关键词： 颞下颌关节骨关节炎   低强度脉冲超声波   髁突软骨细胞   免疫细胞化学染色   MAPK通路  

摘要： 目的:利用促炎因子白介素-1β的致炎作用,制造大鼠髁突软骨细胞体外炎症模型,使用低强度脉冲超声波（Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS）进行治疗。治疗结束后,使用免疫细胞化学染色法检测髁突软骨细胞中Ⅱ型胶原及MAPK信号通路相关因子磷酸化的表达变化,探讨LIPUS是否通过MAPK信号通路发挥对炎性髁突软骨细胞的治疗作用,为LIPUS在临床上用于治疗颞下颌关节骨关节炎提供理论依据。方法:1.断颈处死3-4周龄SD雄性大鼠后,在无菌的条件下,取下颌骨双侧髁突软骨。采用二次酶消化法分离出髁突软骨细胞,加入完全培养基,入培养箱等待细胞贴壁,后期根据细胞状态进行传代。显微镜下观察髁突软骨细胞的生长和形态变化,并根据镜下细胞形态、甲苯胺蓝染色法、免疫细胞化学染色法进行鉴定。2.确定所提细胞为髁突软骨细胞后,取第二代细胞随机分为3组,加入浓度为0、5、10ng/ml的IL-1β处理24小时,对三组细胞进行Ⅱ型胶原与MMP-13免疫细胞化学染色,筛选出IL-1β的最佳致炎浓度,用于之后实验。3.取第二代髁突软骨细胞随机分3组:NC组（常规培养）,OA组（10ng/ml IL-1β处理24小时后常规培养）,LIPUS组（10ng/ml IL-1β处理24小时后连续6天进行LIPUS照射治疗,强度为45m W/cm2,20min/天）。最终对三组细胞内Ⅱ型胶原以及MAPK通路相关因子p38、磷酸化p38（p-p38）、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）进行免疫细胞化学染色,进而研究LIPUS对IL-1β诱导的炎性髁突软骨细胞是否有治疗作用,且这种治疗作用与MAPK信号通路是否相关。结果:1.实验一:消化髁突软骨细胞并接种后,显微镜下观察细胞贴壁后表现为“多角形”或“星形”,5-6天后细胞进入对数生长期,10天后基本长满,呈“铺路石样”表现。传代4代以后发现细胞呈“长梭形”,出现“去极化”表现。镜下显示所培养细胞的形态符合髁突软骨细胞形态学表现,甲苯胺蓝染色及免疫细胞化学染色结果证实所提取细胞为大鼠髁突软骨细胞。2.实验二染色平均积分光密度值:Ⅱ型胶原:0ng/ml组（0.020480±0.001273）,5ng/ml组（0.018668±0.002364）,10ng/ml组（0.017147±0.000522）,组间差异有统计学意义（P<0.05）。MMP-13:0ng/ml组（0.014401±0.000739）,5ng/ml组（0.015323±0.001384）,10ng/ml组（0.016837±0.000597）,组间差异有统计学意义（P<0.05）。3.实验三染色平均积分光密度值:Ⅱ型胶原:NC组（0.017428±0.000773）,OA组（0.015904±0.000793）,LIPUS组（0.016623±0.000797）,组间差异有统计学意义（P<0.05）。ERK1/2:NC组（0.001244±0.000123）,OA组（0.001301±0.000169）,LIPUS组（0.001337±0.000102）,组间差异无统计学意义（P>0.05）。p-ERK1/2:NC组（0.009986±0.002893）,OA组（0.012852±0.000717）,LIPUS组（0.011528±0.000370）,组间差异有统计学意义（P<0.05）。p38:NC组（0.002509±0.000269）,OA组（0.002457±0.000376）,LIPUS组（0.002655±0.000360）,组间差异无统计学意义（P>0.05）。p-p38:NC组（0.009906±0.000636）,OA组（0.011470±0.000701）,LIPUS组（0.010973±0.000603）,组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.使用二次酶消化法在体外成功分离、培养出活性较好、增殖活力强的髁突软骨细胞,4代后细胞出现“去极化”表现。2.10ng/ml的IL-1β是本次实验筛选出的最佳致炎浓度。***治疗炎性髁突软骨细胞后减少了Ⅱ型胶原的降解,抑制了MAPK通路相关因子p38、ERK1/2的磷酸化,提示LIPUS可能通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制髁突软骨细胞细胞外基质的降解,并通过该通路发挥对颞下颌关节关节软骨的治疗作用,为临床上用LIPUS治疗颞下颌关节骨关节炎提供理论依据。

关键词： 血液透析   全身炎症反应指数   心血管事件   全因死亡  

摘要： 目的：　　心血管疾病（cardiovasculardisease，CVD）是血液透析（Hemodialysis，HD）患者主要死亡原因。现有研究表明，微炎症是终末期肾病（End-stagerenaldisease，ESRD）患者普遍存在的状态，同时是造成ESRD患者心血管事件及死亡的重要原因。一种基于中性粒细胞、单核细胞与淋巴细胞比值的新型炎症指标--全身炎症反应指数（Systemicinflammationresponseindex，SIRI）,被证明与微炎症以及多种疾病预后相关。目前尚未有相关研究证实SIRI与HD患者心血管事件及全因死亡的关系。本文旨在探索SIRI与HD患者心血管事件及全因死亡的预后关系。　　方法：　　选取截至2019年1月1日于东莞东华医院血液净化中心规律血液透析的患者，随访至2021年12月31日，或达研究终点（心血管事件及全因死亡），或转肾移植，或转腹膜透析，或转其它血液透析中心。采用东莞东华医院病历系统及检验系统收集患者临床相关数据。根据SIRI中位数1.51水平将患者分为低SIRI组和高SIRI组，比较两组患者的基线特征。Spearman双变量分析SIRI与各研究因素的相关性。Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析。单因素及多因素Cox风险比例模型分析HD患者心血管疾病及全因死亡的危险因素。绘制ROC（Receiveropratingcharacteristiccure）曲线比较SIRI、单核细胞与淋巴细胞比值（Monocyte-to-lymphocyteratio，MLR）、中性粒细胞与淋巴细胞比值（Neutrophil-to-lymphocyteratio，NLR）对患者心血管事件及全因死亡的预测价值。双侧统计学标准P值＜0.05有统计学意义。　　结果：　　1.两组间的性别、白细胞计数、血小板计数、中心粒细胞计数、单核细胞计数、血清铁、C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、MLR、NLR的差异均有统计学意义。　　***与白细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、CRP等指标呈正相关，而与淋巴细胞计数、血清铁、白蛋白呈负相关关系。　　3.高SIRI组心血管事件发生率及全因死亡率明显高于低SIRI组。　　4.高SIRI水平是HD患者心血管事件及全因死亡的独立危险因素。　　***在心血管事件及全因死亡的ROC曲线下面积与MLR、NLR相当。　　结论：　　高SIRI水平与HD患者心血管事件及全因死亡风险增加有关，是HD患者心血管事件及全因死亡的独立危险因素。

关键词： 抗菌肽   马盖宁Ⅱ   肠出血性大肠杆菌(EHEC)   肠道炎症   肠道菌群  

摘要： O157:H7是一种肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)菌株，作为食源性病原体可导致畜禽与人类(Homo sapiens)患病。马盖宁(magainins)是具有抗菌和抗肿瘤特性的阳离子肽，对革兰氏阴性和阳性菌具有抗菌活性。本研究旨在明确蛙(Xenopus laevis)源抗菌肽MagaininⅡ对EHEC O157:H7攻毒小鼠(Mus musculus)的肠道炎症及微生物区系的影响。以体重接近的C57/BL6雄性小鼠40只为受试对象，随机分为4组(每组10只)：CK组，O157组，MagⅡ组，O157+MagⅡ组。在相同基础日粮条件下，分别在1、5和9 d对O157组和O157+MagⅡ组以0.1 mL O157菌液(浓度为106CFU/mL)灌胃，CK组和MagⅡ组灌胃相同体积的PBS溶液；1 h后，MagⅡ组和O157+MagⅡ组按照5 mg/kg体重，于腹腔注射0.25 mL MagaininⅡ溶液，CK组和O157组注射相应体积的无菌生理盐水；10 d后安乐处死全部受试小鼠，采集相应组织样本进行检测。结果表明，MagaininⅡ单独处理对小鼠血清炎性细胞因子浓度和空肠炎性细胞因子、屏障功能相关基因表达均无影响；EHEC O157:H7处理导致小鼠空肠白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)基因表达水平及血清IL-1β、IL-6、TNF-α浓度显著升高(P<0.05)，血清IL-10水平显著降低(P<0.05)，空肠紧密连接蛋白claudin-1、黏蛋白-1(mucin-1, MUC-1)、MUC-2的表达水平显著降低(P<0.05);MagaininⅡ处理可显著改善EHEC O157:H7导致的IL-1β、IL-6、TNF-α、claudin-1、MUC-1、MUC-2基因表达及血清IL-1β、IL-6、IL-10浓度的异常(P<0.05)。另外，本研究通过16S rDNA测序来分析MagaininⅡ干预引起的肠道微生物变化。测序结果显示，在属水平上，O157组中普氏菌属(Prevotella)和拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度显著升高(P<0.05),O157+MagⅡ组拟杆菌属相对丰度降低(P<0.05)，即EHEC O157:H7攻毒后与炎症发展相关的普氏菌属和拟杆菌属丰度显著增加，MagaininⅡ处理使不利菌属拟杆菌属丰度显著下降，提示MagaininⅡ可维持肠道屏障和缓解炎症水平，从而在EHEC O157:H7诱导的小鼠肠道损伤中发挥保护作用，肠道群菌的变化可能是MagaininⅡ保护肠道损伤的相关因素。综上所述，MagaininⅡ可作为潜在药物用于治疗EHEC O157:H7引起的肠道疾病。

关键词： 非肌层浸润性膀胱癌   纤维蛋白原   全身免疫炎症指数   预后   列线图  

摘要： 背景：膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤之一,大约75%的膀胱癌患者为非肌层浸润性膀胱癌(Non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)。目前NMIBC的标准治疗方案是经尿道膀胱肿瘤切除术(Transurethral resection of bladder tumor,TURBT)联合术后膀胱内灌注化疗,但是术后肿瘤复发和进展的风险依然很高。因此,寻找有效的预后预测指标对NMIBC具有重要的临床价值。近年来,全身炎症反应和高凝状态已被证实与许多恶性肿瘤的发生、发展及转移密切相关。纤维蛋白原%Fibrinogen&除了在凝血途径中的重要作用外,还参与机体炎症和癌症的进展。全身免疫炎症指数(Systemic Immuneinflammatory Index,SII)由外周血淋巴细胞、中性粒细胞和血小板计数组成,是反映机体局部免疫反应和全身炎症的指标。术前血浆纤维蛋白原和SII已被证实在多种肿瘤的预后中具有较高的预测价值。然而,有关术前血浆纤维蛋白原和SII对NMIBC患者的预后价值的研究很少,两者联合应用能否更有效预测NMIBC患者的预后尚无报道。目的：本研究旨在探讨术前血浆纤维蛋白原和SII与NMIBC的临床病理特征及预后的相关性,并建立NMIBC患者术后无复发生存期(RFS)的列线图预测模型,为NMIBC患者的预后评估提供新的生物标记物。方法：回顾性分析在我院首次接受TURBT的152例NMIBC患者的临床资料。利用受试者工作特征(ROC)曲线获得术前血浆纤维蛋白原水平、SII的最佳分界值,将患者各分为高低两组。采用Pearson c2法分析术前血浆纤维蛋白原和SII与NMIBC患者临床病理特征之间的相关性。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,以Log-rank检验进行组间比较。通过Cox回归模型分析NMIBC患者术后肿瘤复发的危险因素,利用R软件构建预测NMIBC患者术后1年、3年、5年RFS的列线图(nomogram)。通过一致性指数(C-index)和时间依赖性受试者工作特征曲线(ROC)评价模型的区分度,校准曲线评价模型的校准度。结果：1.通过ROC曲线确定纤维蛋白原和SII的最佳分界值分别是3.01g/L和425。与低纤维蛋白原组相比,高纤维蛋白原组患者肿瘤组织学分级更高、术后灌注化疗的患者更多,差异具有统计学意义(P<0.05);与低SII组相比,高SII组患者肿瘤直径更大、病理T1分期更多、组织学分级更高,差异具有统计学意义(P<0.05)。术前血浆纤维蛋白原和SII两者呈正相关(r=0.319,P<0.001)。***-Meier生存分析结果表明:低纤维蛋白原组患者的RFS优于高纤维蛋白原组;低SII组患者的RFS优于高SII组。单因素Cox回归分析结果显示:纤维蛋白原、SII、肿瘤大小、肿瘤数量、组织学分级、病理T分期是影响患者术后肿瘤复发的因素。多因素Cox回归分析结果显示:纤维蛋白原(HR=2.596,95%CI:1.474-4.575,P=0.001)、SII(HR=2.237,95%CI:1.292-3.875,P=0.004)、肿瘤数量(HR=2.138,95%CI:1.254-3.644,P=0.005)、组织学分级(HR=2.595,95%CI:1.537-4.379,P<0.001)、病理T分期(HR=2.422,95%CI:1.439-4.078,P=0.001)是影响NMIBC患者术后肿瘤复发的独立危险因素。3.根据术前血浆纤维蛋白原水平和SII的高低将患者分为三组:0分组(纤维蛋白原<3.01g/L和SII<425),1分组(纤维蛋白原≥3.01g/L或者SII≥425);2分组(纤维蛋白原≥3.01g/L和SII≥425)。Kaplan-Meier生存分析表明,评分越高,NMIBC患者的RFS越差(P<0.001)。多因素Cox回归分析发现评分分组是NMIBC患者术后RFS的独立危险因素,评分为1分组患者术后出现肿瘤复发的风险是0分组的2.632倍(HR=2.632,95%CI:1.222-5.667,P=0.013),评分为2分组患者术后出现肿瘤复发的风险是0分组的5.994倍(HR=5.994,95%CI:2.685-13.158,P<0.001)。4.基于多因素Cox回归分析结果,本研究纳入了纤维蛋白原、SII、肿瘤数量、组织学分级、病理T分期等独立预后危险因素,并构建了NMIBC患者术后RFS的列线图预测模型。列线图的C指数为0.776(95%CI:0.713-0.839),模型1年、3年、5年ROC曲线下的面积分别为0.747、0.841和0.830,表明模型的区分度较好。校准曲线显示1年、3年、5年RFS的预测值与实际观测值

关键词： 原发性胃肠道弥漫性大B细胞淋巴瘤   全身炎症反应指数   国家综合癌症网络-国际预后指数   预后标志物  

摘要： 背景:全身炎症反应指数(SIRI)是一种新的炎症标志,被认为是各种恶性肿瘤的不良预后指标。然而,SIRI与原发性胃肠道弥漫性大B细胞淋巴瘤(PGI-DLBCL)之间的关联尚未确定。我们的研究旨在评估SIRI在接受基于R-CHOP/CHOP的治疗的PGI-DLBCL患者中的预后价值,并与国家综合癌症网络-国际预后指数(NCCN-IPI)评分相比,建立一个具有高度区分性的风险预测模型。方法:本次回顾性分析纳入2011年1月至2022年2月期间新诊断的153例PGI-DLBCL患者(86例胃DLBCL和67例肠道DLBCL)作为研究对象,并将他们随机分配为训练队列(n=102)和验证队列(n=51)两组。SIRI是通过免疫化疗开始前最后≤3天收集的外周血中性粒细胞(N)、单核细胞(M)和淋巴细胞(L)计数来计算:SIRI=N × M/L。统计分析各种炎症指标与患者预后的关联,并基于受试者操作特征(ROC)曲线分析获得炎症指标的最佳阈值。本研究采用多变量Cox回归分析和对数秩检验来筛选与主要终点总生存期(OS)和次要终点无进展生存期(PFS)相关的预后因素,并根据筛选的预后因素建立预后模型。结果:本研究共纳入153例患者,其中胃DLBCL患者86例,肠道DLBCL患者67例,中位年龄56岁(18-84岁)。男性86人(56.2%),女性67人(43.8%)。中位随访时间为32.0个月(95%CI:24.8-39.2),范围为2至120个月。共有45名患者(29.3%)在初始评估时出现B症状,110名(71.9%)患者患有Ⅲ或Ⅳ期疾病,37名(24.2%)患者表现出大于一处结外受累。Cox回归分析发现三个对 OS 不利的预后因素:SIRI≥1.34(HR:14.147,95%CI:1.368-146.292;P=0.026),B 症状(HR:18.789,95%CI:4.363-80.911;P=0.000),LDH>ULN(HR:6.754,95%CI:1.607-28.397;P=0.009)。同时,SIRI≥1.34(HR:2.811,95%CI:1.002-6.072;P=0.050),B 症状(HR:2.881,95%CI:1.321-6.280;P=0.008)和 LDH>ULN(HR:2.452,95%CI:1.028-5.850;P=0.043)也是 PFS的不良预后指标。多变量分析的结果表明,根据OS和PFS,SIRI是独立的预后因素。基于OS的多变量分析,将LDH水平(>ULN)的β系数与SIRI≥1.34的β系数相比得出,SIRI≥1.34的患者作为预后因素被分配2分。当我们将NCCN-IPI评分与SIRI结合时,这建立了一个最高10分的综合评分模型(SIRJ-PI)。因此,基于该患者训练集群体的OS,NCCN-IPI加SIRI的预后鉴别能力优于单独的 NCCN-IPI(AUC:0.916vs0.835,C 指数:0.912vs0.836)。在验证队列,SIRI-PI也优于NCCN-IPI评分,具有更高的AUC值(0.814vs0.898)和C指数(0.845vs0.766)。此外,SIRI-PI对疗效评估也显示出良好的判别力。同样,这种新模型能够识别化疗后有发生严重胃肠道并发症风险的患者(AUC:0.802)。结论:这项回顾性队列分析的结果表明,治疗前的SIRI水平是一个有效且独立的预后指标,可能在未来PGI-DLBCL临床实践中可以识别潜在的预后不良患者。

关键词： 脑缺血/再灌注损伤   细胞间缝隙连接通讯   免疫炎症反应   调节性T细胞  

摘要： 脑缺血/再灌注后各种免疫细胞及其相关炎症介质通过先天性免疫和适应性免疫反应作用于病灶区,引起炎性级联反应。调节性T细胞(Treg)在脑缺血/再灌注后可发挥显著的保护作用,已有研究证实外源性注射或内源性扩增Treg细胞可有效减小脑缺血/再灌注小鼠梗死病灶,减轻神经损伤,但详细机制众说纷纭。Treg细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)及其构成的缝隙连接已被证明参与Treg细胞向靶细胞传递cAMP发挥抑制效应的过程。我们前期研究发现在中枢神经系统,星形胶质细胞上的Cx43及所构成的半通道和缝隙连接通讯,可以通过释放ATP而活化小胶质细胞释放炎性因子,导致严重的神经炎症损伤。并且,试图探索外周血Treg细胞上Cx43及缝隙连接是否有改变的相关研究获得了初步结果。为进一步探讨这一机制,我们提出假设:在脑缺血/再灌注损伤中,外周Treg细胞活化后遏制效应T细胞炎症反应是通过Cx43蛋白和缝隙连接通讯起作用,这种效应受到上游的cAMP/PKA通路调控。目前相关机制尚未见明确报道。第一部分 Treg细胞及其Cx43缝隙连接在小鼠脑缺血/再灌注后的变化情况目的:观察小鼠脑缺血/再灌注后脾脏Treg细胞的变化规律,Cx43蛋白的表达及其免疫抑制功能的变化。方法:采用C57BL/6小鼠,制备大脑中动脉阻塞(MCAO)缺血60 min后再灌注模型(Transient MCAO,tMCAO)。设假手术组(Sham)以及tMCAO术后各时间点(1d、3d、5d)观察组。通过Longa评分、转角实验、圆筒实验评估神经功能缺损,TTC染色评定小鼠脑梗死体积,流式细胞术检测脾脏Treg细胞及Cx43蛋白表达的变化,免疫荧光染色法观察Treg细胞Cx43蛋白的定位与表达。利用免疫磁珠双重选择细胞提取法分选小鼠脾脏CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-效应T细胞(Effector T cell,Teff)后进行混合共培养,细胞荧光示踪法检测缝隙连接通讯功能,CFSE染色法检测Treg细胞对Teff细胞的增殖抑制率,ELISA法检测细胞上清IL-2水平以评价Teff细胞活化情况。结果:行为学实验和TTC染色结果显示脑缺血/再灌注后1d、3d、5d各组神经功能缺损程度和脑梗死体积较假手术组有显著区别(P<0.05),1d、3d、5d各组之间比较无差异(P>0.05)。流式细胞术结果提示Treg/CD4+T细胞比例在各时间点均有所升高,但只有1d组差异有统计学意义(P<0.05)。Treg细胞Cx43蛋白表达在各时间点均显著升高(P<0.05),组间比较无差异(P>0.05)。免疫荧光染色结果显示各组Treg细胞表面Cx43荧光强度较假手术组升高(P<0.01),各组组间无显著区别(P>0.05),相邻Treg细胞间可观察到缝隙连接斑。Treg细胞与Teff细胞体外共培养后细胞间缝隙连接通讯功能在各时间点均有所增强,但只有1d时增强最为明显(P<0.001),3d和5d组较1d组有所下降(P3d<0.05,P5d<0.01)。增殖抑制试验结果提示1:1混合培养时,1d组Treg细胞对Teff细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.01),而3d、5d组抑制率较假手术组无显著差异(P>0.05)。与假手术组相比,各组Teff细胞均被Treg抑制细胞活化,细胞上清IL-2水平显著下降(P<0.01)。结论:脑缺血/再灌注损伤后小鼠脾脏Treg细胞活化,Treg细胞Cx43蛋白表达上调,缝隙连接通讯开放,Treg细胞对Teff细胞的免疫抑制作用增强。第二部分 脑缺血/再灌注后缝隙连接通讯在Treg细胞免疫抑制功能中的作用目的:探讨小鼠脑缺血/再灌注后Cx43构成的胞间缝隙连接通讯在Treg细胞免疫抑制功能中的作用。方法:制备C57BL/6小鼠tMCAO模型,脑缺血/再灌注后1天,免疫磁珠双重选择法分选小鼠脾脏Treg细胞和Teff细胞进行共培养。设对照组(Control)、溶剂组(Vehicle)、Cx43模拟肽Gap27处理组(Gap27)、Gap27和外源性cAMP处理组(Gap27+cAMP)以及Transwell小室分隔Treg细胞和Teff细胞培养组(Transwell)。CFSE染色法检测Treg细胞对Teff细胞的增殖抑制率,ELISA法测定细胞上清IL-2水平以评估Teff细胞活化情况,细胞荧光示踪法检测缝隙连接通讯功能。流式分选法分选共培养悬液中的Teff细胞,ELISA法检测Teff细胞胞内cAMP含量,评价Treg细胞向Teff细胞传递cAMP的效率。结果:Gap27被用于抑制细胞间Cx43构成的缝隙连接。Gap27处理后Treg细胞对Teff细胞的增殖抑制作用减弱(P<0.01),Teff细胞显著活化,表现为细胞上清中IL-2含量增加(P<0.01)。

关键词： 多酚类化合物   抗炎作用   机制研究   网络药理学  

摘要： 当机体受到外界损伤时,会触发炎症反应以保护机体不被外来病原体所侵害。但是,如果继续发生炎症反应,它将对身体产生不利影响并引起各种疾病,例如非酒精性脂肪肝、阿尔茨海默氏病、溃疡性结肠炎等。天然的多酚类化合物因其能够调节免疫系统并减轻炎症反应而备受关注。本课题主要通过研究网络药理学、抗炎效果、抗炎机制,探讨多酚类化合物抗炎作用。论文主要研究内容如下:1.具有抗炎作用的多酚类化合物筛选:通过网络药理学对收集到的多酚类化合物进行抗炎作用初步筛选,根据degree值进行排序,选取排名前10的化合物进行后续实验,对上述10个化合物进行CCK-8实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验及形态学观察以筛选出细胞毒性较低的化合物,用于后续抗炎效果检测。2.多酚类化合物抗炎效果:用筛选得到的目标多酚类化合物处理RAW264.7细胞一定时间后(6 h、12 h、24 h),加入脂多糖(LPS)处理细胞12 h,使用一氧化氮检测试剂盒检测上清中NO含量的变化,使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)含量变化,确定多酚类化合物的抗炎效果。3.多酚类化合物抗炎机制:通过网络药理学分析筛选获得的目标多酚类化合物抗炎的靶点及通路,运用RT-qPCR实验及Western Blot实验检测每条通路上关键靶点mRNA表达量及蛋白表达量的变化,揭示多酚类化合物的抗炎作用机理。论文主要研究结果如下:1.具有抗炎作用多酚类化合物筛选:网络药理学筛选得到具有抗炎作用的多酚类化合物有:白藜芦醇、紫铆因、没食子酸、姜黄素、紫檀芪、丹皮酚、龙胆酸、原儿茶酸、鞣花酸及表儿茶素。根据CCK-8实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验及形态学观察实验结果显示,原儿茶酸、龙胆酸、丹皮酚对细胞毒性作用较小。综合毒性实验结果,选取原儿茶酸、龙胆酸及丹皮酚进行抗炎效果研究。2.多酚类化合物抗炎效果:原儿茶酸通过降低TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达量和NO的分泌量发挥抗炎作用;龙胆酸通过降低TNF-α、IL-1β表达量及NO分泌量发挥抗炎作用,对IL-6的表达无显著影响;丹皮酚通过降低NO分泌量和TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达量发挥抗炎作用。三种化合物都具有抗炎作用,但存在差异。3.多酚类化合物抗炎机制:通过网络药理学和实验验证证明,原儿茶酸可以降低TNFR1和TRAF2 mRNA的表达,并降低下游NF-κB信号通路关键靶点IKKα、IKKβmRNA及蛋白表达量,且降低了 NF-κB/p65的磷酸化,原儿茶酸可以通过调控TNF信号通路发挥抗炎作用:龙胆酸可以显著降低IL-17A mRNA表达量,降低TRAF6、IKKα、IKKβ mRNA及蛋白的表达量,并显著NF-κB/p65的磷酸化,龙胆酸可以通过调控IL-17信号通路发挥抗炎作用;丹皮酚可以显著降低LCK、zap70、IKKα、IKKβ mRNA及蛋白的表达量,并显著降低NF-κB/p65的磷酸化,丹皮酚可以通过调控T细胞受体信号通路发挥抗炎作用。实验结果表明,三种多酚类化合物发挥抗炎作用的靶点可能存在差异,但都是通过阻断NF-κB信号通路上游通路,来抑制NF-κB信号通路的激活,从而达到抗炎效果。以上结果说明,多酚类化合物具有良好的抗炎作用,且主要通过阻断NF-κB信号通路上游通路,来抑制 NF-κB信号通路的激活,从而达到抗炎效果。

关键词： 健脾益肾化瘀泄浊法   CAPD   动脉粥样硬化   微炎症状态  

摘要： 目的:观察健脾益肾化瘀泄浊法对CAPD患者(脾肾气虚、湿浊瘀阻型)动脉粥样硬化及微炎症状态的影响,从而探讨中医药对CAPD患者肾功能、内环境稳态的改善作用,为防治腹膜透析患者并发症、提升其生存率与生存质量提供新的方案。方法:选取来自江西省中医院肾病科门诊及住院部,2021年1月到2022年10月间的持续不卧床腹膜透析患者(证型为脾肾气虚、湿浊瘀阻型,且伴有动脉粥样硬化及微炎症状态)70例。采取信封法分组,将患者随机分为对照组35例,治疗组35例。对照组予腹膜透析、CKD一体化治疗以及阿托伐他汀钙片作为基础治疗,治疗组在对照组治疗方案的基础上加用健脾益肾化瘀泄浊方,实验周期为8周。评估两组患者治疗前后中医症候积分、肾功能指标(血肌酐、尿素氮)、微炎症指标(超敏-C反应蛋白、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α)、血脂指标(甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇)、颈动脉内膜中层厚度,并观察两组治疗后安全性指标。结果:1.本研究共有9名患者脱落及剔除,最终纳入61例进行试验,其中,对照组30例,治疗组31例。两组在性别、年龄、透析龄、原发病以及治疗前中医症状评分、肾功能指标、微炎症、血脂情况以及颈动脉内膜中层厚度等均无明显差异(P>0.05)。2.临床疗效对比:治疗组总有效率为83.87%,其中显效10例,有效9例,稳定7例,无效5例;对照组有效率为66.67%,其中显效4例,有效5例,稳定11例,无效10例。治疗组的总有效率高于对照组,且经秩和检验,P<0.05,说明治疗组可以提升临床疗效。3.中医症候积分对比:两组均能改善患者症状,而与对照组相比,除了肌肤甲错改善情况二者无明显差异(P>0.05)外,治疗组能明显改善患者气短懒言、腰膝酸软、神疲乏力、胸脘痞闷、脘腹胀满、腰痛等中医症状,降低其中医症候积分(P<0.05)。4.肾功能对比:两组均能降低患者Scr、BUN的水平(P<0.05),且治疗组Scr、BUN水平的下降幅度大于对照组(P<0.05)。5.微炎症方面:两组均可改善患者微炎症状态(P<0.05),相比之下,治疗组hs-CRP、IL-6、TNF-α的水平降低更明显(P<0.05)。6.血脂及颈动脉IMT方面:两组治疗后TC、TG、LDL-C、颈动脉IMT水平均下降(P<0.05),但治疗组TC、TG、LDL-C、颈动脉IMT水平的改善程度更显著(P<0.05)。7.安全性指标方面:治疗组患者服用健脾益肾化瘀泄浊方后未出现明显不良反应,生命体征及辅助检查未见明显异常改变,表明健脾益肾化瘀泄浊方在临床使用中具有一定的安全性。结论:健脾益肾化瘀泄浊法能改善CAPD患者动脉粥样硬化及微炎症状态,提高临床疗效,保护肾脏,延缓病程进展。