关键词：
中性粒细胞
组织驻留记忆T细胞
抗中性粒细胞胞浆抗体
抗中性粒细胞胞浆抗体关性血管炎
血小板/中性粒细胞比值
摘要：
研究背景与目的:
抗中性粒细胞胞浆抗体（Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody,ANCA）相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis,AAV）是经典的自身免疫病,以外周血存在自身抗体ANCA,而病变组织没有明显免疫复合物沉积为显著特征,累及肾脏表现为寡免疫复合物坏死性新月体肾炎,迅速进展为终末期肾衰竭（End-stage renal disease,ESRD）。目前大量研究发现,无论是先天免疫细胞,还是获得性免疫细胞,以及补体系统,均参与了AAV的发生发展,但AAV整体的免疫景观依然不清。
中性粒细胞作为天然免疫及获得性免疫的纽带,在AAV的发病中起核心作用。有证据显示中性粒细胞胞外捕网（或陷阱）(neutrophil extracellular traps,NETs)形成暴露ANCA抗原是打破自身耐受的关键环节。NETs组分可以直接活化补体级联反应,以损伤相关的分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMP）活化炎症小体,释放细胞因子加速炎症反应;更重要的是释放自身抗原,活化抗原递呈细胞（antigen-presenting cells,APC）及T细胞、B细胞,进而产生自身抗体,从而导致自身免疫的恶性循环,针对NETs的干预已经成为颇具前景的治疗靶点。
近年来,组织器官区域性免疫已成为研究热点。组织微环境中细胞间互作、对外源信号分子的响应及胞内分子的调控网络,共同决定了组织的免疫特性。组织驻留记忆性T细胞（Tissue-resident memory T cell,TRM）长期驻留在外周器官中,是器官/组织区域性免疫的主要承担者[2,3]。TRM表达特异性趋化因子和组织归巢受体,富集并驻留于外周屏障组织及非屏障实体组织中。CD4+TRM在再次感染时可以优化与APC的相互作用,CD8+TRM主要触发抗原特异性保护防止再感染。它们均具有产生穿孔素、颗粒酶（Granzymes,GZM）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）的能力,在感染及肿瘤中发挥杀伤作用。近年来大量研究表明TRM在器官移植及多种自身免疫性疾病中发挥免疫记忆及组织损伤效应。在过敏性接触性皮炎中,TRM可招募中性粒细胞,导致局部炎症的急性发作。在AAV中,CD8+T细胞可以参与AAV血管损伤及新月体形成。但AAV患者肾组织内是否存在CD8+TRM至今尚未报道。
血小板（Platelet,PLT）在AAV中可以通过Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）-趋化因子受体（CXC-chemokine receptor,CXCL）4信号途径刺激中性粒细胞发生NETs形成,参与到AAV的发生及发展过程中。最近有许多研究报道血小板/中性粒细胞比值（Platelet neutrophil ratio,PNR）作为新型炎症指标与许多疾病的预后及活动度相关。但是PNR在AAV患者中的作用尚无研究报道。
因此,本研究首先通过外周血单细胞转录组测序（Single-cell RNA-sequencing,sc RNA-seq）了解外周血免疫细胞谱系特点,联合肾组织成像质谱流式细胞术（imaging mass cytometry,IMC）分析肾脏组织区域免疫细胞谱系及细胞邻域（cellular neighbourhood,CN）特点,为进一步针对AAV患者的免疫生态位特点进行精准的免疫治疗提供理论依据;同时,基于中性粒细胞与PLT的互作影响,本研究还探讨了PNR水平与AAV患者疾病活动度的相关性,为临床了解AAV患者的活动性及预后寻找潜在的生物标志物。
研究方法:
第一部分为了描绘AAV患者外周血的免疫细胞图谱,我们首先对4例患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）进行sc RNA-seq,采用降维聚类分析免疫细胞谱系特点;通过细胞通讯分析免疫细胞主要信号途径;拟时序分析了解细胞亚群的分化轨迹;TIPS协议进行信号通路推断。
第二部分对7例肾活检组织石蜡切片进行IMC,与临床数据进行关联性分析。同时采用一致流形近似和投影（Uniform Manifold Approximation and Projection,UMAP）分析肾脏免疫细胞谱系,通过K-最近邻分类算法划分肾组织免疫细胞及结构细胞CN,通过空间邻域分析细胞互作特点。
第三部分采用Spearman相关分析128例AAV患者PNR与疾病活动度关系,采用Kaplan-Meier生存分析比较患者累计生存率;Cox比例风险回归模型分析AAV预后影响因素。P<0.05认为差异有统计学意义。
研究结果:
第一部分
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