预测体系,以改善HICH患者的总体预后。方法:收集2020年6月至2022年5月我院神经外科收治的254名符合高血压脑出血诊断患者的临床资料,并进行发病90天后的随访。以临床上通用的m RS评分对HICH患者预后进行评分。通过对收集的患者临床资料进行单因素和多因素分析,以确定可能影响预后和死亡的相关因素,并进行二元Logistic回归建立预后和死亡的预测模型,以确定全身炎症指标的加入能否提高原有预测模型的预测效果。结果:在预后良好-预后不良分组中,经多因素回归分析HICH患者90天预后不良的独立风险因素有高白细胞计数、高中性粒细胞计数、低淋巴细胞计数、高单核细胞计数、高NLR、高MLR、高PLR、高SIRI。以ROC曲线进行分析时,在纳入“NLR”这一变量后,NLR组预后模型曲线下面积(AUC)>对照组模型AUC(P<0.05)。在存活-死亡分组中,经多因素回归分析HICH患者90天死亡结局的独立风险因素有高白细胞计数、高中性粒细胞计数。未发现纳入炎症指标后预测模型的AUC明显增加。在90天时存活患者的预后良好-预后不良分组中,经多因素回归分析90天时存活的HICH患者预后不良的独立风险因素有高中性粒细胞计数、低淋巴细胞计数、高NLR、高MLR、高PLR、高SIRI。纳入“NLR”这一变量后,NLR组预后模型AUC>对照组模型AUC(P<0.05)。结论:NLR等全身炎症指标对于HICH患者的预后有一定的预测价值,除白细胞和中性粒细胞计数外,多数指标的预测价值可能集中于存活患者的预后。综合来看NLR可能是其中预测HICH患者的预后价值较高的指标,并且在预测HICH患者的预后时,将其纳入回归分析参与构成预测模型后,可以显著改善预测模型的预测效果因而具有一定的临床应用价值。

关键词： 养血泄浊汤   肾性贫血   微炎症状态   临床观察  

摘要： 目的:客观评价养血泄浊汤治疗肾性贫血(脾肾亏虚、浊毒中阻证)的临床疗效及安全性,并分析血红蛋白与微炎症状态的相关性,为中医药肾性贫血治疗提供临床依据及思路。方法:将66例符合纳入标准的患者随机分为对照组33例及试验组33例,对照组采用常规基础治疗,试验组在对照组治疗基础上加用养血泄浊汤,两组均进行8周的临床观察。评价两组患者治疗前后的贫血指标(RBC、Hb、HCT)、铁代谢指标(SF、TSAT)、微炎症指标(CRP、TNF-α)、肾功能指标(Scr、BUN)、中医证候积分等的变化情况,并对血红蛋白与微炎症指标进行直线相关性分析。结果:(1)临床综合疗效:试验组和对照组的临床综合疗效总有效率分别为87.09%、63.33%,试验组临床综合疗效优于对照组(P<0.05)。(2)中医证候疗效:试验组总有效率90.32%,对照组总有效率66.67%,试验组中医证候疗效优对照组(P<0.05)。(3)RBC、Hb、HCT:8周治疗后两组患者的RBC、Hb、HCT水平均高于治疗前(P<0.01),试验组RBC、Hb、HCT水平升高优于对照组(P<0.05)。(4)SF、TSAT:治疗后试验组与对照组SF、TSAT水平较治疗前有差异(P<0.01),且试验组SF、TSAT上升幅度优于对照组(P<0.05)。(5)CRP、TNF-α:试验组的CRP、TNF-α经治疗后降低明显(P<0.01),而对照组治疗前后差异无统计学意义(P>0.05),试验组的CRP治疗效果显著优于对照组(P<0.01)、TNF-α优于对照组(P<0.05)。(6)BUN、Scr:治疗后试验组与对照组均能降低BUN、Scr水平(P<0.05),试验组降低BUN、Scr水平上优于对照组(P<0.05)。(7)Hb与CRP、TNF-α相关性分析:试验组Hb与CRP、TNF-α存在直线负相关关联性(P<0.05),对照组Hb与CRP、TNF-α也均存在直线负相关关联性(P<0.05)。(8)安全性:两组患者的生命体征、尿便常规、肝功能、心电图在治疗前后未出现异常改变。结论:养血泄浊汤较单用常规基础治疗能更好的提高肾性贫血临床治疗有效率,并调节铁代谢、改善微炎症、保护肾功能,且可靠安全。血红蛋白与微炎症指标存在直线负相关关联性,也提示养血泄浊汤治疗肾性贫血的作用机制与降低CRP、TNF-α水平,纠正微炎症状态相关。

关键词： 鼠伤寒沙门菌性肠炎   全身炎症反应综合征   临床特征   儿童患者  

摘要： 【目的】　　通过对东莞地区的小儿鼠伤寒沙门菌肠炎临床特点和鼠伤寒沙门菌肠炎合并全身炎症反应综合征的特点因素进行剖析，以增加人们对该病症的了解程度，对临床检查与处理方法进行指导。　　【方法】　　选择在东莞市儿童医院电子病历系统及病案室及电话回访中搜集到的2018年01月~2022年7月期间就诊于东莞市儿童医院的125例鼠伤寒沙门菌性肠炎患儿为研究对象，对其临床特征加以研究。对比一般性肠炎与肠炎合并全身炎症反应综合征患者二组的差异特点，使用了统计学软件SPSS26来完成的数据分析，对正态分布的二组间比较使用t检验，对计数资料组的比较使用χ2检验，通过Logistic回归的单因素分析肠炎合并全身炎症反应综合征的相关特点差异，对具有统计学价值的再加以多因素线性回归分析，通过结果找出相关危险因素。　　【结果】　　1.儿童鼠伤寒沙门氏菌肠炎临床特征：125例鼠伤寒沙门氏菌肠炎患儿当中，男女比例为0.92:1，60例男性（48%），65例女性（52%）。这些患儿年龄段介乎于1月~12岁，年龄中位数为12月龄。≤6月龄18例（14.4%），6月~12月龄51例（40.8%），12月~36月龄46例（36.8%）,36月~72月龄6例（4.8%），＞72月龄4例（3.2%）。夏季和秋季为该病流行季节。大便性状多变，粘液稀便所占比例最高，其次为便中带血及水样便。116例（92.8%）患儿有发热。此外，相关症状还包括呕吐43例（34.4%）、惊厥7例（5.6%）、腹痛11例（8.8%）、咳嗽17例（13.6%）。38.4%的儿童血白细胞数增高，主要以中性粒细胞比例的增高为主，8%血白细胞数减少。24%的患儿贫血，22.4%的患儿血小板升高。粪便常规中，84.0%检出白细胞，26.4%检出脓细胞，44%检出红细胞。90.4%的患者C-反应蛋白升高（＞10g/L），43.2%患者降钙素原增加（＞0.5ng/ml）。腹部彩超检查中，63例提示结肠炎声像，4例提示小肠炎声像，1例提示肠套叠声像，2例同时提示有小肠炎及结肠炎声像，其余的55例无异常声像。住院期间99.2%（124/125）有静脉使用抗生素，种类共6种，疗程大多在5天~10天。住院时间范围在3天~28天，中位数7天。所有患儿均治疗好转后出院，未发生死亡。　　2.儿童鼠伤寒沙门氏菌肠炎合并全身炎症反应综合征的特点因素：将观察组和对照组相互比较，研究结果表明腹泻时间、血清C反应蛋白、降钙素原差异有统计价值（均为P＜0.05）。多因素Logistic回归分析结论：年龄≤1岁（P=0.006;OR=0.152;95%CI=0.400~0.575）、HGB降低（P=0.016;OR=0.936;95%CI=0.887~0.988）、牛奶蛋白质过敏（P=0.013;OR=0.232;95%CI=0.073~0.736）、起病三天内未应用抗生素（P=0.009;OR=4.447;95%CI=1.443~13.860）是肠炎合并全身炎症反应综合征的危险因素。　　【结论】　　东莞地区鼠伤寒沙门菌肠炎儿童发病年龄段主要为7月~36月龄。每年高发季节为夏、秋两季。发热、腹泻、呕吐、腹痛为主要的临床表现，呈典型的细菌性肠炎症状，惊厥、咳嗽在部分患儿当中可见。化验检测方面，血常规示白细胞数正常或增高，大便常规最常检出白细胞、脓细胞和部分红细胞。消化道外的其他系统较少累及。血清C反应蛋白、降钙素原多见升高，升高程度与病情严重程度呈相关性，在疾病早期对判断病情有较大帮助。影像学检查方面，胃肠道彩超可有结肠炎、小肠炎声像，可出现肠套叠。　　儿童年龄小于1岁、血红蛋白浓度降低、牛奶蛋白质过敏、起病三天内未应用抗生素，这4个因素为鼠伤寒沙门菌肠炎合并全身炎症反应综合征的危险因素。对于具有上述特征的患儿在临床诊疗过程中应警惕病情进行性加重可能，在检查和治疗上采取更积极的措施。

关键词： 奶牛   miRNA   热应激   炎症反应   细胞凋亡  

摘要： 随着全球气候变暖趋势的加剧，夏季热应激发生的强度和频率也在不断增加，高温环境对奶牛健康和奶业生产造成的影响也越来越严重。本课题组的前期研究表明，在热应激和非热应激奶牛乳腺组织中，以bta-let-7c为代表的miRNA存在着显著的差异表达，并有可能是通过相关的靶基因发挥其调控功能，但具体的作用机制尚不完全清楚。　　本试验通过构建奶牛乳腺上皮细胞热应激模型，探讨miRNA-bta-let-7c在热应激模型中对细胞炎症和凋亡的影响。首先，以细胞活力和热应激标志物HSP-70、HSF-1mRNA的表达作为热应激模型的判断指标，确立最佳的热应激模型条件;随后，分别将miRNA-bta-let-7c干扰和过表达，在细胞热应激模型中利用RT-qPCR检测凋亡相关基因和炎性因子表达，ELISA检测炎症因子分泌，并利用流式细胞仪检测奶牛乳腺上皮细胞的凋亡率，探究bta-let-7c在热应激模型下对细胞炎症与凋亡的影响;最后，根据bta-let-7c序列，通过TargetScan和miRanda进行靶基因预测，并参考靶基因功能富集分析，选取靶基因BCL-XL，通过双荧光素酶报告系统，检测bta-let-7c与靶基因结合的调控位点，利用siRNA干扰靶基因BCL-XL，探讨bta-let-7c通过靶基因对细胞凋亡与炎症的影响。　　结果显示，42℃热处理4h时，细胞活力有所下降，热应激标志物HSP-70、HSF-1mRNA表达极显著升高(P＜0.01)，miRNA-bta-let-7c表达极显著下降(P＜0.01)，同时多个炎症与凋亡相关基因表达也有显著变化，表明42℃热处理4h为适宜的热应激处理条件。将bta-let-7c干扰后进行热应激处理，促炎因子IL-1βmRNA表达极显著降低（P＜0.01），促炎因子IL-8mRNA表达显著降低（P＜0.05），抗炎因子IL-10mRNA表达显著上升（P＜0.05）,ELISA检测IL-1β、IL-8的分泌量显著降低（P＜0.05），此外，干扰bta-let-7c还使抗凋亡基因BCL-XLmRNA表达显著升高（P＜0.05），而奶牛乳腺上皮细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）;而过表达bta-let-7c后再进行热应激处理，促炎因子IL-8mRNA表达显著升高（P＜0.05），抗炎因子IL-10mRNA表达显著降低（P＜0.05），ELISA检测IL-1β、IL-8的分泌量显著升高（P＜0.05），过表达bta-let-7c还使抗凋亡基因BCL-XLmRNA表达极显著降低（P＜0.01），奶牛乳腺上皮细胞的凋亡率显著增加（P＜0.05）。因此，miRNA-bta-let-7c很可能促进了热应激条件下的细胞炎症反应，从而引发细胞凋亡，干扰bta-let-7c可以缓解热应激对细胞的损伤。双荧光素酶报告系统验证了bta-let-7c与BCL-XL的结合位点，利用siRNA干扰靶基因BCL-XL后进行热应激处理，发现促炎因子IL-8mRNA表达显著上升（P＜0.05），奶牛乳腺上皮细胞的凋亡率显著增加（P＜0.05），这与过表达bta-let-7c的结果一致，表明靶基因BCL-XL受到miRNA-bta-let-7c负调控作用，bta-let-7c在热应激模型中的促凋亡作用是通过与靶基因BCL-XL结合抑制其表达来实现。　　综上所述，42℃热处理4h，可引起奶牛乳腺上皮细胞热应激反应，并通过改变细胞炎症与凋亡相关基因表达来促进细胞凋亡与炎症反应的发生;bta-let-7c可以通过提高促炎因子IL-1β、IL-8的表达和分泌来促进细胞炎症反应，引发细胞凋亡，干扰bta-let-7c可以缓解热应激对细胞的损伤，bta-let-7c通过靶向BCL-XL抑制其表达，来实现在细胞热应激模型中的促炎和促凋亡作用。

关键词： 肺腺癌   巨噬细胞   肿瘤细胞   炎症反应   HMGB1  

摘要： 目的:肺癌是目前世界上患病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一。近几年,免疫检查点分子程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD-1）及其细胞程序性死亡-配体1（Programmed cell death protein 1,PD-L1）抑制剂在肿瘤治疗中取得重大突破,与化疗相比显著提高非小细胞肺癌患者生存率。但是长期给予anti-PD-1免疫制剂治疗会出现继发耐药,严重影响治疗效果。大量临床和实验研究发现肿瘤患者给予anti-PD-1上调肿瘤患者CD8+T细胞其它免疫检查点分子如T细胞免疫球蛋白-3（T cell immunoglobulin-3,TIM-3）表达,提示anti-PD-1上调TIM-3可能是影响其治疗效果的重要因素。有研究报道肿瘤细胞分泌高迁移率族蛋白1（High-mobility group box1,HMGB1）可以通过TIM-3诱导浸润的树突状细胞发挥免疫抑制功能。HMGB1作为TIM-3的配体,可以与CD8+T细胞表面TIM-3结合,可能抑制T细胞功能。 在吸烟诱导的肺组织炎症反应模型中,外源性分泌型HMGB1利用Toll样受体4（Toll Like Receptor 4,TLR4）激活NF-κB通路来介导肺组织炎症反应。我们团队研究发现,黄曲霉毒素通过诱导肺组织炎症反应促进肺泡上皮细胞损伤,进而参与肺腺癌发生。在此过程中,炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）依赖炎症反应上调HMGB1表达可以保护肺泡上皮细胞免受DNA损伤,提示HMGB1在肺组织中通过细胞内表达和细胞外分泌与炎症反应密切相关。我们前期研究也发现了肺腺癌炎症微环境中TNF-α可以调控HMGB1的表达和分泌。但肺腺癌组织中HMGB1作为分泌型炎症细胞因子是否上调淋巴细胞免疫检查点分子TIM-3,进而影响anti-PD-1免疫治疗效果还不清楚。 本实验采用了乌拉坦诱导小鼠肺腺癌自发肿瘤模型中,探讨TNF-α依赖炎症反应调控HMGB1对anti-PD-1免疫治疗的影响。本研究预提示通过TNF-α依赖炎症反应上调HMGB1诱导T细胞表达TIM-3等免疫检查点分子影响anti-PD-1耐药机制,进而阐明anti-TNF-α/HMGB1联合治疗改善anti-PD-1肺腺癌耐药免疫治疗新策略。 方法: 1.采取乌拉坦诱导肺腺癌自发肿瘤的小鼠模型:实验小鼠按照体重1g/kg的剂量,通过腹腔注射乌拉坦溶液200μl,每周1次连续注射8周,停止注射。小鼠继续饲养5个月后,分3组分别腹腔注射TNF-α受体抗体（益赛普）,anti-mouse PD-1,TNF-α受体抗体（益赛普）+anti-mouse PD-1,每周3次,连续腹腔注射4周后处死动物,通过肿瘤计数,采用反转录聚合酶链反应Real-time PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）,HE染色,免疫组织化学方法探讨在肿瘤治疗中肺肿瘤负荷以及TNF-α炎症通路对HMGB1和TIM-3的影响。 2.采用乌拉坦诱导肺腺癌自发肿瘤小鼠模型:实验小鼠按照体重1g/kg的剂量,通过腹腔注射乌拉坦溶液200μl,每周1次连续腹腔注射8周。两周后,分3组分别腹腔注射HMGB1阻断剂:甘草酸（Glycyrrhizin,Gly）,Box-A,Gly+Box-A,每周3次,连续腹腔注射3周。小鼠继续饲养19周后处死动物,观察肿瘤个数或负荷的改变情况,探讨anti-HMGB1对乌拉坦诱导小鼠肺腺癌肿瘤发生的影响。 3.体外分离培养小鼠脾CD4+T细胞,给予不同细胞因子HMGB1、TNF-α和TGF-β等刺激,采用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）方法检测CD4+T细胞上TIM-3、LAG-3和PD-1等免疫检查点分子表达情况,探讨HMGB1、TNF-α和TGF-β对CD4+T细胞上TIM-3、LAG-3和PD-1等免疫检查点分子表达的影响。 结果: ***-PD-1上调TNF-α和HMGB1影响其对肺腺癌肿瘤发生的抑制作用 乌拉坦诱导小鼠肺腺癌发生中,给予anti-PD-1处理后,部分肿瘤发生继发性耐药,小鼠肺腺癌的肿瘤负荷没有变化,但是其细胞因子TNF-α和HMGB1的表达高于anti-PD-1敏感组,提示:anti-PD-1抑制肺腺癌发生继发性耐药与微环境TNF-α和HMGB1高表达密切相关。 ***-α参与小鼠肺腺癌anti-PD-1免疫治疗的继发性耐药 在通过乌拉坦诱导肺腺癌自发肿瘤的模型中,单独给anti-PD-1对肿瘤负荷没有影响,但是给予anti-PD-1和anti-TNF-α联合治疗,明显减少肺组织表面肿瘤