关键词:
全身性炎症反应
脂多糖
小鼠
泌乳性能
紧密连接蛋白
摘要:
哺乳动物在分娩后免疫力降低,容易感染大肠杆菌等细菌,引起乳腺炎、子宫内膜炎和阴道炎等疾病,引起全身性炎症反应,导致泌乳量下降,其中乳腺炎抑制泌乳的机理已有较为深入的研究,但对其他炎症影响泌乳的研究较少,因此本试验通过腹腔注射革兰氏阴性菌的主要毒力因子——脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),诱导泌乳初期小鼠全身性炎症反应,从泌乳相关激素、氧化抗氧化平衡和乳腺组织结构等角度结合转录组分析探究影响泌乳的途径。以2.5、5和10 mg/kg体重剂量的LPS腹腔注射诱导泌乳7 d小鼠全身性炎症反应,注射等体积生理盐水小鼠为对照,于注射6 h后采集小鼠血清检测肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)水平,采集第四区乳腺制做病理组织切片,采集心、肝、脾、肺和肾等内脏器官称重并计算器官指数。记录泌乳4~17 d的母鼠体重、采食量和仔鼠窝重,计算每小时泌乳量和泌乳总量。结合炎症反应程度和对乳腺的影响选择适宜的诱导剂量。结果发现,5 mg/kg体重剂量的LPS诱导小鼠明显的炎症症状,脾指数和肺指数升高,血清促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达升高,泌乳量降低,因此以5 mg/kg体重LPS为适宜剂量进行下一步研究。LPS剂量选择过程中发现小鼠采食急剧减少,而泌乳量与采食量关系密切,所以另设置采食干预组以更精确研究炎症的直接作用,将小鼠分为三组:炎症组(IG),腹腔注射5 mg/kg体重的LPS,自由采食;对照组(CG),腹腔注射生理盐水,自由采食;营养限制组(RG),腹腔注射生理盐水,限制饲喂量(炎症组小鼠采食水平),分别于处理后6 h、24 h和10 d采集样品。记录泌乳4~17 d的母鼠体重、采食量和仔鼠窝重,计算每小时泌乳量和泌乳总量分析对泌乳性能的影响。采集血清检测TNF-α、IL-1β、IL-6和hs-CRP等炎症相关因子水平,催乳素(Prolactin,PRL)和生长激素(Growth hormone,GH)等泌乳相关激素水平,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量等氧化抗氧化指标;采集乳腺组织,利用石蜡切片技术观察乳腺结构,利用免疫荧光技术观察乳腺紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1定位,利用Western blot技术分析紧密连接蛋白的表达;利用转录组测序技术筛选差异基因及富集通路,对差异基因用实时荧光定量PCR技术进行基因水平的验证和对差异基因显著富集的信号通路用Western blot技术进行蛋白水平的验证。结果发现,(1)泌乳性能:与CG相比,IG和RG小鼠单小时泌乳量和总泌乳量均显著降低,与RG相比,IG小鼠总泌乳量显著降低。(2)血清检测结果:与CG相比,IG和RG小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子水平显著升高;IG 6 h、IG 24 h和RG 24 h的PRL含量显著升高,GH的含量降低,RG 6 h的PRL含量升高;IG 6 h、IG 24 h和RG 24 h的SOD活性降低,MDA含量升高,RG 6 h的SOD活性降低。与RG相比,IG 6 h TNF-α和hs-CRP水平显著升高,IG 24 h TNF-α、IL-1β、IL-6和hs-CRP水平显著升高;IG 6 h和IG 24 h GH水平均显著降低,IG 24 h PRL水平显著升高;IG 6 h和IG 24 h SOD活性均极显著降低,MDA含量均极显著升高。(3)乳腺组织结构:与CG相比,IG 6 h和IG 24 h均发现大量乳腺上皮细胞脱落,腺泡腔内可见炎性细胞浸润,RG 6 h和RG 24 h均发现腺泡充盈面积缩小,无明显损害;免疫荧光结果表明,Claudin-1、ZO-1蛋白在CG和RG小鼠乳腺组织中均围绕乳腺导管呈环状均匀分布,IG呈混乱分布;Western blot结果显示,与CG和RG相比,IG 24 h的Claudin-1蛋白表达升高、ZO-1蛋白表达减少。(4)RNA-seq分析:与CG和RG相比,IG乳成分(乳蛋白、乳糖、乳脂)的合成、转运和调控相关基因显著下调,能量相关基因显著下调;筛选出差异基因显著富集通路NF-κB信号通路及雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路,Western blot验证信号通路关键蛋白,发现IG和RG的IκB蛋白磷酸化水平均显著升高;RG rp S6蛋白磷酸化水平降低。上述结果表明,LPS诱导的全身性炎症反应引起小鼠采食减少、血清PRL水平升高、GH水平降低、氧